具有增强的神经结合选择性的环状肽、与所述环状肽结合的纳米颗粒和此二者用于实时体内神经组织成像的用途的制作方法

相关申请案交叉参考

本申请案主张2014年12月15日提出申请的美国临时申请案第62/092,191号的权益，所述文件的全部内容以引用方式并入本文中。

政府支持

本发明是在政府支持下在国家卫生研究院(nationalinstituteofhealth)所授予的许可号nihnciu54ca199081-01下作出。

本发明大体来说涉及环状肽与环状肽结合的纳米颗粒和使用所述环状肽和/或所述与环状肽结合的纳米颗粒进行手术中神经组织成像的方法。

背景技术：

许多手术程序携带意外神经损害或横断的风险，此可产生大量问题(例如慢性疼痛或瘫痪)。已研究在手术期间使用近红外(nir)药剂来突出显示神经组织，由此增强外科医生避免切割或损害所突出显示神经组织的能力。举例来说，已使用诸如二苯乙烯基苯和噁嗪等分子，但其缺乏有效用于人类和其它哺乳动物中的手术中应用所需的结合特性和/或光谱性质。

惠特尼(whitney)等人通过将噬菌体展示方法应用于切下的鼠类周边神经而鉴别出若干神经结合多肽(惠特尼m.a.；克里斯普j.l.(crisp,j.l.)；阮l.t.(nguyen,l.t.)；弗里德曼b.(friedman,b.)；格罗斯l.a.(gross,l.a.)；斯坦巴克p.(steinbach,p.)；钱r.y.(tsien,r.y.)；阮q.t.自然生物技术(nat.biotech.)2011,29,352)。随后使用荧光团或nir染料标记序列，且在体外和在体内评估结合。较背景提供最高对比的序列为17残基多肽np41(图1a)。需要对神经组织具有增强的选择性且对于手术中应用具有改良光谱性质的神经结合剂。

技术实现要素：

本文描述环状肽、与环状肽结合的纳米颗粒和使用所述环状肽和/或所述与环状肽结合的纳米颗粒进行手术中神经组织成像的方法。

在一个方面中，本发明涉及一种神经结合肽偶联物，其包括：环状肽、纳米颗粒、荧光剂和连接体部分。在另一方面中，本发明涉及一种神经结合肽偶联物，其包括：线性多肽、纳米颗粒、荧光剂和连接体部分。

在某些实施例(任一方面)中，纳米颗粒包括：基于二氧化硅的核心；位于核心内的荧光剂；环绕核心的至少一部分的二氧化硅壳体；附接到纳米颗粒的连接体部分；和任选地1到20个附接到经聚合物涂覆的纳米颗粒的肽配体。

在某些实施例(任一方面)中，纳米颗粒为超小颗粒(举例来说，平均直径小于100nm、例如小于50nm、例如小于30nm、例如小于20nm、例如小于10nm)(举例来说，其中超小纳米颗粒为c点或c’点)。

在某些实施例(任一方面)中，连接体部分包括一个或多个选自由以下组成的群组的成员：聚乙二醇(peg)、peg2和氨基甲酸对氨基苄基氧基酯(pabc)(举例来说，其中连接体部分具有2到50个原子)。在某些实施例中，连接体部分包括一个或多个描述于美国专利申请案第14/722,307号(2015年5月27日提出申请，公开为美国专利申请公开案第us2015/0343091号，所述文件的全部内容以引用方式并入本文中)的连接体部分。

在某些实施例中，环状肽通过连接体部分结合到纳米颗粒。在某些实施例(任一方面)中，荧光剂包括青色素染料(例如cy5或cy5.5)。在某些实施例(任一方面)中，神经结合肽偶联物具有5到20个氨基酸残基和/或15原子到60原子大环。在某些实施例(任一方面)中，神经结合肽偶联物具有17个氨基酸残基和/或51原子大环。

在某些实施例中，环状肽包括肽序列ntqtlakapeht。在某些实施例中，大环是通过头对尾环化肽或通过在序列内部引入共价键来形成。在某些实施例中，环状肽包括选自由以下组成的群组的肽序列：tytdwlnfwawp、kslsrhdhihhh和dftktsplgih。

在另一方面中，本发明涉及包括肽序列ntqtlakapeht的环状肽。

在另一方面中，本发明涉及包括选自由以下组成的群组的肽序列的环状肽：tytdwlnfwawp、kslsrhdhihhh和dftktsplgih。

在另一方面中，本发明涉及一种环状肽组合物，其包括：荧光剂；和包括肽序列ntqtlakapeht的环状肽。

在另一方面中，本发明涉及一种环状肽组合物，其包括：荧光剂；和包括选自由以下组成的群组的肽序列的环状肽：tytdwlnfwawp、kslsrhdhihhh和dftktsplgih。

在某些实施例中，环状肽包括大环。在某些实施例中，大环是通过头对尾环化肽或通过在序列内部引入共价键来形成。

在另一方面中，本发明涉及一种包括具有如图1b或图4a-4h中所展示的结构的环状肽的环状肽组合物。在某些实施例中，环状肽附接到纳米颗粒。在某些实施例中，环状肽通过连接体部分共价或非共价附接到纳米颗粒。在某些实施例中，环状肽经官能化。

在任一上述方面的某些实施例中，组合物另外包括放射标记。

在另一方面中，本发明涉及一种成像方法，其包括：向个体投与包括任一上述方面的组合物的调配物且使组合物选择性结合到个体的神经组织；将个体组织曝露于激发光；和检测由组合物的荧光剂发射的光以产生图像且显示图像。

在某些实施例中，从神经组织发射的光强于从周围组织发射的光(举例来说，神经对肌肉信号比至少为2)，从而神经组织可与周围组织目测区分。在某些实施例中，从神经组织发射的光可至少早在向个体(例如其中个体为动物，例如其中个体为人类)投与调配物后15分钟检测到。在某些实施例中，从神经组织发射的光可至少晚在向个体(例如其中个体为动物，例如其中个体为人类)投与调配物后1小时(例如至少1小时、至少2小时、至少3小时或至少4小时)检测到。

