本发明涉及涉及生物制剂领域，提供了一种核酸缓释佐剂及其制备和使用方法。
背景技术：
：传统免疫佐剂是油乳佐剂，能够提高灭活疫苗和蛋白抗原等的免疫原性和免疫保护能力，但与弱毒苗相比，仍存在很大的差距，往往达不到生产临床中需要的防治效果。一些激发先天性免疫反应的核酸片段如CpG-ODN能够代替传统的免疫佐剂，能够进一步增强免疫抗原的免疫原性和免疫保护作用。CpG-ODN是人工合成的含有非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的寡脱氧核苷酸(ODN)，是哺乳动物Toll样受体9(Toll-likereceptor9，TLR9)或鸡Toll样受体21(TLR21)的激动剂，它能直接激活B细胞和单核细胞(巨噬细胞和树突状细胞)，间接激活NK细胞和T细胞等多种免疫效应细胞，增强其功能和细胞因子的分泌，增强抗原的加工提呈，诱导Thl型免疫应答，产生较强的体液免疫和细胞免疫，增强特异性和非特异性免疫反应；已在人开展用于治疗肿瘤、过敏反应性疾病、感染性疾病和免疫功能低下的临床试验；其中国外对人免疫刺激活性最强的CpGODN7909被证明是一种高效低毒的新型免疫治疗剂和佐剂，并已申请专利。CpGODN作为免疫佐剂可同时诱导特异性及非特异性免疫反应，且与其他疫苗佐剂相比能够有效减少抗原的使用量，诱导免疫反应更加快速的产生，尤其是与弗氏佐剂相比能够更强烈的刺激Th1型免疫反应，具有粘膜佐剂的作用且可适用于鼠类及灵长类动物。目前CpGODN作为免疫佐剂已有多种应用：与蛋白抗原、病原微生物、肿瘤抗原联合使用均可增强免疫刺激作用，与铝盐佐剂联合使用时可将对机体造成的损害降至最低，且可诱导高滴度抗体。在不作为佐剂使用时，将非甲基化的CpG基序插入DNA疫苗中也可提高Th1型免疫应答活性。目前学界已发现了三种不同结构的CpGODN,分别为K型、D型和C型CpGODN。K型CpGODN又被称为B-ODN，其结构特征是含有一个三磷酸核苷酸的骨架以及多个未甲基化的CpG二核苷酸，且其两端特定结构为5’-TCpGTpT/ApT。CpG基序的甲基化以及其它核苷酸的插入会影响其对机体的免疫应答反应的激活。K型CpGODN能够刺激B细胞和单核细胞的增殖，以及IgM、IL-10、IL-6等细胞因子的分泌。D型CpGODN又被成为A-ODN，其结构特征是含一个嘌呤/嘧啶/CpG/嘌呤/嘧啶的回文结构，且该回文结构两端有3～4个自身互补碱基，3’端有一个polyG尾巴，可影响其在细胞内的定位及摄取。而无polyG尾巴的CpGODN可在机体内被TLR9识别，但其免疫刺激活性下降。能促进Ⅰ型干扰素的分泌及APCs的成熟。C型CpGODN的结构兼具K型和D型CpGODN的特点，同时包含5’-TCGTCG、GTCGTT和回文序列，其免疫刺激活性也同时兼具了前两种CpGODNs的功能。CpGDNA具有种属特异性，对于某一物种具有最佳免疫刺激效应的碱基基序适用于另一物种时并不一定能产生免疫刺激作用。根据已有报道，小鼠的最佳CpG序列含有两个5’嘌呤核两个3’嘧啶，而对人类有最佳免疫刺激活性的CpG基序是TCGTT/TCGTA。对畜禽以及其它动物尚缺乏系统研究。技术实现要素：针对现有技术中存在的缺失，本发明提供了一种核酸缓释佐剂及其制备和使用方法，该核酸缓释佐剂可用于增强动物疫苗免疫反应性，其包括如下组分：全硫代修饰的5‘-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’核酸分子；7号白油；硬脂酸铝和司本80，其制备方法为将白油和司本80分别按94％和6％体积比，硬脂酸铝按2％质量比混合，高压灭菌，冷却至50℃，按100μg/mL添加核酸分子，振摇混匀，其使用方法为接种时，与疫苗抗原等体积混合均匀，每头份肌肉或皮下注射1mL，间隔2-3周接种2-3次，能显著提高中和抗体效价和免疫保护力，具有很好的商品化开发前景。