肉豆蔻酰化的瘦素相关肽及其用途的制作方法

本申请要求于2014年8月1日提交的美国临时申请第62/035,916号的优先权。

技术领域

本发明涉及瘦素相关肽以及，更具体地，涉及肉豆蔻酰化的(myristoylated)瘦素相关肽。

背景技术：

肥胖——被定义为相对于瘦体重的过量的体脂肪——与许多重要的临床和心理疾病有关，例如高血压、升高的血脂、和II型或非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)、及缩短的预期寿命。在美国有大约600-1000万人患有NIDDM，包括65岁以上的总人口的18％。此外，约45％患有NIDDM的男性和70％患有NIDDM的女性是肥胖的，并且他们的糖尿病通过减轻体重而得到实质改善或甚至消除。

已证明瘦素相关肽及类似物在治疗人类肥胖症及其相关功能障碍方面具有巨大的潜力。在瘦素相关的合成肽激动剂和拮抗剂的开发、涉及以及临床前应用方面所进行的努力表明，为满足大多数肥胖人类的治疗需求，瘦素在临床上的貌似失败已经加速了开发新的肽疗法的努力，所述肽疗法旨在降低这种疾病及其相关代谢功能障碍的流行比例。在这方面，小分子肽疗法具有克服重组瘦素的局限性的潜力，因为中枢神经系统(CNS)对它们的吸收并不依赖于穿过血脑屏障(BBB)的可饱和转运。在大多数人类肥胖病例中，进入CNS的缺陷转运被鉴定为瘦素抗性的起因。

例如，在瘦素缺陷的ob/ob和瘦素抗性db/db小鼠模型中，具有瘦素样活性的合成肽(如小鼠[D-Leu-4]-OB3及其类似物)显著地影响体重增加、食物和水摄入、血糖、胰岛素敏感性、以及血清骨钙素、骨转换的敏感性和特异性标记物。然而，作为人类候选药物的[D-Leu-4]-OB3及其类似物的药代动力学并不如治疗用途所需要的那样是最佳的。尤其是，[D-Leu-4]-OB3及其类似物具有短的血清半衰期和高的血浆清除率，导致[D-Leu-4]-OB3及其类似物的生物利用度降低，从而需要更高的剂量。

因此，需要开发具有改善的药代动力学的经修饰的瘦素相关肽及类似物，以提供用于治疗人类肥胖症及其相关功能障碍的有效疗法。

技术实现要素：

本发明包括肉豆蔻酸与瘦素相关肽的多肽缀合物，其相对于未缀合肉豆蔻酸的瘦素相关肽具有改善的药理作用。优选地，肉豆蔻酸缀合至瘦素相关肽的N末端。本文的多肽缀合物可通过在给药后减少体重增加、食物摄入、水消耗、和/或血糖水平来调节体重。本文中多肽缀合物也可增加骨形成。

在本发明的一个实施方案中，所述瘦素相关肽包括[D-Leu-4]-OB3，一种具有序列SCSLPQT(SEQ ID NO：1)的具有瘦素样活性的合成肽酰胺，并且所述瘦素相关肽与肉豆蔻酸缀合以形成化合物MA-[D-Leu-4]-OB3。

本文所述的药物组合物可以以比未肉豆蔻酰化的瘦素相关肽的剂量低至少4倍、甚至10倍的剂量给药。通过给予受试者治疗有效的量，缀合了肉豆蔻酸的瘦素相关肽可用于在需要其的受试者中治疗与体重的动态平衡相关的病症。例如，所治疗的病症可为肥胖症、高血糖症、高胰岛素血症、摄食过度、甲状腺功能障碍、不育或糖尿病。缀合了肉豆蔻酸的瘦素相关肽也可用于增加骨形成。例如，缀合了肉豆蔻酸的瘦素相关肽可用于治疗患有选自以下病症的受试者：营养不良、饥饿、神经性厌食症、骨质疏松症、癌症、糖尿病、结核病、慢性腹泻、AIDS和肠系膜上动脉综合征。缀合了肉豆蔻酸的瘦素相关肽可以经由皮下、腹膜内、肌肉内、口服或鼻内给药来给予。