在某些实施例中，投与包括在手术暴露之后将调配物局部施加到毗邻转移性淋巴结或原发性肿瘤或在其附近的周边神经干中。在某些实施例中，所述方法包括将调配物局部施加到周边神经干(例如在手术暴露之后毗邻转移性淋巴结或原发性肿瘤或在其附近)，从而使得调配物的组合物从神经干扩散到神经组织的较小分支，且检测由组合物的荧光剂发射的光以产生神经组织的较小分支的图像。

在某些实施例中，经静脉内(通过i.v.)投与调配物。在某些实施例中，局部投与调配物。在某些实施例中，在手术程序期间将个体组织曝露于激发光。在某些实施例中，图像为视频和/或静止图像和/或实时视频。在某些实施例中，在实施于个体上的手术程序期间向外科医生显示图像。

在另一方面中，本发明涉及一种成像方法，其包括：将个体组织曝露于激发光，其中已向个体投与包括任一上述方面的组合物的调配物；和检测由组合物的荧光剂发射的光。

在某些实施例中，检测步骤包括检测由组合物的荧光剂发射的光以产生图像且显示图像。在某些实施例中，所述方法进一步包括向个体投与组合物的步骤。

在某些实施例中，从神经组织发射的光强于从周围组织发射的光(举例来说，神经对肌肉信号比至少为2)，从而神经组织可与周围组织目测区分。在某些实施例中，从神经组织发射的光可至少早在向个体(例如其中个体为动物，例如其中个体为人类)投与调配物后15分钟检测到。在某些实施例中，从神经组织发射的光可至少晚在向个体(例如其中个体为动物，例如其中个体为人类)投与调配物后1小时(例如至少1小时、至少2小时、至少3小时或至少4小时)检测到。在某些实施例中，在手术暴露之后通过局部施加将调配物投与毗邻转移性淋巴结或原发性肿瘤或在其附近的周边神经干。在某些实施例中，通过局部施加将调配物投与周边神经干(例如在手术暴露之后毗邻转移性淋巴结或原发性肿瘤或在其附近)，从而调配物的组合物从神经干扩散到神经组织的较小分支，其中所述方法包括检测由组合物的荧光剂发射的光以产生神经组织的较小分支的图像。在某些实施例中，经静脉内(通过i.v.)投与调配物。在某些实施例中，局部投与调配物。

在某些实施例中，在手术程序期间将个体组织曝露于激发光。在某些实施例中，检测步骤包括检测由组合物的荧光剂发射的光以产生图像且显示图像，其中图像为视频和/或静止图像和/或实时视频。在某些实施例中，在实施于个体上的手术程序期间向外科医生显示图像。

定义

为更容易地理解本发明，下文首先定义某些术语。下列术语及其它术语的其它定义阐释于本说明书通篇中。

在本申请案中，除非另有说明，否则使用“或”意指“和/或”。如本申请案中所使用，术语“包括(comprise)”和所述术语的变化形式(例如“包括(comprising和comprises)”)并不打算排除其它添加剂、组份、整数或步骤。如本申请案中所使用，术语“约”和“大约”可作为等效物使用。本申请案中所使用带有或不带有约/大约的任何数值打算涵盖所属领域技术人员所了解的任何正常波动。在某些实施例中，除非另外说明或否则从上下文显而易见，否则术语“大约”或“约”涉及一系列在所陈述参考值的任一方向(大于或小于)上的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内的值(所述数字可能超过可能值的100％时除外)。

“投与”：术语“投与”涉及将物质或调配物引入个体中。一般来说，可利用任一投与途径，包含(例如)非经肠(例如静脉内)、经口、局部、皮下、腹膜腔、动脉内、吸入、阴道、直肠、经鼻、引入脑脊髓液中或滴入体腔中。在一些实施例中，投与为经口投与。另外或或者，在一些实施例中，投与为非经肠投与。在一些实施例中，投与为静脉内投与。在某些实施例中，通过局部注射与静脉内投与来投与物质或调配物。举例来说，可以足够高浓度局部注射具有含肽组合物(例如含颗粒和非含颗粒组合物)的物质或调配物以用于成像目的。在某些实施例中，经静脉内投与非颗粒含肽组合物。

“生物相容”：本文所用的术语“生物相容”打算描述不在体内诱发实质性有害反应的材料。在某些实施例中，如果材料对细胞无毒，则其为“生物相容”。在某些实施例中，如果将材料在体外添加到细胞中产生小于或等于20％细胞死亡和/或其体内投与并不诱导发炎或其它所述不利效应，则其为“生物相容”。在某些实施例中，材料为生物可降解。

“生物可降解”：如本文中所使用，“生物可降解”材料为在引入细胞中时通过细胞机制(例如酶促降解)或通过水解成细胞可再利用或弃除且对细胞并无显著毒性效应的组份而分解者。在某些实施例中，通过分解生物可降解材料所生成的组份并不在体内诱导发炎和/或其它不利效应。在一些实施例中，以酶促方式分解生物可降解材料。或者或另外，在一些实施例中，通过水解来分解生物可降解材料。在一些实施例中，生物可降解聚合材料分解成其组份聚合物。在一些实施例中，生物可降解材料(包含(例如)生物可降解聚合材料)的分解包含酯键的水解。在一些实施例中，材料(包含(例如)生物可降解聚合材料)的分解包含氨基甲酸酯链接的裂解。

“载剂”：如本文中所使用，术语“载剂”涉及与化合物一起投与的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。所述医药载剂可为无菌液体，例如水和油，包含那些石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油和诸如此类。优选采用水或水性溶液盐水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液作为载剂，尤其用于可注射溶液。适宜医药载剂描述于“雷明顿医药科学(remington'spharmaceuticalsciences)”(e.w.马丁(e.w.martin))中。

“检测器”：如本文中所使用，“检测器”涉及电磁辐射的任一检测器，包含(但不限于)ccd照相机、光倍增管、光二极管和突崩光二极管。

“图像”：如本文中所使用，术语“图像”应理解为意指视觉显示或可经诠释用于视觉显示的任一数据表示。举例来说，三维图像可包含在三个空间维度中有所变化的给定量的值的数据组。三维图像(例如三维数据表示)可以二维显示(例如在二维屏幕上或在二维印出上)。举例来说，术语“图像”可涉及光学图像、x射线图像、通过正电子发射断层摄影术(pet)、磁共振(mr)、单光子发射计算机断层摄影术(spect)和/或超声波生成的图像和这些图像的任一组合。