发明人首先根据文献报道，设计合成不同碱基长度和不同硫代化修饰的CpGODNs核酸分子，从这些分子中筛选出最佳免疫增强活性的CpG-ODNs核酸分子，该分子结构为：5‘-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’，其核苷酸序列如SeqIDNo:1所示，并经全部硫代化修饰；本发明所获得的CpGODNs核酸分子与畜禽动物疫苗联合接种动物后，较其它参与比较的核酸分子具有更好增强抗体生成的作用，如显著增加疫苗抗体滴度和抗体阳性百分率，也增加淋巴细胞增值指数和鸡toll样受体(TLR)21的表达。获得上述CpG-ODNs核酸分子后，发明人经过长期摸索，获得了核酸分子与白油等混合制备成核酸缓释佐剂。本发明核酸缓释佐剂的制备方法为：7号白油和司本80分别按94％和6％体积比混合，之后将硬脂酸铝按2％质量比加入到上述混合物中，116℃高压灭菌，冷却至50℃，用力振摇至透明状；之后再按100μg/mL添加的上述全部硫代化修饰的CpG-ODN，混匀，制备成油乳状。与现有技术相比，本发明核酸缓释佐剂形成的混合物较单一的核酸佐剂分子对机体作用时间进一步延长，一般可延长2-3周，而较单独使用7号白油和司本80形成的油乳佐剂相比，则可以针对机体抗原抗体反应进一步增加，可使新城疫病毒疫苗和禽流感病毒疫苗抗体滴度增加2-3个滴度(log2)，因此具有很好的商品化开发前景。且发明人进一步限定了核酸缓释佐剂中各组分的配比，在上述配比下，核酸缓释佐剂的功能得到进一步加强。本发明所提供的上述核酸缓释佐剂可与各种动物疫苗抗原包括灭活苗、亚单位疫苗、DNA疫苗以及弱毒苗等混合使用，并能增强它们各自的抗体反应性。除此之外，本发明海提供了所述核酸缓释佐剂的使用方法如下：所述核酸缓释佐剂与疫苗抗原等体积混匀，按0.5-1.0mL/羽(只)肌肉或皮下注射，每间隔2-3周加强免疫一次，可显著提高疫苗的抗体滴度和免疫保护力。综上所述，本发明获得了一种全新的核酸缓释佐剂及其制备和使用方法，能显著提高中和抗体效价和免疫保护力，具有很好的商品化开发前景。附图说明图1为不同碱基长度CpGODNs对免疫鸡只禽流感H5抗体滴度的影响结果示意图；图2为不同碱基长度CpGODNs对免疫鸡只ALV-J抗体水平的影响结果示意图；图3为不同硫代化修饰的CpGODNs对免疫鸡只禽流感H5抗体滴度的影响结果示意图；图4为不同硫代化修饰CpGODNs对免疫鸡只ALV-J抗体水平的影响结果示意图；图5为不同剂量CpG联合ALV-Jgp85重组蛋白接种种母鸡后诱导血清抗体的动态比较结果示意图；图6为不同剂量CpG与ALV-Jgp85重组蛋白免疫农大三号成年母鸡诱导血清抗体的动态变化结果示意图。具体实施方式实施例1CpGODNs核酸分子的合成设计的CpGODNs分子序列和结构，包括：全部硫代化修饰的CpG-I(5‘-TCGTCGTTTTGTCGTT-3’其核苷酸序列如SeqIDNo:2所示),CpG-II(5‘-TCGTCGTTTTGTCGTTTT-3’其核苷酸序列如SeqIDNo:3所示),CpG-III(5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3'其核苷酸序列如SeqIDNo:4所示)，CpG-IV(5‘-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’其核苷酸序列如SeqIDNo:1所示)以及仅对划线碱基硫代化修饰的CpG-S1(5‘-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’),CpG-S2(5‘-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’),CpG-S3(5‘-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’)。委托生物合成公司合成，合成后利用常规ULTRA-PAGE方法进行纯化。实施例2核酸缓释佐剂的制备本发明核酸缓释佐剂的制备方法为：7号白油和司本80分别按94％和6％体积比混合，之后将硬脂酸铝按2％质量比加入到上述混合物中，116℃高压灭菌，冷却至50℃，用力振摇至透明状；之后再按100μg/mL分别添加上述合成的几种CpG-ODN分子，等体积混匀，制备成油乳状，并将佐剂按照CpGODNs核酸分子的命名，分别命名为CpG-I,CpG-II,CpG-III，CpG-IV，CpG-S1,CpG-S2,CpG-S3。实施例3核酸缓释佐剂的效果验证使用实施例2中获得的CpGODNs核酸缓释佐剂(标记为CpG-IV即CpG-S3)与其它三种不同碱基长度(CpG-I,CpG-II,CpG-III)的全硫代修饰的CpGODNs核酸缓释佐剂进行比较试验。使用上述核酸佐剂分别与原核表达的ALV-Jgp85重组蛋白和AIV-H5灭活疫苗接种7日龄海兰褐雏鸡，于一免后2周进行2次加强免疫。首免后第1，2，3，4，5周采集血清，用IDEXXALV-J抗体检测试剂盒检测ALV-J血清抗体；同时用间接血凝抑制试验(HI)检测AIV-H9血清抗体滴度；第5周宰杀全部鸡只，取脾脏，使用MTT法检测脾淋巴细胞转化和荧光定量RT-PCR检测脾组织TOLL样受体的表达量。结果表明本发明的CpGODNs核酸缓释佐剂在增强雏鸡对AIV-H5和ALV-J基因工程亚单位疫苗免疫效果等方面较其它三种不同长度的CpGODNs佐剂具有更好的免疫增强效果，结果见图1和图2。使用本发明的CpGODNs核酸缓释佐剂(标记为CpG-S3)与其它两种不同硫代化修饰的相同碱基大小的CpGODNs佐剂(CpG-S1和CpG-S2)进行比较试验。10日龄海兰褐公鸡50只随机分为5组：CpG-S1组，CpG-S2组,CpG-S3组(本发明佐剂组)，无CpG组，对照组。CpG-S1组，CpG-S2组,CpG-S3组每只鸡分别腿部肌肉注射CpG-S1,CpG-S2,CpG-S3以及ALV-Jgp85重组蛋白和重组重组禽流感病毒(AIV)H5亚型二价灭活疫苗的混合乳化剂；无CpG组接种ALV-Jgp85重组蛋白和重组重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗的混合乳化剂；对照组每只腿部肌肉注射等量灭菌PBS溶液。一免后隔两周对每组鸡只进行二次加强免疫，免疫方法和剂量同前。在首次接种前1天及接种后第1、2、3、4周采集血清，-20℃储存用于抗体水平检测。用IDEXXALV-J抗体检测试剂盒检测ALV-J血清抗体；同时用间接血凝抑制试验(HI)检测AIV-H5血清抗体滴度；第5周宰杀全部鸡只，取脾脏，使用MTT法检测脾淋巴细胞转化和荧光定量RT-PCR检测脾组织TOLL样受体的表达量。