附图说明

通过结合附图阅读以下的详细描述将更全面地理解和领会本发明，其中：

图1为本发明的缀合了肉豆蔻酸的瘦素相关肽的示意图。

图2为示出治疗前(时间0)以及向雄性Swiss Webster小鼠皮下递送0.1mg肽之后1、2、4、6、18和24小时的MA-[D-Leu-4]-OB3血清浓度的图(每个时间点n＝3只小鼠)。各数值表示平均值±SEM。误差棒包含于点中，并且误差棒范围为0.01至0.12ng/ml；

图3为示出治疗前(时间0)以及向雄性Swiss Webster小鼠腹膜内递送0.1mg肽之后1、2、4、6、18和24小时的MA-[D-Leu-4]-OB3血清浓度的图(每个时间点n＝3只小鼠)。各数值表示平均值±SEM。误差棒包含于点中，并且误差棒范围为0.01至0.12ng/ml；

图4为示出治疗前(时间0)以及向雄性Swiss Webster小鼠肌肉内递送0.1mg肽之后1、2、4、6、18和24小时的MA-[D-Leu-4]-OB3血清浓度的图(每个时间点n＝3只小鼠)。各数值表示平均值±SEM。误差棒包含于点中，并且误差棒范围为0.01至0.12ng/ml；

图5为示出治疗前(时间0)以及向雄性Swiss Webster小鼠口服递送(管饲法)0.1mg肽之后1、2、4、6、18和24小时的MA-[D-Leu-4]-OB3血清浓度的图(每个时间点n＝3只小鼠)。各数值表示平均值±SEM。误差棒包含于点中，并且误差棒范围为0.01至0.12ng/ml；

图6为示出治疗前(时间0)以及向雄性Swiss Webster小鼠鼻内滴注0.1mg肽之后1、2、4、6、18和24小时的MA-[D-Leu-4]-OB3血清浓度的图(每个时间点n＝3只小鼠)。各数值表示平均值±SEM。误差棒包含于点中，并且误差棒范围为0.01至0.12ng/ml；

图7为示出在db/db小鼠中，在于0.3％十二烷基麦芽苷中口服递送之后缀合了肉豆蔻酸的[D-Leu-4]-OB3对空腹血糖的作用的图；

图8为示出在db/db小鼠中，在于PBS中口服递送之后缀合了肉豆蔻酸的[D-Leu-4]-OB3对空腹血糖作用的图；

图9为示出在STZ诱发高血糖症的雄性Swiss Webster小鼠中，在缺乏或存在MA-[D-Leu-4]-OB3或二甲双胍的情况下，地特(detemir)胰岛素对体重增加的作用的图。各点表示平均值±SEM体重，其表达为起始体重的百分比(每组n＝6只小鼠)；以及

图10为示出在STZ诱发高血糖症的雄性Swiss Webster小鼠中，在缺乏或存在MA-[D-Leu-4]-OB3或二甲双胍的情况下，地特胰岛素对空腹血糖水平的作用的图。每根棒和垂直线表示平均值±SEM的空腹血糖(每组n＝6只小鼠)。

具体实施方式

现在参考附图，其中相同的附图标记始终表示相同的部分，由图1可见肉豆蔻酸与瘦素相关肽的缀合物，该缀合物导致优于单独的瘦素相关肽的显著改善的药代动力学特征。优选地，所述瘦素相关肽为对应于瘦素残基116-122的被称作OB3的合成肽，其中小鼠OB3具有序列SCSLPQT(SEQ ID NO：1)，人OB3具有序列SCHLPWA(SEQ ID NO：16)。

所述瘦素相关肽也可包括与对应于SCSLPQT(SEQ ID NO：1)和SCHLPWA(SEQ ID NO：16)的区域邻近或重叠的其他区域瘦素。例如，可以使用以下方案评价AVPIQKVQDDTKTLI(SEQ ID NO：2)、TKTLIKTIVTRINDI(SEQ ID NO：3)、RINDISHTQSVSAKQ(SEQ ID NO：4)、VSAKQRVTGLDFIPG(SEQ ID NO：5)、DFIPGLHPILSLSKM(SEQ ID NO：6)、SLSKMDQTLAVYQQV(SEQ ID NO：7)、VYQQVLTSLPSQNVL(SEQ ID NO：8)、SQNVLQIANDLENLR(SEQ ID NO：9)、DLLHLLAFSKSCSLP(SEQ ID NO：10)、SCSLPQTSGLQKPES(SEQ ID NO：11)、QKPESLDGVLEASLY(SEQ ID NO：12)、EASLYSTEVVALSRL(SEQ ID NO：13)、ALSRLQGSLQDILQQ(SEQ ID NO：14)或DILQQLDVSPEC(SEQ ID NO：15)。