“肽”或“多肽”：术语“肽”或“多肽”涉及至少两个(例如至少三个)由肽键连接到一起的氨基酸的串。在一些实施例中，多肽包括非天然氨基酸；或者或另外，在一些实施例中，多肽包括一个或多个非天然氨基酸(即并天然出现但可纳入多肽链中的化合物；例如参见http://www.cco.caltech.edu/～dadgrp/unnatstruct.gif，其显示已成功纳入功能离子通道中的非天然氨基酸的结构)和/或可或者采用如业内已知的氨基酸类似物)。在一些实施例中，可(例如)通过添加化学实体(例如碳水化合物基团、磷酸酯基团、法呢基、异法呢基、脂肪酸基团、用于偶联、官能化或其它修饰的连接体等)来修饰蛋白质中的一个或多个氨基酸。

“放射标记”：如本文中所使用，“放射标记”涉及包括至少一种元素的放射性同位素的部分。实例性适宜放射标记包含(但不限于)描述于本文中者。在一些实施例中，放射标记是用于正电子发射断层摄影术(pet)中者。在一些实施例中，放射标记是用于单光子发射计算机断层摄影术(spect)中者。在一些实施例中，放射性同位素包括^99mtc、¹¹¹in、⁶⁴cu、⁶⁷ga、¹⁸⁶re、¹⁸⁸re、¹⁵³sm、¹⁷⁷lu、⁶⁷cu、¹²³i、¹²⁴i、¹²⁵i、¹¹c、¹3n、¹⁵o、¹⁸f、¹⁸⁶re、¹⁸⁸re、¹⁵³sm、¹⁶⁶ho、¹⁷⁷lu、¹⁴⁹pm、⁹⁰y、²¹³bi、¹⁰³pd、¹⁰⁹pd、¹⁵⁹gd、¹⁴⁰la、¹⁹⁸au、¹⁹⁹au、¹⁶⁹yb、¹⁷⁵yb、¹⁶⁵dy、¹⁶⁶dy、⁶⁷cu、¹⁰⁵rh、¹¹¹ag、⁸⁹zr、²²⁵ac和¹⁹²ir。

“个体”：如本文中所使用，术语“个体”包含人类和哺乳动物(例如小鼠、大鼠、猪、猫、狗和马)。在许多实施例中，个体为哺乳动物、尤其灵长类动物、尤其人类。在一些实施例中，个体为家畜，例如牛、绵羊、山羊、母牛、猪和诸如此类；家禽，例如鸡、鸭、鹅、火鸡和诸如此类；和家养动物，尤其为宠物，例如狗和猫。在一些实施例中(例如尤其在研究背景中)，个体哺乳动物为(例如)啮齿类动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠)、兔、灵长类动物或猪(例如近交猪)和诸如此类。

“基本上”：如本文中所使用，术语“基本上”涉及呈现所关注特性或性质的总或几乎总范围或程度的定性条件。生物领域技术人员应理解，生物及化学现象极少(如果存在)完成和/或继续进行到完全或实现或避免绝对结果。术语“基本上”由此在本文中用于捕获许多生物及化学现象中固有的完整性的潜在缺乏。

“治疗剂”：如本文中所使用，片语“治疗剂”涉及在投与个体时具有治疗效应和/或诱发所需生物和/或药理学效应的任一药剂。

“治疗”：如本文中所使用，术语“治疗(treatment)”(还有“治疗(treat或treating)”)涉及某一物质用于以下用途的任何投与：部分地或完全缓解、改善、再生、抑制、延迟特定疾病、病症和/或病状的一种或多种症状、特征和/或病因、减小其严重程度和/或减小其发病率。所述治疗可为治疗并未展现相关疾病、病症和/或病状的体征的个体和/或治疗仅展现疾病、病症和/或病状的早期体征的个体。或者或另外，所述治疗可为治疗展现相关疾病、病症和/或病状的一个或多个确立体征的个体。在一些实施例中，治疗可为治疗已诊断为患有相关疾病、病症和/或病状的个体。在一些实施例中，治疗可为治疗已知具有一个或多个与具有发生相关疾病、病症和/或病状的增加风险统计学相关的敏感因子的个体。

本文呈现图式以用于阐释目的而非加以限制。

附图说明

通过参照结合附图进行的以下详细描述，本发明的前述及其它目标、方面、特征和优点将变得更显而易见且更好理解，其中：

图1a-1d展示神经结合肽-cy5偶联物的实例。

图1a展示具有cy5的线性神经结合肽(ac＝n-末端处的乙酰基)。

图1b展示具有cy5的环状神经结合肽。

图1c展示线性肽的液相色谱-质谱(lcms)。

图1d展示环状肽的lcms。对于lcms来说，在waters的4.6×50mmc18管柱(于水中的5-95％乙腈(0.1％tfa)，10min)上运行试样。证实产物的质谱数据以黑框表示。

图2展示使用不同证实的多肽(例如随机、环状、线性)处理的坐骨神经样品。将神经试样与50μm多肽在室温下一起培育30min.，且使用pbs洗涤三次。在体内成像系统(ivis)系统上获得图像。一式两份运行实验。

图3展示神经结合蛋白(nbp)-聚乙二醇(peg)-cy5.5-c’点的示意图。染料囊封于二氧化硅壳体内且经肽表面官能化。

图4a-4h展示通过固相肽合成器合成的17氨基酸(aa)序列肽、截短序列肽(例如10-aa、14-aa)和乱序肽的线性和环化构象。还展示使用lc-ms的hplc特征和表征。

图5展示针对人类尸体神经样品比较肽-nir染料偶联物与肽官能化含深红色/nir染料(cy5、cy5.5)c点的离体结合/摄取研究。测试肽序列、构象和配体数量对神经结合的效应。