结果表明本发明的CpGODNs核酸缓释佐剂在增强雏鸡对AIV-H5和ALV-J基因工程亚单位疫苗免疫效果和淋巴细胞转化能力方面较其它两种不同硫代化修饰的CpGODNs佐剂具有更好的免疫增强效果，结果见图3和图4所示。实施例4免疫剂量的确定200μg/只、100μg/只、50μg/只三个不同剂量的本发明核酸缓释佐剂分别与ALV-Jgp85重组蛋白免疫海兰褐种母鸡后均可诱导ALV-J的血清抗体，血清抗体滴度和抗体阳性率鸡只比率逐渐升高，抗体滴度在首免后28天和二次加强免疫后14天后出现峰值，各免疫组阳性鸡只比率在免疫后28天达最高。而所诱导的抗体效应出现明显的CpG剂量差异性，其中50μg组的剂量组诱导的血清抗体效价显著高于其它两个剂量组(P＜0.05)，阳性鸡只比率最高达92％(11/12)，结果见图5。将50μg/只、25μg/只、12μg/只、6μg/只和3μg/只五个不同剂量的本发明核酸缓释佐剂分别联合ALV-Jgp85重组蛋白，免疫接种“农大三号”成年母鸡后均可诱导ALV-J的血清抗体，抗体滴度和抗体阳性率均逐渐增加，各疫苗免疫组抗体滴度在首免后21天至35天时间内出现峰值，抗体阳性比率在首免后28天抗体阳性率接近最大；但各组所诱导的抗体效应也出现明显的CpG剂量差异性，其中50μg/只的剂量组抗体滴度和抗体阳性比率免疫效果最佳，结果见图6。实施例5对J亚群禽白血病病毒(ALV-J)免疫预防效果试验用制备的CpG核酸缓释佐剂与J亚群亲白血病病毒(ALV-J)重组亚单位疫苗抗原等体积混合，按1.0mL/羽(只)接种7日龄雏鸡，接种后第3周进行加强免疫接种一次，第8周进行攻毒试验，攻毒后观察3周。试验期间每周取血清检测ALV-J抗体，攻毒后检测ALV-J病毒血症和致病性，使用IFA检测脾脏组织的ALV-J分布。结果显示CpG缓释佐剂联合ALV-J亚单位疫苗抗原可使全部鸡只产生抗体，抗体阳性率为100％，ELISA效价S/P值可达3.30，产生高效价抗体维持在70天以上；针对攻毒后病毒血症的免疫保护率为67％(8/12)；另外，明显降低ALV-J的致病性。而ALV-Jgp85蛋白抗原与现有油乳佐剂混合后同等情况免疫接种有83.3％(5/6)的鸡只产生抗体,ELISA效价S/P值为1.2，维持时间仅为21天；针对病毒血症的免疫保护率仅为33.3％(4/12)。由此看出本核酸缓释佐剂能够明显提高ALV-J亚单位疫苗抗体反应和免疫保护效果。实施例6对网状内皮增生症病毒(REV)免疫预防效果试验用制备的CpG核酸缓释佐剂与网状内皮增生症病毒(REV)重组亚单位疫苗抗原等体积混合，按1.0mL/羽(只)的剂量肌肉注射13只7日龄雏鸡，间隔三周，加强免疫接种2次，三次免疫2周进行REV攻毒，试验期间每周收集血清样品并用美国IDEXXREV抗体试剂盒检测血清抗体，并对攻毒后的鸡只进行病毒血症和AIV-H9/NDV疫苗抗体、主要免疫器官发育指数进行检测，观察亚单位疫苗的免疫保护作用，评价亚单位疫苗的免疫保护效果。结果显示3次联合接种后能够诱导雏鸡产生持续增高的血清抗体，且抗体阳性率达到100％，对攻毒后雏鸡免疫保护率为100％(13/13)，对REV攻毒所造成的AIV/NDV疫苗免疫抑制等致病性具有明显的预防作用。而REV亚单位疫苗抗原与常规油乳佐剂(含铝盐)混合后免疫接种只能使62％(8/13)的鸡只产生阳性抗体，对病毒血症预防效果为85％(11/13)。由此看出本核酸缓释佐剂也能够明显提高REV亚单位疫苗抗体反应和免疫保护效果。当前第1页1 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