技术领域本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种基于碳酸钙、黄单胞菌多糖(商品名为黄原胶)、壳寡糖、2-苯氧基乙醇和聚山梨酯80(商品名为吐温80)为基础配方的兽用疫苗免疫佐剂及其制备与应用方法。
背景技术：
免疫佐剂是一种非特异性的免疫增强剂，当与抗原物质一起免疫动物或人体内时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。因此，在人用和兽用疫苗中普遍使用免疫佐剂来延长抗原在体内的存留时间，使抗原与淋巴系统细胞充分接触，刺激产生抗体，增强免疫效果。目前用于兽用疫苗的免疫佐剂有：弗氏佐剂、白油、铝胶等。其中弗氏佐剂因价格昂贵，仅适合实验室使用，不适合临床大面积推广，而且过于黏稠，难以注射。白油佐剂最大的缺点是需要加热提炼后方可使用，工序复杂，而且油相和水相容易分层(在4摄氏度低温的环境下尤甚)，不利于长期保存。铝胶佐剂的缺点是只能刺激Th1抗体的产生，不能刺激产生Th2抗体，因此在效果上不如弗氏佐剂和白油。上述三类佐剂，均属于传统佐剂，共同的缺点是免疫动物后在皮肤注射部位形成疤痕，而且佐剂本身容易引起微生物污染，从而造成免疫动物二次感染。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种兽用疫苗免疫佐剂及其制备与应用方法。为解决技术问题，本发明的解决方案是：提供一种兽用疫苗免疫佐剂，该兽用疫苗免疫佐剂是由多种组分混合而成的，其组分包括水溶性碳酸钙、聚山梨酯80、2-苯氧基乙醇、壳寡糖、黄单胞菌多糖和去离子水；其中，水溶性碳酸钙与去离子水的重量比为0.001％-0.01％，聚山梨酯80与去离子水的体积比为1-10％，2-苯氧基乙醇的终浓度为0.5-2.5％(体积比)，壳寡糖的终浓度为0.5-2％(重量比)，黄单胞菌多糖的终浓度为0.1％-2％(重量比)。本发明还提供了所述兽用疫苗免疫佐剂的制备方法，具体包括以下步骤：(1)将去离子水在121℃、15磅压力条件下灭菌30分钟，然后将水溶性碳酸钙按照重量比0.001％-0.01％的比例加入到去离子水中，搅拌混匀；(2)向步骤(1)所得溶液中加入聚山梨酯80，加入量控制为使其最终体积比浓度为1-10％，搅拌混匀；(3)向步骤(2)所得溶液中加入2-苯氧基乙醇并搅拌混匀，加入量控制为使其最终体积比浓度为0.5-2.5％；(4)向步骤(3)所得溶液中加入壳寡糖并搅拌混匀，加入量控制为使其最终重量比浓度为0.5-2％；(5)向步骤(4)所得溶液中加入黄单胞菌多糖并搅拌混匀，加入量控制为使其最终重量比浓度为0.1％-2％；(6)将步骤(5)所得溶液以100rpm的转速搅拌2小时，得到兽用疫苗免疫佐剂。本发明中，将步骤(6)得到的兽用疫苗免疫佐剂置于离心机中，以3000rpm的转速分别在室温和4℃条件下离心15分钟；若乳状物质不出现分层，即为质量合格的兽用疫苗免疫佐剂。本发明进一步提供了所述兽用疫苗免疫佐剂的应用方法，其特征在于，是将其与乳化或未乳化的灭活疫苗抗原配伍，其具体步骤为：(1)在搅拌条件下，将等体积的灭活疫苗抗原逐滴加入兽用疫苗免疫佐剂中，滴加完成后继续搅拌2小时，得到用于免疫的佐剂抗原复合物；(2)将步骤(1)所得的佐剂抗原复合物以3000rpm的转速分别在室温和4℃条件下离心15分钟，若不出现分层即表示符合质量要求；所述灭活疫苗抗原是指：猪链球菌、大肠杆菌、副猪嗜血杆菌、流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、禽包涵体肝炎病毒、鸭坦布苏病毒、小鹅瘟病毒、口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性乙型脑炎病毒、猪Delta冠状病毒、猪瘟病毒、小反刍兽疫病毒中的任意一种或几种。