优选地，所述瘦素相关肽包含至少一个D-取代的氨基酸。例如，对于SEQ ID NO.1，D-异构体(isoform)氨基酸可选自[D-Ser-1]、[D-Cys-2]、[D-Ser-3]、[D-Leu-4]、[D-Pro-5]、[D-Gln-6]和[D-Thr-7]；对于SEQ ID NO.16，D-异构体氨基酸可选自[D-Ser-1]、[D-Cys-2]、[D-His-3]、[D-Leu-4]、[D-Pr0-5]、[D-Trp-6]和[D-Ala-7]。

如图1所示，肉豆蔻酸与瘦素相关肽的残基的游离氨基共价连接。或者，肉豆蔻酸可与所述肽的残基的任何游离氨基缀合。例如，在人OB3肽(SEQ ID NO：16)的3位的组氨酸(H)残基除了α氨基以外，还提供额外的游离氨基。以下脂类也可用于代替肉豆蔻酸并且根据以下方案进行测试：环己基戊酰基、酰基谷氨酰基、月桂酰基、2-琥珀酰氨基肉豆蔻酸、2-琥珀酰氨基乙氧基棕榈酸、肉豆蔻酰基-α-谷氨酰基、肉豆蔻酰基-α-谷氨酰基-甘氨酰基、胆酰基(choloyl)、7-脱氧胆酰基、石胆酰基(lithocholoyl)、石胆酰基-谷氨酰基、4-苯甲酰基-苯丙氨酸、L-甲状腺素基(thyroxyl)、辛二酰基-D-甲状腺素、3，3′，5，5′-四碘甲状腺乙酰基(tetraiodothyroacetyl)、环己基戊酰基。

所要求保护的发明的合成基于已知的乙酰化方法，其中脂肪酸与蛋白质共价连接。为了选择性地酰化(例如肉豆蔻酰化)ε-氨基，在偶联过程中可使用多种保护基团以封闭α-氨基。合适的保护基团的选择是本领域技术人员已知的，它们包括p-甲氧基苯甲酰氧基-羰基(pmZ)。优选地，将ε-氨基在一步合成中酰化(例如肉豆蔻酰化)而不使用氨基保护基团。通过在碱性条件下于极性溶剂中，使活化的脂肪酸酯与蛋白质的ε-氨基反应来进行酰化(例如肉豆蔻酰化)。所述反应的碱性必须足以使瘦素类似物的所有游离氨基去质子化。在弱碱条件下，所有的游离氨基均不被去质子化，导致N-末端或α-氨基的优先酰化(例如肉豆蔻酰化)。在酰化后(例如内豆蔻酰化)，通过标准方法如反相疏水色谱法来纯化产物。此后，通过标准方法如冻干或通过结晶回收产物。

例如，在Rainin Symphony合成仪中，使用Fmoc/叔丁基策略在Rink Amide树脂上合成肽的样品。采用HCTU/DIPEA溶液使氨基酸偶联，并采用20％哌啶/DMF溶液除去Fmoc。在自动合成完成后，将肉豆蔻酸酐手动添加到肽的N-末端。使用TFA裂解混合物从树脂上切割肽。使用Maldi-Tof质谱法来核对所存在的目标质量。使用反相HPLC和C-18Waters Sunfire柱纯化所述肽。

肉豆蔻酰化的肽的药代动力学可以根据本领域的已知方法确定。例如，肉豆蔻酰化的瘦素相关肽的药代动力学可通过分析总吸收、血清半衰期和血浆清除率来确定。用于确定总吸收、血清半衰期和血浆清除率的测定是本领域已知的，并且用于以下实施例中。通过使半衰期从小于1小时延长至长达28小时(这取决于递送途径)、增加吸收、降低血浆清除速率以及使最小有效剂量减少4倍或更多，肉豆蔻酸与[D-Leu-4]-OB3的缀合显著改善了药代动力学特征。因此，本发明的肉豆蔻酰化的肽提供了优于非肉豆蔻酰化的瘦素肽的显著优势，例如，它们可以以较低剂量和较低的给药频率进行给药。尽管本发明使用SEQ ID NO：1进行测试，但是本发明方法可应用于其他瘦素相关的蛋白质，然后如下所述测试其功效。