图6展示肽-染料偶联物或肽官能化c点的人类坐骨神经和肌肉摄取。

图7a和7b展示使用光学成像方法在与神经结合肽或肽官能化c点一起培育后离体人类坐骨神经样品中的时间变化性信号变化。

图8展示在与肽-cy5染料偶联物一起培育后人类坐骨神经样品的归一化荧光信号强度。

图9a-9e展示经低温切片、肽-染料偶联物预处理的人类坐骨神经样品的荧光显微术。

图10a-10e展示在与肽-染料偶联物或荧光神经结合肽(nbp)官能化基于颗粒的探针(例如cy5‐nbp‐c点)一起培育后人类坐骨神经样品的横截面荧光显微术。

图11a和11b展示17aa残基环状肽-染料偶联物在人类坐骨神经样品中的局部化。

图12展示在注射400纳摩尔环状肽-染料偶联物后人类坐骨神经的时间依赖性体内荧光显微术。

图13a-13e展示在注射17aa环状神经结合肽后坐骨神经和肌肉荧光信号对时间的体内成像。

图14a和14b展示在注射17aa线性神经结合肽后坐骨神经和肌肉荧光信号对时间的体内成像。

图15展示在thy1-yfp转基因小鼠中注射150纳摩尔环状肽与线性肽-染料偶联物后人类坐骨神经的时间依赖性体内荧光显微术。

图16a-16e展示在注射150纳摩尔17aa环状神经结合肽后坐骨神经和肌肉荧光信号对时间的体内成像。

具体实施方式

在整个说明书中，其中将组成物描述为具有、包含或包括特定组份，或其中将方法描述为具有、包含或包括特定步骤，另外预计存在基本上由所叙述组份组成或由其组成的本发明组成物，且存在基本上由所叙述处理步骤组成或由其组成的本发明方法。

应理解，只要本发明保持可操作，各步骤的次序或用于执行某些动作的次序并不重要。此外，可同时实施两个或多于两个步骤或动作。

本文中对(举例来说)背景技术章节中的任何公开案的提及并非承认所述公开案充当关于本文中所呈现的技术方案中的任一者的先前技术。背景技术章节是出于清晰的目的而呈现且并非意在作为对关于任何技术方案的先前技术的描述。

在本文所描述的实验中，线性多肽经环化，从而产生更具刚性的结构且增强结合亲和力和选择性。对于所呈现研究来说，使用二甲基甲酰胺(dmf)作为溶剂且使用六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯啶基鏻(pybop)作为偶合剂来实现最佳化条件和高产物产率。

首先，合成线性多肽np41且使用nir染料cy5进行标记以用于测试。通过lcms来证实图1a中所展示的结构，如图1c中所展示。还合成图1a的np41结构的环状类似物。还通过lcms来证实图1b中所展示的环状肽的结构，如图1d中所展示。作为对照，使用cy5标记随机多肽(ac-shsstardlwphgkegc)并加以评价。如图2中所展示，与乱序多肽和线性多肽相比，环状化合物针对坐骨神经样品展现显著增强的荧光强度(2到3倍)。与线性多肽和乱序多肽相比，环状化合物还展现增强的神经组织选择性(对肌肉组织)。

图4a-4h展示用于本文所描述的神经结合实验的不同肽-染料偶联物证实(例如线性、环化、乱序)的合成和表征。举例来说，通过固相肽合成器合成17氨基酸(aa)序列肽、截短序列肽(10-aa、14-aa)和乱序肽的线性和环化构象。在液相中使用cy5-马来酰亚胺在半胱氨酸残基处标记肽。使用制备型hplc纯化最终产物且产率大于95％。通过分析型hplc和lc-ms来表征和证实最终产物的纯度和质量，如每一表中所展示。随后使最终神经结合肽产物附接到c’点以产生用于体内和离体研究的多价平台。

为改良量子增强和荧光相关光谱(fcs)光亮度，可将环状化合物结合(或另外纳入)于/到纳米颗粒(举例来说，如由菲利普斯(phillips)(菲利普斯e、佩尼亚特-麦地那o(penate-medinao)、赞佐尼科pb(zanzonicopb)、卡瓦哈尔rd(carvajalrd)、莫汉p(mohanp)、叶y(yey)、胡姆j(hummj)、格嫰m(m)、卡利吉安h(kaliagianh)、舍德尔h(h)、斯特劳斯w(straussw)、拉尔森sm(larsonsm)、威斯纳u(wiesneru)、布莱伯利ms(bradburyms.)超小光学杂合纳米颗粒探针的临床转译(clinicaltranslationofanultrasmallopticalhybridnanoparticleprobe)。科学转译医学(sciencetranslationalmedicine)。2014；6(260))所描述的c点和/或c’点(纳入cy5.5的较新一代pet放射标记(¹²⁴i)fda-ind批准的crgdy官能化c’点))中。通过使反应性染料物质与有机硅酸盐来源偶合来产生荧光二氧化硅前体。然后水解杂合前体且与纯二氧化硅缩合以得到杂合有机/无机核心。这些核心用作用于生长纯二氧化硅壳体的均质核，从而进一步保护所囊封染料。(伯恩斯a.(burns,a.)、ow,h.、威斯纳u.荧光核心-壳体二氧化硅纳米颗粒：针对用于纳米生物技术的“颗粒实验室”架构(fluorescentcore-shellsilicananoparticles:towards“labonaparticle”architecturesfornanobiotechnology)。化学学会评论(chemsocrev.)2006；35(11):1028-42)(图3)。具有荧光核心的核心-壳体纳米颗粒还描述于美国专利第8,298,677号和第8,409,876号中，所述专利的全部内容以引用方式併入本文中。

在某些实施例中，可使用描述于布莱伯利等人，整合生物学(integr.biol.)(2013)5:74-86(其以引用方式併入本文中)中的特征。在某些实施例中，可使用描述于赫兹(herz)等人，材料化学期刊(j.mater.chem.)(2009)19,6341-6347(其以引用方式併入本文中)中的特征(例如探针物质)。

在某些实施例中，可使用描述于布莱伯利等人的国际pct专利申请案第pct/us2010/040994号和第pct/us2014/030401号(公开为2011年1月6日的wo2011/003109和2014年9月18日的wo2014/145606，其全部内容均以引用方式併入本文中)中的特征(例如纳米颗粒)。

在某些实施例中，可使用描述于威斯纳等人的美国专利第8298677号(公开于2012年10月30日，其全部内容以引用方式併入本文中)中的特征(例如纳米颗粒)。

图3展示根据本发明的一阐释性实施例的nbp-peg-cy5.5-c’点的示意图。nbp是进一步详细描述于下文中的特定环状神经结合肽。cy5.5染料展示为附加到环状nbp结构，且cy5.5还展示为掺杂于二氧化硅核心中。在某些实施例中，使染料附接到环状肽且并不附接到纳米颗粒、含于其内、结合到纳米颗粒或另外与其直接缔合。在某些实施例中，染料并不附接到环状肽，但附接到纳米颗粒、含于其内、结合到纳米颗粒和/或另外与其直接缔合。