本发明进一步提供了所述兽用疫苗免疫佐剂的应用方法，是将其与未冻干的活疫苗抗原配伍，其具体步骤为：将等体积的活疫苗抗原以注射器加入兽用疫苗免疫佐剂中，然后利用注射器反复吸入、排出三次，即得到用于免疫的佐剂抗原复合物；所述活疫苗抗原指的是：流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、禽包涵体肝炎病毒、鸭坦布苏病毒、小鹅瘟病毒、口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性乙型脑炎病毒、猪Delta冠状病毒、猪瘟病毒、小反刍兽疫病毒中的任意一种或几种。本发明进一步提供了所述兽用疫苗免疫佐剂的应用方法，是将其与冻干的活疫苗抗原配伍，其具体步骤为：将活疫苗抗原中加入与兽用疫苗免疫佐剂等体积的无菌水或生理盐水中，再用注射器将混合物加入兽用疫苗免疫佐剂中；然后利用注射器反复吸入、排出三次，即得到用于免疫的佐剂抗原复合物；所述活疫苗抗原指的是：流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、禽包涵体肝炎病毒、鸭坦布苏病毒、小鹅瘟病毒、口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性乙型脑炎病毒、猪Delta冠状病毒、猪瘟病毒、小反刍兽疫病毒中的任意一种或几种。发明原理描述：本发明所述兽用疫苗免疫佐剂是基于壳寡糖和多糖复合物组成的免疫增强剂；该多糖系黄单胞菌多糖，是来自野油菜黄单胞菌菌发酵产物，该发酵产物具有天然乳化剂性质。壳寡糖是一种将壳聚糖发酵降解后形成的分子量在5000道尔顿左右的几丁多糖，具有增强免疫效果的功能。由于本发明采用的黄单胞菌多糖与几丁多糖混合后形成的多孔状乳状物，因此可以均质悬浮并包裹各种油包水或水包油疫苗抗原，不会形成传统佐剂中油相和水相的分层现象，从而可以使抗原成分更加稳定，不会失效。为了克服传统佐剂本身容易引起的微生物污染问题，本发明在配方中引入了一种特殊的保护剂：2-苯氧基乙醇。2-苯氧基乙醇是一种对多种革兰氏阳性和阴性菌均具有杀灭作用的防腐剂，其在低浓度下即具有杀菌作用，因此可以保证乳剂不会发生微生物污染。此外，本发明还在配方中引入了聚山梨酯80。聚山梨酯80是一种表面活性剂，可以增加油性或脂类抗原物质的乳化效果。上述组分经特别设计的添加顺序和配伍工艺，产生了特别的配伍效应：即利用多糖的免疫增强特性、乳化特性以及2-苯氧基乙醇的抗菌活性。尤其是壳寡糖和黄单胞菌多糖混合后，寡糖分子镶嵌在多糖分子形成的孔状物结构内，彼此在分子构象上更加稳定，且在后续使用过程中与抗原物质混合时，可以刺激抗原的免疫效果并延长抗原在体内的释放时间。由于细菌和病毒等抗原性生物分子带有负电荷，本配方中引入的碳酸钙中钙离子可以和抗原性分子形成更强的亲和力，并可以利用细胞膜上的钙离子通道，增加抗原递呈效果。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明可以增强淋巴细胞对A、B和H抗原的识别能力，促进多种抗原和抗体结合，增强免疫应答水平和抗原递呈能力。此外，该佐剂与传统佐剂相比，在低温和室温下均保持稳定状态，本身具有抗菌能力，不会造成免疫后的二次感染。本发明配方中的所有原料，易于获取、乳化和溶解，不用加热提炼，因此易于制备。同时采用新型防腐剂，因此可以室温长期保存。本发明中的所有原料成本低，因此制备的佐剂可以大面积推广应用。与传统的佐剂相比，本发明中的免疫佐剂具有制备方便，稳定性好，效果强、易保存、使用方便、适用广等优点，可以在兽用生物制品领域得到广泛应用。具体实施方式本发明通过提供一种基于壳寡糖和多糖复合物组成的免疫增强剂，混合后形成的一种多孔乳状物，可以均质悬浮并包裹各种油包水或水包油抗原。配方中引入一种对多种革兰氏阳性和阴性菌均具有杀灭作用的防腐剂2-苯氧基乙醇，对动物使用安全可靠，不会发生二次感染，因此佐剂本身可以长期保存。本发明还在配方中引入了聚山梨酯80，增加油性或脂类抗原物质的乳化效果。