实施例1

肉豆蔻酸与[D-Leu-4]-OB3的缀合——一种具有生物活性的瘦素相关的合成肽酰胺——显著改善了其药代动力学特征。

材料和方法

动物的圈养

从Charles River Laboratories(Troy，NY，USA)获得3至4周龄、重量为12至15g的雄性Swiss Webster小鼠。将动物每笼3只圈养于配有不锈钢丝盖和空气过滤器的聚碳酸酯笼中，并维持在Albany医学院动物资源设施的通风架(Thoren Caging Systems，Hazelton，PA，USA)上。将小鼠保持于恒温(24℃)、从07：00至19：00照明的条件下，并且允许自由进食和饮水，直至用于吸收研究。

肽的给药

MA-[D-Leu-4]-OB3作为C-末端酰胺由NeoBioLab(Cambridge，MA，USA)商业化地制备。对于SC、IP和IM递送，将肽以0.1mg/200μl的浓度溶解于无菌磷酸盐缓冲盐水中(PBS，pH 7.2)，该浓度比之前所示的在两种遗传肥胖小鼠模型中对于调节能量消耗、葡萄糖水平和胰岛素敏感性而言最佳的[D-Leu-4]-OB3浓度低10倍。对于口服和鼻内递送，将MA-[D-Leu-4]-OB3分别以0.1mg/100μl和0.1mg/10μl的浓度溶解于在无菌去离子水中复原的0.3％(Aegis Therapeutics，San Diego，CA，USA)中。在零时刻(0)，每一个时间点向三只小鼠中的每一只通过SC、IM或IP注射给予单次200μl MA-[D-Leu-4]-OB3。通过采用异氟烷(1-4％)轻微麻醉小鼠，并使用P-20移液器将10μl MA-[D-Leu-4]-OB3递送到鼻孔中来实现鼻内递送。在给予肽之后，将小鼠转移到分开的笼中以度过指定的时间段。

血液的收集和血清的制备

在肽递送之后1、2、4、6、18和24小时，采用异氟烷(5％)麻醉小鼠并通过心脏穿刺放血。将血液收集在无菌未肝素化的塑料离心管中，并使其在室温下静置1小时。采用无菌木制涂药棒将凝结的血从管壁刮下。通过在Eppendorf 5702R、A-4-38转子(Eppendorf North America，Westbury，NY，USA)中以2600×g离心30分钟而制备单个血清样品，按时间点合并，并将该样品冷冻储存直至用于测定MA-[D-Leu-4]-OB3含量。这些动物操作由Albany医学院动物管理和使用委员会批准，并且根据相关准则和规定进行。

血清MA-[D-Leu-4]-OB3的测量

使用本发明人开发且验证的竞争性ELISA来测量混合血清样品中的MA-[D-Leu-4]-OB3浓度，所述竞争性ELISA具有以下改良：将MA-[D-Leu-4]-OB3用于构建标准曲线。MA-[D-Leu-4]-OB3与用于ELISA中的[D-Leu-4]-OB3的多克隆抗体的交叉反应性为100％。将每份血清样品一式两份地进行测定。试验内和试验间的变异系数分别为0.03％和0.2％。

药代动力学分析：总吸收(AUC)

使用图形程序SigmaPlot 8.0(SPSS Science，Chicago，IL，USA)绘制在SC、IP、IM、口服或鼻内递送后MA-[D-Leu-4]-OB3的血清浓度与时间的关系图。使用该程序的函数计算每条曲线下的面积(AUC)，并表示为ng/ml/min。

药代动力学分析：血清半衰期(t_1/2)

使用以下公式，计算MA-[D-Leu-4]OB3的血清浓度降低至IP、SC、IM、口服和鼻内给药后所达到的最大浓度的恰好一半时所需要的时间：

t_1/2＝0.693/k_elim

其中k_elim表示消除常数，其通过绘制吸收曲线的β相中的每个浓度点的自然对数随时间的曲线而确定。这些图中的每一个的线性回归分析产生一条直线，其斜率代表每种递送方法的k_elim。

药代动力学分析：血浆清除率(CL)

使用以下方程式由AUC计算IP、SC、IM、口服和鼻内递送后，血浆中的MA-[D-Leu-4]-OB3的清除率：

CL＝剂量/AUC

药代动力学：表观分布容积(V_d)