为证实相对于背景的信号增强，使线性多肽np41通过peg偶联结合到c’点，且测量量子增强和fcs光亮度的所得改良(表1)。类似地，可使环状肽结合到纳米颗粒以较未结合环状肽获得改良的量子增强和fcs光亮度。

表1展示线性nbp-c’点的表征数据。从荧光相关光谱(fcs)测定测量值。

表1

可使用噬菌体展示方式来鉴别对人类尸体神经组织样品具有特异性的新颖人类神经结合肽序列(例如神经选择性标记物)。噬菌体展示是成功应用于切下的鼠类神经组织的有力基因工具，其可与人类面神经和喉神经样品一起使用以鉴别对这些神经组织具有选择性的新颖nbp序列。对神经组织展现有益整体结合亲和力和选择性的肽序列可在附接到c点之后用于多工应用。

在某些实施例中，噬菌体展示利用随机12残基肽的组合文库以及109个独立克隆或序列(新英格兰生物实验室(newenglandbiolabs))的复杂度。m13噬菌体载体提供融合到piii衣壳蛋白的随机肽的五价展示。噬菌体经受多轮正性选择和负性选择。通过分离、测序和扩增来正性选择结合所制得面(或喉)神经组织的噬菌体。噬菌体然后经受负性选择步骤；将其与坐骨组织一起培育且选择未结合噬菌体。可继续此选择循环直到重复观察到不同序列为止。

如本文所描述，使用线性多肽np41(其包含序列ntqtlakapeht或更具体来说ac-shsntqtlakapehtgc)以及环状形式的多肽实施实验(展示于图1b中)。使用荧光染料将每一多肽官能化。在某些实施例中，可使用其它可检测标记物，且可使用其它肽序列。np41的核心序列为ntqtlakapeht。尽管实验中所使用的np41多肽包含附接到n-末端的乙酰基-shs基团和附接到c-末端的-gc基团，但其它实施例可使用其它端基(或无端基)。在所展示实例中，包含来自噬菌体衣壳蛋白的-shs-基团，且包含用于染料的-gc。不期望受限于任一特定理论，似乎以化学方式约束线性形式的多肽可增强结合。具有神经组织选择性的其它多肽还可以以下方式使用：原样、结合到纳米颗粒、环化和/或环化且结合到纳米颗粒(举例来说，后者是通过使用适宜连接体化学(例如peg))。举例来说，可环化和/或结合到纳米颗粒使用的其它多肽包含于惠特尼等人的文献中的线性多肽，例如包括序列tytdwlnfwawp、ntqtlakapeht、kslsrhdhihhh和/或dftktsplgih的多肽。

在某些实施例中，使用其它多肽。举例来说，可增加、修饰本文所揭示的任一序列，或减小其长度。尽管本文所描述的实验使用酰胺化学形成头对尾环状肽，但可在内部引入共价约束(例如与头对尾相反)，和/或其它化学也适用(例如点击、二硫化物、置换等)。在某些实施例中，多肽具有5到20个氨基酸残基和/或15原子到60原子大环(例如形成环的原子数，例如15-到60元环)。

一般来说，用于实践本文所描述实施例的纳米颗粒为基于二氧化硅的纳米颗粒(例如c点或c’点)，其加入、涂覆有或另外结合或缔合可检测试剂(例如有机染料、放射标记)和肽靶向配体。在某些实施例中，在使用肽官能化之前，基于二氧化硅的纳米颗粒(例如c点或c’点)可具有小于或等于10nm的平均大小(例如直径)。在某些实施例中，在使用肽官能化之前，基于二氧化硅的纳米颗粒(例如c点或c’点)可具有大于10nm的平均大小。在某些实施例中，平均颗粒大小、颗粒大小分布和/或光亮度适用于特定应用。在某些实施例中，使用基于聚合物的纳米颗粒。在某些实施例中，多肽可检测试剂-纳米颗粒材料(附接有或另外缔合有线性或环状肽和可检测试剂的纳米颗粒)无毒且通过肾有效清除。在某些实施例中，使染料结合到肽(而非直接结合到纳米颗粒)。在某些实施例中，染料结合到纳米颗粒(而非肽)，纳入其内或另外进行缔合。在某些实施例中，使染料与纳米颗粒缔合，且使染料结合到肽。

在某些实施例中，可使用多种不同多肽将基于二氧化硅的纳米颗粒表面官能化。在某些实施例中，多种多肽可加入、涂覆有或另外结合或缔合多种可使用不同读出检测到的检测剂。在某些实施例中，可同时或在不同时间使用基于二氧化硅的纳米颗粒以执行用于手术中应用的靶向配体的多工光学检测。举例来说，在某些实施例中，可使用两种或多于两种基于二氧化硅的光谱差异性纳米颗粒(各自含有独特表面官能化靶向配体)以产生用于手术中应用的多价结构。在某些实施例中，基于二氧化硅的光谱差异性纳米颗粒(各自含有独特表面官能化靶向配体)可发射可通过不同检测方式测量的信号，从而产生多模式读出功能性。

本文所描述的系统和方法可与美国专利申请案第13/381,209号(在2013年2月14日公开为us2013/0039848，其涉及采用基于二氧化硅的荧光纳米颗粒的体内成像系统和方法且以引用方式并入本文中)中所描述的系统和方法一起使用。在一些实施例中，至少一种探针物质包括纳米颗粒。在一些实施例中，纳米颗粒具有二氧化硅架构和富染料核心。在一些实施例中，富染料核心包括荧光报导子。在一些实施例中，荧光报导子为近红外或远红染料。在一些实施例中，荧光报导子是选自由以下组成的群组：荧光团、荧光色素、染料、颜料、荧光过渡金属和荧光蛋白。在一些实施例中，荧光报导子是选自由以下组成的群组：cy5、cy5.5、cy2、fitc、tritc、cy7、fam、cy3、cy3.5、德克萨斯红(texasred)、rox、hex、ja133、阿来鲁尔(alexafluor)488、阿来鲁尔546、阿来鲁尔633、阿来鲁尔555、阿来鲁尔647、dapi、tmr、r6g、gfp、增强的gfp、cfp、ecfp、yfp、柠檬素、维纳斯(venus)、ypet、cypet、amca、光谱绿(spectrumgreen)、光谱橙(spectrumorange)、光谱浅绿(spectrumaqua)、丽丝胺(lissamine)和铕。