本发明中，各原料的反应浓度会在本发明约定的浓度范围内略有变化。禽用或体重在10公斤以下的动物使用本发明中各原料约定的下限浓度范围；猪、牛、羊或体重在100公斤以上的动物使用本发明中各原料约定的上限浓度范围。体重在10-100公斤之间的动物，尽管可以按照原料上限和下限之间的范围等比例递增或递减，但免疫效果无显著差异。以下的实施例可以使本专业技术领域的技术人员更全面的了解本发明，但不以任何方式限制本发明。本发明中佐剂的制备方法：以下所有操作，请在净化级别在万级以上或通过GMP认证的厂房内进行扩大化生产：(1)将水溶性碳酸钙按照0.001％-0.01％(重量比)的比例加入到已经过高压灭菌(121℃，15磅压力，灭菌30分钟)的去离子水中，搅拌混匀；(2)将吐温80按照1-10％(体积比)的比例加入到已经过高压灭菌的去离子水中，于反应釜中轻轻搅拌混匀，室温搅拌30分钟至完全溶解；(3)向反应釜中加入终浓度为0.5-2.5％(体积比)的2-苯氧基乙醇，轻轻搅拌混匀，室温搅拌10分钟；(4)向反应釜中加入终浓度为0.5-2％(重量比)的壳寡糖，轻轻搅拌混匀，室温搅拌10分钟；(5)加入终浓度为0.1％-2％的黄原胶(重量比)，按照100rpm的转速，室温搅拌2小时至完全溶解，混匀即为新型兽用疫苗免疫佐剂；(6)取5毫升免疫佐剂于15毫升离心管中，按照3000rpm的转速设置分别在室温和4摄氏度参数设置下离心15分钟，若乳状物质不出现分层即为质量合格的免疫佐剂。本发明中的免疫佐剂成品，密封后若置于室温、通风、干燥条件下，保存期为2年；若置于通风、冷藏条件下，保存期为4年。实施例1：佐剂的制备(禽用)(1)将水溶性碳酸钙按照0.001％(重量比)的比例加入到已经过高压灭菌(121℃，15磅压力，灭菌30分钟)的去离子水中，搅拌混匀；(2)将吐温80按照1％(体积比)的比例加入到已经过高压灭菌的去离子水中，于反应釜中轻轻搅拌混匀，室温搅拌30分钟至完全溶解；(3)向反应釜中加入终浓度为0.5％(体积比)的2-苯氧基乙醇，轻轻搅拌混匀，室温搅拌10分钟；(4)向反应釜中加入终浓度为0.5％(重量比)的壳寡糖，轻轻搅拌混匀，室温搅拌10分钟；(5)加入终浓度为0.1％的黄原胶(重量比)，按照100rpm的转速，室温搅拌2小时至完全溶解，混匀即为新型兽用疫苗免疫佐剂；(6)取5毫升免疫佐剂于15毫升离心管中，按照3000rpm的转速设置分别在室温和4摄氏度参数设置下离心15分钟，若乳状物质不出现分层即为质量合格的免疫佐剂。本发明中的免疫佐剂成品，密封后若置于室温、通风、干燥条件下，保存期为2年；若置于通风、冷藏条件下，保存期为4年。实施例2：佐剂的制备(猪、羊用)(1)将水溶性碳酸钙按照0.005％(重量比)的比例加入到已经过高压灭菌(121℃，15磅压力，灭菌30分钟)的去离子水中，搅拌混匀；(2)将吐温80按照5％(体积比)的比例加入到已经过高压灭菌的去离子水中，于反应釜中轻轻搅拌混匀，室温搅拌30分钟至完全溶解；(3)向反应釜中加入终浓度为1％(体积比)的2-苯氧基乙醇，轻轻搅拌混匀，室温搅拌10分钟；(4)向反应釜中加入终浓度为1％(重量比)的壳寡糖，轻轻搅拌混匀，室温搅拌10分钟；(5)加入终浓度为0.5％的黄原胶(重量比)，按照100rpm的转速，室温搅拌2小时至完全溶解，混匀即为新型兽用疫苗免疫佐剂；(6)取5毫升免疫佐剂于15毫升离心管中，按照3000rpm的转速设置分别在室温和4摄氏度参数设置下离心15分钟，若乳状物质不出现分层即为质量合格的免疫佐剂。本发明中的免疫佐剂成品，密封后若置于室温、通风、干燥条件下，保存期为2年；若置于通风、冷藏条件下，保存期为4年。