由于药物的半衰期与其血浆清除率负相关，并直接与其分布容积成正比，因此在ip、sc、im和鼻内递送后，MA-[D-Leu-4]-OB3的表观分布容积使用以下方程式由其半衰期和清除率而计算：

t_1/2＝0.693×V_d/CL

结果

[D-Leu-4]-OB3的半衰期通常在1小时以内，并且生理学上有效的剂量为毫克级。考虑到[D-Leu-4]-OB3在治疗人类肥胖症和/或糖尿病方面的应用，重要的是改善[D-Leu-4]-OB3的药代动力学特征，主要是延长血清半衰期和/或降低最佳有效剂量。本文所呈现的结果表明，肉豆蔻酸与[D-Leu-4]-OB3的缀合通过以下方式显著改善了其药代动力学特征：(a)将其半衰期从小于1小时延长至长达28小时，这取决于递送途径；(b)增加其吸收；(c)降低将其从血浆中清除的速率；以及(d)使最小有效剂量降低4倍。

吸收曲线

在SC、IP、IM、口服和鼻内递送之后，MA-[D-Leu-4]OB3的吸收曲线分别示于图2-6中。在SC、IP和IM给予0.1mg肽之后，在2小时时(t_max)出现MA-[D-Leu-4]-OB3的最大吸收(C_max)，然后随时间快速降低。在18小时后，血清中MA-[D-Leu-4]-OB3的浓度降低至接近基线的水平(图2-4)。在口服和鼻内给药之后，吸收曲线与SC、IP、和IM递送后所观察到的吸收曲线明显不同。口服和鼻内给药之后，分别在4小时和6小时时达到MA-[D-Leu-4]-OB3的C_max。然而，在口服和鼻内给药24小时之后，C_max分别降低31％和80％。

总摄入

MA-[D-Leu-4]-OB3的总吸收通过测量每种递送方法的吸收曲线下的面积(AUC)来确定。该数值代表吸收进入体循环中的肽的总吸收量或程度，或其给药后的总吸收量。在SC、IP、IM、口服和鼻内递送之后，AUC值分别为1,829,225ng/ml/min、1,212,330ng/ml/min、842,374ng/ml/min、278,460ng/ml和158,426ng/ml。由这些值计算鼻内、口服、IM、IP和SC的相对生物利用度分别为1.0、1.8、5.3、7.7和11.7。

消除常数(k_elim)和血清半衰期(t_1/2)

如材料和方法部分所描述的，计算在SC、IP、IM、口服和鼻内递送之后，MA-[D-Leu-4]-OB3的消除常数，它们被分别确定为-0.350、-0.155、-0.117、-0.024和-0.085。在SC、IP、IM、口服和鼻内递送之后，MA-[D-Leu-4]-OB3的血清半衰期分别为2.0、4.1、5.5、28.9和8.2小时。

血浆清除率(CL)和表观分布容积(V_d)

在SC、IP、IM、口服和鼻内给药之后，MA-[D-Leu-4]-OB3的血浆清除率分别为0.05、0.08、0.12、0.36和0.63ml/min。在SC、IP、IM、口服和鼻内递送之后，MA-[D-Leu-4]OB3的表观分布容积分别为8.6、30.9、61.3、900.8和447.0ml。这些药代动力学参数以及先前描述的[D-Leu-4]-OB3的那些药代动力学参数均归纳于下表1。

表1

在SC、IP、IM、口服和鼻内递送之后，[D-Leu-4]-OB3(1mg)¹和MA-[D-Leu-4]-OB3(0.1mg)的药代动力学特征

¹获自先前研究的数据

²于PBS中递送

³于0.3％DDM中递送

在先前采用[D-Leu-4]-OB3的研究中，尽管该研究反复地论证了其对于能量平衡和葡萄糖体内动态平衡具有瘦素样作用，但是不论递送途径如何，对于持续性反应均需要高的浓度(毫克级)和每日多次剂量。因此，改善[D-Leu-4]-OB3在人类应用中的药代动力学对本发明而言是必要的。具体地，寻求增加[D-Leu-4]-OB3的生物利用度、延长其半衰期以及降低其从体循环中清除的速率。这种改善可降低所递送的[D-Leu-4]-OB3剂量的大小和频率，同时维持或改善其功效。