在某些实施例中，荧光剂具有在红色和近红外光谱范围内的激发波长和发射波长。在某些实施例中，荧光剂具有介于400nm到1300nm或440nm到1100nm或550nm到800nm或600nm到900nm的激发波长和发射波长。使用此部分电磁光谱可最大化组织渗透且最小化生理学丰富的吸收剂(例如血红素(<650nm)和水(>1200nm))的吸收。在某些实施例中，还可采用激发波长和发射波长在其它光谱(例如可见光和紫外光光谱)中的探针物质。特定来说，可使用荧光团(例如某些羰花青或聚次甲基荧光荧光色素或染料)作为荧光剂，例如颁予卡普托(caputo)等人的美国专利第6,747,159号(2004)；颁予卡普托等人的美国专利第6,448,008号(2002)；颁予德拉席亚拉(dellaciana)等人的美国专利第6,136,612号(2000)；颁予索思威克(southwick)等人的美国专利第4,981,977(1991)号；颁予瓦戈纳(waggoner)等人的5,268,486(1993)；颁予瓦戈纳等人的美国专利第5,569,587号(1996)；颁予瓦戈纳等人的5,569,766(1996)；颁予瓦戈纳等人的美国专利第5,486,616号(1996)；颁予瓦戈纳等人的美国专利第5,627,027号(1997)；颁予布鲁斯(brush)等人的美国专利第5,808,044号(1998)；颁予雷丁顿(reddington)等人的美国专利第5,877,310号(1999)；颁予施恩(shen)等人的美国专利第6,002,003号(1999)；颁予梁(leung)等人的美国专利第6,004,536号(1999)；颁予瓦戈纳等人的美国专利第6,008,373号(1999)；颁予明登(minden)等人的美国专利第6,043,025号(2000)；颁予明登等人的美国专利第6,127,134号(2000)；颁予瓦戈纳等人的美国专利第6,130,094号(2000)；颁予瓦戈纳等人的美国专利第6,133,445号(2000)；颁予理查(licha)等人的美国专利第7,445,767号(2008)；颁予理查等人的美国专利第6,534,041号(2003)；颁予米瓦(miwa)等人的美国专利第7,547,721号(2009)；颁予米瓦等人的美国专利第7,488,468号(2009)；颁予川上(kawakami)等人的美国专利第7,473,415号(2003)；还有wo96/17628、ep0796111b1、ep1181940b1、ep0988060b1、wo98/47538、wo00/16810、ep1113822b1、wo01/43781、ep1237583a1、wo03/074091、ep1480683b1、wo06/072580、ep1833513a1、ep1679082a1、wo97/40104、wo99/51702、wo01/21624和ep1065250a1；和四面体快报(tetrahedronletters)41,9185-88(2000)。

实例性荧光剂包含(例如)下列物质：cy5.5、cy5、cy7.5和cy7(医疗(healthcare))；阿来克鲁尔(alexafluor)660、阿来克鲁尔680、阿来克鲁尔790和阿来克鲁尔750(英杰(invitrogen))；vivotag^tm680、vivotag^tm-s680、vivotag^tm-s750(韦恩医学(visenmedical))；dy677、dy682、dy752和dy780547和/或647(皮尔斯(pierce))；hilytefluor^tm647、hilytefluor^tm680和hilytefluor^tm750800cw、800rs和700dxads780ws、ads830ws和ads832ws(美国染料资源(americandyesource))；xenolightcf^tm680、xenolightcf^tm750、xenolightcf^tm770和xenolightdir(生命科学(lifesciences))；和x-650、x-sight691、x-sight751(健康(health))。在某些实施例中，连接体部分是在末端具有两个或多于两个(双官能、三官能等)官能团的经布置以连结基于二氧化硅的纳米颗粒与肽和/或可检测标记物的化学部分。在本文所描述的实验性实例中，使用peg作为使多肽(例如线性或环状肽)结合到纳米颗粒的连接体部分。可使用其它连接体部分。可(例如)使用不同大小的peg(或其它连接体)链来改变c’点(或其它纳米颗粒)与多肽之间的间隔。在某些实施例中，连接体部分包括一个或多个描述于美国专利申请案第14/722,307号(2015年5月27日提出申请，公开为美国专利申请公开案第us2015/0343091号，所述文件的全部内容以引用方式并入本文中)的连接体部分。

在某些实施例中，神经结合肽官能化c点或肽-染料偶联物具有不同构象(例如环状、线性)和长度(例如截短、狭长)，且在手术暴露之后局部投与毗邻转移性淋巴结或原发性肿瘤或在其附近的周边神经干(包含(但不限于)面神经、坐骨神经、腹下神经、喉神经)以显著增强对比且在sln定位程序期间描绘在不存在这些药剂下不能充分观察到的较小远端神经分支和/或分布以减小损害风险。

在某些实施例中，这些肽官能化颗粒探针或肽-染料偶联物可局部投与于原发性肿瘤位点或患病结点(例如腮腺)附近以促进其由毗邻正常神经(例如面神经)的摄取)。

在某些实施例中，通过局部注射与静脉内投与来投与物质或调配物。举例来说，可以足够高浓度局部注射具有含肽组合物(例如含颗粒和非含颗粒组合物)的物质或调配物以用于成像目的。在某些实施例中，经静脉内投与非颗粒含肽组合物。在某些实施例中，在含颗粒组合物在足够用于成像目的的高浓度下过粘时，局部注射优于静脉内注射。

与当前所描述化合物相比，新环状肽或基于颗粒的产物可提供改良的光物理和神经结合性质比较。

在某些实施例中，与可通过注射仅简单荧光染料所实现者相比，通过这些途径中的一者或多者投与的神经结合肽官能化c点允许神经结构以高神经对肌肉对比最大程度地可视化，这是因为其具有优良多价增强、改良的靶位点结合/滞留和光物理特征。这些产物可与针对癌症靶(例如具有癌症的结节)的与肽结合的颗粒探针一起适用于多工应用。