实施例3：佐剂的制备(牛用)(1)将水溶性碳酸钙按照0.01％(重量比)的比例加入到已经过高压灭菌(121℃，15磅压力，灭菌30分钟)的去离子水中，搅拌混匀；(2)将吐温80按照10％(体积比)的比例加入到已经过高压灭菌的去离子水中，于反应釜中轻轻搅拌混匀，室温搅拌30分钟至完全溶解；(3)向反应釜中加入终浓度为2.5％(体积比)的2-苯氧基乙醇，轻轻搅拌混匀，室温搅拌10分钟；(4)向反应釜中加入终浓度为2％(重量比)的壳寡糖，轻轻搅拌混匀，室温搅拌10分钟；(5)加入终浓度为2％的黄原胶(重量比)，按照100rpm的转速，室温搅拌2小时至完全溶解，混匀即为新型兽用疫苗免疫佐剂；(6)取5毫升免疫佐剂于15毫升离心管中，按照3000rpm的转速设置分别在室温和4摄氏度参数设置下离心15分钟，若乳状物质不出现分层即为质量合格的免疫佐剂。本发明中的免疫佐剂成品，密封后若置于室温、通风、干燥条件下，保存期为2年；若置于通风、冷藏条件下，保存期为4年。实施例4：佐剂的使用(与乳化或未乳化的灭活疫苗抗原配伍)以下程序中的灭活疫苗抗原指的是：猪链球菌、大肠杆菌、副猪嗜血杆菌、流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、禽包涵体肝炎病毒、鸭坦布苏病毒、小鹅瘟病毒、口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性乙型脑炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪Delta冠状病毒、猪瘟病毒、小反刍兽疫病毒中的任意一种或几种。以下所有操作，请在净化级别在万级以上或通过GMP认证的厂房内进行扩大化生产。(1)将等体积的抗原物质逐滴加入免疫佐剂中，边加边搅拌。物料加完，继续搅拌2小时；(2)按照3000rpm的转速设置分别在室温和4摄氏度参数设置下离心15分钟，若混合物不出现分层即为质量合格的佐剂抗原复合物。(3)该佐剂抗原复合物可以直接使用。如不立即使用，密封后若置于室温、通风、干燥条件下，保存期为2年；若置于通风、冷藏条件下，保存期为4年。实施例5：佐剂的使用(与未冻干的活疫苗抗原配伍)以下程序中的活疫苗抗原指的是：流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、禽包涵体肝炎病毒、鸭坦布苏病毒、小鹅瘟病毒、口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性乙型脑炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪Delta冠状病毒、猪瘟病毒、小反刍兽疫病毒中的任意一种或几种。本发明中的佐剂，不适合与细菌类未冻干的活疫苗抗原配伍。活疫苗苗抗原与佐剂混合后，必须在1个小时内使用完毕，不可进行长时间储存；因此建议在疫苗免疫现场混合，立即使用。(1)将等体积的抗原物质，利用注射器加入免疫佐剂中，利用注射器反复吸入、排出3次，即可混匀。(2)请在1个小时内使用完毕。实施例6：佐剂的使用(与冻干的活疫苗抗原配伍)以下程序中的活疫苗抗原指的是：流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、禽包涵体肝炎病毒、鸭坦布苏病毒、小鹅瘟病毒、口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性乙型脑炎病毒、猪Delta冠状病毒、猪瘟病毒、小反刍兽疫病毒中的任意一种或几种。本发明中的佐剂，不适合与细菌类冻干的活疫苗抗原配伍。活疫苗苗抗原与佐剂混合后，必须在1个小时内使用完毕，不可进行长时间储存；因此建议在疫苗免疫现场混合，立即使用。(1)将冻干的活疫苗抗原中加入与免疫佐剂等体积的无菌水(或生理盐水)，利用注射器加入免疫佐剂中，利用注射器反复吸入、排出3次，即可混匀。(2)请在1个小时内使用完毕。以上是结合具体实施例子对本发明所做的进一步描述。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的前提下，本发明及其应用还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。