本发明的肉豆蔻酸与[D-Leu-4]-OB3的缀合为改进[D-Leu-4]-OB3的药代动力学特征提供了一种有效方法。当通过IP、SC、或IM注射递送，或以管饲法口服递送时，MA-[D-Leu-4]-OB3的最大吸收(C_max)明显高于[D-Leu-4]-OB3的最大吸收(C_max)，即使是在低于[D-Leu-4]-OB3的10倍剂量时。然而，在鼻内滴注后所观察到的[D-Leu-4]-OB3的双相吸收，在鼻内递送MA-[D-Leu-4]-OB3之后并未观察到，这种现象可能与较低的给药剂量有关。在鼻内滴注之后，MA-[D-Leu-4]-OB3的这种吸收曲线的变化表明，达到肽最大浓度的单一吸收位点与[D-Leu-4]-OB3的吸收曲线中所观察到的两个峰相比时要晚得多，T_max分别为6h对比10和60min。

如数据表明，与[D-Leu-4]-OB3的5至60分钟的吸收期相比，取决于给药途径，MA-[D-Leu-4]-OB3的吸收在2至6小时期间内缓慢发生。这些发现表明与[D-Leu-4]-OB3相比，肉豆蔻酸缀合有利于更高浓度的MA-[D-Leu-4]-OB3的吸收，但吸收速率较慢。尽管这种吸收模式似乎并不能在所使用的所有递送方法中提高MA[D-Leu-4]-OB3的总吸收(AUC)，但是其的确延长了在体循环中存在升高的肽水平的时间。

值得特别注意并且与延长MA-[D-Leu-4]-OB3的生物活性直接有关的是，与[D-Leu-4]-OB3相比，其更长的半衰期和更慢的血浆清除率，这在本研究中所使用的每一种递送方法之后均可观察到。当与在血清中快速升高并迅速清除的[D-Leu-4]-OB3相比，这种模式可在更长的时期内维持MA-[D-Leu-4]-OB3的生物活性。在db/db小鼠中的口服功效研究的结果表明情况就是这样，在所述研究中递送了与先前所使用的[D-Leu-4]-OB3相比更低剂量的MA-[D-Leu-4]-OB3。

因此本发明的[D-Leu-4]-OB3的肉豆蔻酸缀合显著改善了其药代动力学特征。所述数据也表明MA-[D-Leu-4]-OB3可用作治疗人类肥胖症和/或糖尿病的一种口服、非侵入性的且安全的治疗方法。

实施例2

研究对比了在6至7周龄雄性BKS.Cg-Dock7^m+/+Lepr^db/J糖尿病db/db小鼠中，口服递送于PBS或0.3％十二烷基麦芽苷(DDM，)中的缀合了肉豆蔻酸的[D-Leu-4]-OB3对空腹血糖的作用。

在连续14天，每天一次通过管饲法，在晚上向雄性db/db小鼠口服给予浓度增加的于PBS或DDM中的MA-[D-Leu-4]-OB3。使用Accu-Chek Nano葡萄糖计(Roche，Indianapolis，IN)每隔一天测量空腹(8小时)血糖水平。在治疗14天后，接受于PBS中的MA-[D-Leu-4]-OB3(250或500mcg/天)的小鼠中的血糖水平与仅接受PBS的对照小鼠的相同。然而，在采用250mcg/天治疗的小鼠中的14天治疗期结束时，在以100或250mcg/天接受于0.3％DDM中的MA-[D-Leu-4]-OB3的小鼠中的血糖水平明显降低到非糖尿病BKS小鼠中所观察到的水平。

这些结果表明，在DDM中口服递送浓度比我们先前采用[D-Leu-4]-OB3的研究中所使用的浓度低四倍的MA-[D-Leu-4]-OB3时，其在降低血糖方面是有效的。这些结果与药代动力学数据一致，其表明与在DDM中的[D-Leu-4]-OB3相比，于DDM中的MA-[D-Leu-4]-OB3具有增加的吸收、更慢的清除率和更长的半衰期。

实施例3

一项证明在胰岛素不足的糖尿小鼠模型中，缀合了肉豆蔻酸的[D-Leu-4]-OB3(MA-[D-Leu-4]-OB3)对体重增加和血糖控制的功效的研究。

目标

在这些研究中，使用链脲霉素(STZ)-诱发的Swiss Webster小鼠，以检查在胰岛素不足的糖尿病小鼠模型中MA-[D-Leu-4]-OB3对体重增加和胰岛素敏感性的作用。使用这种模型，将MA-[D-Leu-4]-OB3的胰岛素致敏作用与另一种已经充分表征的胰岛素致敏药物——二甲双胍的作用进行比较。