在某些实施例中，可局部或通过静脉内途径投与可见染料(例如可见光谱中的染料，例如绿色染料，例如fitc)且可用于通过荧光信号观看神经。在某些实施例中，结合肽的可见染料优先附接到神经组织且来自染料的光可由外科医生以肉眼视力看到。举例来说，可将调配物局部施加到神经本身中或局部施加到神经附近，举例来说，可将调配物局部施加到周边神经干(例如在手术暴露之后毗邻转移性淋巴结或原发性肿瘤或其附近)，从而使得调配物的组合物自神经干扩散到神经组织的较小分支。光是由组合物的荧光剂发射，且可检测并显示(例如实时)，或可足够亮以用于由外科医生在手术程序期间以肉眼视力直接观察到。局部施加到神经组织(且随后扩算穿过神经组织)可提供较大对比，这是因为来自血蛋白(例如血红素)的背景信号将与调配物的静脉内投与相比有所减小。

实验性实例

线性和环状神经结合多肽-cy5偶联物的合成

在氯三苯甲基树脂上使用标准基于fmoc的固相肽合成(spss)方案来合成线性np41(图1a)和其环状类似物(图1b)。通过使用tfa:tis:edt:水(85:5:5:5)的混合剂裂解/去保护肽-树脂、随后进行反相hplc纯化来获得线性多肽。为制备环状类似物，去除n-末端fmoc基团，且然后在温和条件下使用六氟异丙醇从树脂裂解经完全保护的线性多肽。通过分子内偶合反应(其中n-末端和c-末端残基在溶液中发生接合，从而提供所需环状前体)来获得头对尾环状类似物。然后将粗制材料全面去保护且通过反相hplc纯化。使用此合成方式，易于获得所需51元大环肽产物。应注意，此大小的环状肽在合成上具有一定挑战性。然而，本文所使用方式提供具有优异纯度(例如大于95％)和良好产率(约40％)的环状产物。通过使用马来酰亚胺基-cy5修饰半胱氨酸残基的游离硫醇来对线性肽和环状肽进行荧光标记。通过lcms来表征和证实最终产物，如图1a到1d中所展示。

线性多肽-纳米颗粒偶联物(线性nbp-c’点)的合成

使用peg连接体部分将线性神经结合多肽(nbp)np41纳入c’点中。如表1中所展示，对于nbp-c’点来说，cy5染料的所测量光亮度至少大于游离多肽130％。

结合到离体人类坐骨神经组织

使用cy5标记线性肽和环状肽以及随机对照多肽(ac-shsstardlwphgkegc)且评价到离体人类神经组织试样的结合。所用组织试样是新切下且由国家疾病研究交流会(nationaldiseaseresearchinterchange，ndri)获得的尸体坐骨神经。在24孔板上制备组织试样，使用pbs洗涤，然后与50um线性、环状或乱序多肽在室温下一起培育。在15min之后，使用pbs对试样实施数轮洗涤。使用ivis光谱成像系统使板成像。如图2中所展示，总而言之，环状化合物与乱序和线性多肽相比对于坐骨神经样品展现显著增强的荧光强度(2-3倍)；且较肌肉组织展现选择性。

图5展示，将人类尸体坐骨神经切片成1‐cm长度片段且在室温下于肽或结合肽的c点的15μm溶液中培育80分钟，随后进行多次磷酸盐缓冲盐水洗涤。在培育后80分钟通过ivis光谱成像获得的所关注非侵袭区分析显示增加的光学信号(从最高到最低)：17-氨基酸(aa)残基肽官能化环状c点(上左)；17aa残基环状肽-染料偶联物(上右)；17aa残基线性肽-染料偶联物(中右)；17aa乱序环状肽官能化c点(下左)。后两种探针用作对照。

图6展示在肽-染料偶联物或肽官能化c点溶液中培育的神经和肌肉(对照)样品的离体荧光信号测量。将神经和肌肉组织样品在室温及轻微振荡下于15μm肽-染料偶联物或肽官能化c点溶液中培育80分钟，随后进行pbs洗涤。在ivis光谱上成像后，执行roi分析。条指示平均值+/-标准偏差。n＝5个/组。每一重复是来自一个生物实验，使用5个独立视场进行量化。与肌肉、组织样品相比，在神经中观察到较高荧光信号。针对17aa残基环状肽官能化c’点测得最大荧光信号，随后依次为17aa残基环状肽-染料偶联物、17aa残基线性肽‐染料偶联物和乱序环状肽官能化c点。与同类似探针培育的肌肉组织样品相比，在神经中观察到至少4到接近5倍大的信号。不期望受限于任一理论，数据表明，肽-染料偶联物和肽官能化c点都达成选择性摄取和滞留。

图7a和7b展示使用光学成像方法在与神经结合肽或肽官能化c点一起培育后摄取的时间依赖性信号变化。使用光学成像来评价与神经结合肽(例如环状、线性、乱序)或相应肽官能化c点一起培育的离体人类坐骨神经样品的时间变化性摄取。条指示平均值+/-标准偏差。n＝5个/组。每一重复是来自一个生物实验，使用5个独立视场进行量化。发现经培育神经样品中的相对归一化荧光信号相对于对照颗粒探针(例如结合肽的乱序c点)在20min时约为80％且在80％时接近100％。另外在与自然线性肽比较时，针对17aa环状肽官能化c点在20min时发现60％以上的信号(例如在80min时接近100％)。

图8展示肽序列长度和构象对神经结合/摄取性质的效应。将人类坐骨神经样品在具有环状构象的17aa、截短14-aa和截短10-aa残基肽序列的15μm溶液中培育以评估结合/摄取对序列特异性和构象的依赖性。使用线性17aa肽-染料偶联物测定构象的影响。利用环状形式的乱序肽作为对照。条指示平均值+/-标准偏差。n＝5个/组。每一重复是来自一个生物实验，使用5个独立视场进行量化。自横截面图像获取感兴趣区域。使用17aa环状肽-染料偶联物治疗观察到最大荧光信号，随后依次为14-aa环状肽-染料和10aa环状肽-染料偶联物。与17aa线性肽-染料偶联物治疗相比，使用17aa环状肽-染料偶联物治疗观察到变化大于2倍的光学信号。