材料和方法

采用单次腹膜内(ip)剂量的150mg/kg STZ使七周龄雄性Swiss Webster小鼠患有高血糖。在STZ处理之前，测量空腹血糖水平以确立正常(非糖尿病)葡萄糖水平，此后每天评估高血糖。在STZ治疗后4-5天，空腹血糖水平通常比正常的高3至4倍。

使用地特胰岛素(Novo Nordisk，Malov，Denmark)递送笔来分配0.025U/100μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并且通过每日两次(8：00至9:00a.m.以及4:00至5:00p.m.)皮下(sc)注射递送14天。将MA-[D-Leu-4]-OB3(NeoBiolab，Cambridge，MA)和二甲双胍(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)分别溶解于用无菌去离子水复原的0.3％十二烷基麦芽苷(DDM，Aegis Therapeutics，San Diego，CA)中，并且通过口服管饲法、每日两次(8：00h至9：00h以及16：00h至17：00h)分别以5mg/kg/100μl或100mg/kg/100μl的浓度递送14天。

在第0天及之后的每一天，测量食物和水摄入量，并且在早晨8:00h至9：00h称量小鼠的重量。为了确保测量血糖这些天的空腹(8小时)葡萄糖水平，将食物在8:00h至9:00h从笼中移出，并且在测量之后立即放回。

结果

在STZ诱发高血糖症的雄性SW小鼠中，单独的胰岛素、或与MA-[D-Leu-4]-OB3组合、或与二甲双胍组合对体重增加的作用示于图9和下表2中：

表2

在STZ诱发高血糖症的雄性Swiss Webster小鼠中，单独的地特胰岛素、或与MA-[D-Leu-4]-OB3组合、或与二甲双胍组合对体重增加、食物和水摄入量、以及血糖水平的作用

在14天测试期结束时，单独给予DDM的小鼠增重11.9％，而每天接受0.05U胰岛素的小鼠增重16.1％。接受单独的MA-[D-Leu-4]-OB3的小鼠只增重8.1％。当MA-[D-Leu-4]-OB3与胰岛素联合给药时，胰岛素诱发的体重增加降低至未治疗的小鼠中所观察到的体重增加(11.9％)。当二甲双胍与胰岛素联合给药时，体重增加只增加10.0％。

在STZ诱发高血糖症的小鼠中，在缺乏或存在MA-[D-Leu-4]-OB3或二甲双胍的情况下，胰岛素对空腹血糖的作用示于图10和表2。在14天研究期间，正常SW小鼠中的空腹血糖水平保持稳定(150-170mg/dl)，而在STZ处理的小鼠中，接受单独的DDM的小鼠的空腹血糖水平在500至600mg/dl范围内。0.05U地特胰岛素使血糖水平降低64.0％，但并未降低至正常范围。单独的MA-[D-Leu-4]-OB3对空腹血糖水平的作用非常小。当地特胰岛素与MA-[D-Leu-4]-OB3或二甲双胍联合给药时，0.05U地特胰岛素的抗高血糖作用被放大。在两天内，在联合给予MA-[D-Leu-4]-OB3与胰岛素的小鼠中，空腹血糖水平几乎达到正常，并且在整个研究过程中保持如此。未发现低血糖事件。当联合给予二甲双胍与胰岛素时，观察到类似的结果。然而，在6天或治疗后，接受二甲双胍的小鼠的低血糖日益严重。

总结

该研究的结果表明当口服给予MA-[D-Leu-4]-OB3与皮下给予胰岛素联合时，MA-[D-Leu-4]-OB3防止与胰岛素药物疗法相关的体重增加。结果还表明，在这种胰岛素不足的糖尿病小鼠模型中，MA-[D-Leu-4]-OB3在防止由外源性胰岛素诱发的体重增加以及提高组织对胰岛素的敏感性方面，与二甲双胍一样好或优于二甲双胍。

MA-[D-Leu-4]-OB3的胰岛素致敏作用进一步得到了在该胰岛素不足的小鼠模型中的观察结果的支持，但与先前在高胰岛素血症ob/ob和db/db小鼠中采用[D-Leu-4]-OB3、以及在db/db小鼠中采用MA-[D-Leu-4]-OB3所观察到的结果相反，单独的MA-[D-Leu-4]-OB3不能显著地降低空腹血糖水平。这些水平——在14天测试期结束时比在研究开始时仅降低1.2％——证实STZ处理使内源性胰岛素的产生严重受损。