图9a-9e展示肽序列长度和构象对神经结合/摄取的效应。在使人类坐骨神经切片与15μm肽-染料偶联物溶液一起培育后，评价选择性神经结合/摄取。将预培育神经组织包埋于oct中且在横截面中低温切片(20μm)。相对于线性和乱序肽构筑体，使用具有5×物镜和cy5滤光器设置的荧光显微术针对17aa残基环状肽-染料偶联物观察到最大荧光信号。所有cy5荧光图像都是在相同曝露和归一化设置下所获取。比例尺＝200μm。

图10a-10e展示与15μm神经结合肽官能化c点或肽一起培育80分钟的神经样品的荧光信号。洗涤经处理神经组织，在载玻片上低温切片(15μm)，且通过荧光显微镜(5×物镜)进行观察(图10a-10d)。在使用不同探针处理后，将感兴趣区域(roi)置于神经样品上。在依次与17aa环状肽官能化c点、17aa环状或线性肽-染料偶联物或乱序环状肽-染料官能化c点培育的样品中观察到荧光信号(最高到最低顺序，参见图10e)。

图11a和11b展示，使用倒置显微镜(×20)观察在17aa环状肽-染料偶联物溶液(15μm)中预培育80min的经低温切片的坐骨神经样品(20μm)。使用弗洛美林(fluoromyelin)绿(髓磷脂标记物)来共感染神经切片，随后进行pbs洗涤，且通过倒置显微镜(×20)进行扫描。成像结果展示肽与此髓磷脂标记物并不共局部化；据观察，17aa环状肽-染料偶联物主要涉及神经外膜和神经束膜，而在神经内膜内观察到相对较小程度的cy5信号。

与体内人类坐骨神经组织的结合

图12展示在注射400纳摩尔环状肽-染料偶联物后人类坐骨神经的时间依赖性体内荧光显微术。

图13a-13e展示使用光学成像在静脉内注射17aa环状肽-染料偶联物后来自坐骨神经和肌肉的体内时间依赖性摄取。将17aa环状肽-染料偶联物(cy5标记)经静脉内注射(400纳摩尔)到裸小鼠的尾部静脉中，然后进行手术暴露且使用具有荧光成像能力的哲思鲁马立体显微镜(zeisslumarstereomicroscope)(0.8×物镜)使坐骨神经和毗邻肌肉成像。获取注射前图像且在从注射后(p.i.)15min到240min的8个时间点获取连续注射后图像(明场，荧光)。条指示平均值+/-标准偏差。n＝5个/组。每一重复是来自一个生物实验，使用5个独立视场进行量化。在神经和肌肉区域中执行感兴趣区域(roi)分析以评价时间依赖性信号变化。图13a-13e分别展示神经(图13a和13b)和毗邻肌肉(图13b和13d)的绝对和相对荧光信号(例如在注射后15min时获取的初始荧光信号的百分比)。图13e展示时间变化性神经对肌肉或对比比率，其经4小时时段从约1.2增加到接近2.0，从而表明神经样品随时间变化具有选择性摄取和滞留。

图13a-13e展示，与来自(周围)肌肉的信号相比，环化肽提供来自神经的良好荧光信号。举例来说，来自神经组织的信号对来自肌肉组织的信号的比率越高，则神经组织与周围(背景)组织越易于目测区分(例如实时，手术中)。线性肽不同等高的比率。图13a-13e还展示，环化肽的信号持续时间长于线性肽，且来自神经组织与肌肉组织的信号比实际上随时间而增加。较长持续信号是有益的，这是因为外科医生在手术程序中更加自如。举例来说，药剂的投与未必发生于即将进行程序之前；而是，在可检测信号期间具有较长时间窗口。可在约15分钟之后检测信号，但神经/肌肉信号比实际上随时间变化而改良。可在投与之后长达至少数小时时检测信号。在人类中预计与在动物研究中使用类似时间段。

图14a-14b展示使用光学成像在静脉内注射17aa线性肽-染料偶联物后来自坐骨神经和肌肉的体内时间依赖性摄取。将17aa线性肽-染料偶联物(cy5标记)经静脉内注射(150纳摩尔)到裸小鼠的尾部静脉中，然后进行手术暴露且使用具有荧光成像能力的哲思鲁马立体显微镜(0.8×物镜)使坐骨神经和毗邻肌肉成像。获取注射前图像且在注射后(p.i.)的6个时间点(15min-150min)获取连续注射后图像(明场，荧光)。条指示平均值+/-标准偏差。n＝5个/组。每一重复是来自一个生物实验，量化，每一重复是来自一个生物实验，量化，(15min，6个时间，且肌肉区域以评价时间依赖性信号变化。图14a展示绝对神经荧光肌肉。可看到，荧光信号在30min时显著降到注射后水平的约15％；然后几乎不能看到信号，从而妨碍评估(数据未展示)。此外，图14a展示，来自线性肽的信号在投与之后30分钟减小到初始信号的10％。图14b展示相应时间变化性神经对肌肉或对比比率，所述比率在注射线性肽-染料偶联物后前30min内大致相等，从而表明坐骨神经样品相对于肌肉随时间变化具有选择性摄取和滞留。

图15展示在thy1-yfp转基因小鼠中注射150纳摩尔环状肽与线性肽-染料偶联物后人类坐骨神经的时间依赖性体内荧光显微术。

图16a-16e展示使用光学成像在静脉内注射17aa环状肽-染料偶联物后来自坐骨神经和肌肉的体内时间依赖性摄取。将17aa环状肽-染料偶联物(cy5标记)经静脉内注射(150纳摩尔)到裸小鼠的尾部静脉中，然后进行手术暴露且使用具有荧光成像能力的哲思鲁马立体显微镜(0.8×物镜)使坐骨神经和毗邻肌肉成像。获取注射前图像且在注射后(p.i.)的6个时间点(15min-150min)获取连续注射后图像(明场，荧光)。条指示平均值+/-标准偏差。n＝5个/组。每一重复是来自一个生物实验，使用5个独立视场进行量化。在神经和肌肉区域中执行感兴趣区域(roi)分析以评价时间依赖性信号变化。图16a-16d分别展示神经(图16a和16c)和毗邻肌肉(图16b和16d)的绝对和相对荧光信号(在注射后15min时获取的初始荧光信号的百分比)。图16e展示时间变化性神经对肌肉或对比比率，其经1.5小时时段从约1.3增加到接近2.6。不期望受限于任一理论，这些数据表明神经样品随时间变化具有选择性摄取和滞留。