该数据反映了为了使MA-[D-Leu-4]-OB3发挥其对血糖水平的影响，其完全依赖于胰岛素的存在。该结论进一步由以下观察结果支持：当将MA-[D-Leu-4]-OB3(0.25mg/kg/天)与外源性胰岛素联合给药时，MA-[D-Leu-4]-OB3能够在该研究的前两天内使血糖水平正常化。

关于该小鼠模型中MA-[D-Leu-4]-OB3对葡萄糖体内动态平衡的功效，值得特别注意的事实是，虽然MA-[D-Leu-4]-OB3和二甲双胍在与外源性胰岛素联合用药时，都能使血糖降低至正常水平以内，但是MA-[D-Leu-4]-OB3的剂量比二甲双胍的剂量低20倍(分别为10mg/kg/天和200mg/kg/天)。该数据表明，在这种胰岛素不足的小鼠模型中，以质量计，MA-[D-Leu-4]-OB3在改善胰岛素敏感性方面的有效性可能是二甲双胍的20倍，以摩尔计，其有效性可能是二甲双胍的6.1倍。

在其他实施方案中，本发明可为药物化合物，其包含与瘦素相关肽缀合的下述任一种化合物：环己基戊酰基、酰基谷氨酰基、月桂酰基、2-琥珀酰氨基肉豆蔻酸、2-琥珀酰氨基乙氧基棕榈酸、肉豆蔻酰基-α-谷氨酰基、肉豆蔻酰基-α-谷氨酰基-甘氨酰基、胆酰基、7-脱氧胆酰基、石胆酰基、石胆酰基-谷氨酰基、4-苯甲酰基-苯丙氨酸、L-甲状腺素基、辛二酰基-D-甲状腺素、3，3′，5，5′-四碘甲状腺乙酰基、环己基戊酰基。所述瘦素相关肽可为下述中的一种：AVPIQKVQDDTKTLI(SEQ ID NO：2)、TKTLIKTIVTRINDI(SEQ ID NO：3)、RINDISHTQSVSAKQ(SEQ ID NO：4)、VSAKQRVTGLDFIPG(SEQ ID NO：5)、DFIPGLHPILSLSKM(SEQ ID NO：6)、SLSKMDQTLAVYQQV(SEQ ID NO：7)、VYQQVLTSLPSQNVL(SEQ ID NO：8)、SQNVLQIANDLENLR(SEQ ID NO：9)、DLLHLLAFSKSCSLP(SEQ ID NO：10)、SCSLPQTSGLQKPES(SEQ ID NO：11)、QKPESLDGVLEASLY(SEQ ID NO：12)、EASLYSTEVVALSRL(SEQ ID NO：13)、ALSRLQGSLQDILQQ(SEQ ID NO：14)或DILQQLDVSPEC(SEQ ID NO：15)。

序列表

<110> 奥尔巴尼医学院

<120> 肉豆蔻酰化的瘦素相关肽及其用途

<130> 232P007A

<150> 62/035,916

<151> 2014-08-11

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对应于瘦素OB3区域的合成肽

<400> 1

Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr

1 5

<210> 2

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对应于瘦素OB3区域的合成肽

<400> 2

Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile

1 5 10 15

<210> 3

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对应于瘦素OB3区域的合成肽

<400> 3

Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile

1 5 10 15

<210> 4

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对应于瘦素OB3区域的合成肽

<400> 4

Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ala Lys Gln

1 5 10 15

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对应于瘦素OB3区域的合成肽

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Val Ser Ala Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly

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<213> 人工序列

<220>

<223> 对应于瘦素OB3区域的合成肽

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Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln Val

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Val Tyr Gln Gln Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu

1 5 10 15

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对应于瘦素的OB3区域的合成肽

<400> 9

Ser Gln Asn Val Leu Gln Ile Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg

1 5 10 15

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<213> 人工序列

<220>

<223> 对应于瘦素OB3区域的合成肽

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Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对应于瘦素OB3区域的合成肽

<400> 11

Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu Ser

1 5 10 15

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<223> 对应于瘦素OB3区域的合成肽

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<211> 15

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<213> 人工序列

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<223> 对应于瘦素OB3区域的合成肽

<400> 14

Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对应于瘦素OB3区域的合成肽

<400> 15

Asp Ile Leu Gln Gln Leu Asp Val Ser Pro Glu Cys

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<213> 人工序列

<220>

<223> 对应于瘦素OB3区域的合成肽

<400> 16

Ser Cys His Leu Pro Trp Ala

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