技术领域本发明属于天然药物技术领域，涉及一种治疗糖尿病肾病的天然药物组合，特别涉及一种由矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyanidin-3-O-glucosidechloride，简称矢车菊苷)和莫诺苷(morroniside)配合而成的药物组合及其制法和用途。
背景技术：
糖尿病肾病(diabeticnephropathy，DN)，又称糖尿病肾小球硬化症，是糖尿病常见的慢性微血管并发症，通常指由于糖尿病引起的肾小球基底膜增厚，系膜扩张以及胞外基质增生，导致肾小球的高滤过和蛋白尿，其特点以肾小球血管受损、硬化为主，形成结节性病变，进而出现肾功能的异常，最终形成终末期肾衰(ESRD)，终末期肾衰是DN病人的主要死亡原因之一。目前，临床上还没有针对性治疗糖尿病肾病的天然药物。一般用降糖药代替，如二甲双胍、格列吡嗪等，多为西药，均有一定副作用，具有肝肾功能损伤的患者不能服用。有文献报道了莫诺苷等环烯醚萜苷类可治疗糖尿病，但无防治糖尿病肾病的药物组合出现，且对于矢车菊苷治疗糖尿病肾病也无相关报道。如今，糖尿病肾病是导致糖尿病患者产生并发症死亡的主要病因，因此，研究开发一种能够防治糖尿病肾病的特效药显得尤为重要和紧迫。
技术实现要素：
鉴于现有研究的不足，本发明的目的在于，通过对矢车菊苷和莫诺苷的理化性质及药效作用进行研究，提供一种天然药物组合，解决临床上无治疗糖尿肾病的特效药问题。为了达到本发明的目的，发明人通过大量实验研究，获得如下技术方案：一种治疗糖尿病肾病药物组合，含有矢车菊苷单体和莫诺苷单体，所述组合中单体的重量配比为1∶3～5∶1，最佳配比为1∶1。上述药物组合的制备方法的主要步骤为：(1)矢车菊苷单体成分从桑葚(MorusalbaL.的果穗)中分离得到。将桑葚药材，用30％乙醇(＜60℃)提取，提取物经大孔树脂及反相硅胶柱色谱分离，得矢车菊苷单体。(2)莫诺苷单体成分从山茱萸(CornusofficinalisSieb.etZucc.)或忍冬藤(LonicerajaponicaThunb.)中提取分离得到。将山茱萸或忍冬藤药材，以50％乙醇提取，提取物经大孔树脂及反相硅胶柱分离，得莫诺苷单体。(3)将矢车菊苷单体和莫诺苷单体按1∶1的重量比配合均匀，即得本发明的药物组合。上述药物组合，所述的大孔树脂为D101、XAD-6、LSA-10或其它类似树脂。上述药物组合，所述的反相硅胶为ODS-AG，50μm或其它类似色谱材料。本发明是经过反复的筛选实验最终获得的成果。与目前研究现状比较，本发明涉及的治疗糖尿病肾病的药物组合具有以下优点和显著进步：(1)首次将矢车菊苷和莫诺苷配合，研制成治疗糖尿病肾病的天然药物组合，弥补了临床上用药的缺乏。(2)通过先进的分离技术获得纯度大于98％的矢车菊苷单体成分和莫诺苷单体成分，二者成分结构明确，由此制备成的药物制剂，生物利用度高。(3)药理试验结果显示，本发明的药物组合在治疗糖尿病肾病方面，与单一的矢车菊苷或单一的莫诺苷相比，疗效明显提高，具有显著性差异。(4)制备工艺相对简单，适合医药工业生产。具体实施方式以下为本发明涉及的治疗糖尿病肾病药物组合的具体制备实例，旨在对本发明的技术方案作进一步描述，但本发明的保护范围并不局限于这些实施例。凡与本发明思路类同的改变或替代方法均包括在本发明的保护范围之内。实施例1治疗糖尿病肾病药物组合物的制备1.取桑葚药材500g，用6倍量30％乙醇在60℃以下提取1小时，药渣再加4倍量30％乙醇提取0.5小时。合并2次滤液，减压浓缩至500ml。2.将上述醇提物经LSA-10大孔树脂分离，收集合并5％、15％乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至500ml。3.将上述浓缩物上样于ODS-AG50μm反相硅胶柱，以甲醇-水系统梯度洗脱，收集甲醇-水(5∶90)洗脱部位，合并减压浓缩，经冷冻干燥后重结晶，得矢车菊苷单体成分(纯度≥98％)。4.取山茱萸或忍冬藤药材500g，用6倍量50％乙醇回流提取1小时，过滤。药渣再加4倍量50％乙醇回流提取0.5小时，过滤。合并2次滤液，回收溶剂，浓缩至500ml。5.将上述醇提物，上样于D101或XAD-6型大孔树脂上，依次用6倍量水、10％乙醇、30％乙醇洗脱，收集合并10％及30％乙醇洗脱液；回收乙醇，浓缩至500ml。6.把上述提取物上样于ODS-AG50μm反相硅胶柱，以甲醇-水系统梯度洗脱，收集甲醇-水(9∶1)洗脱部位，收集液经冷冻干燥后重结晶，得莫诺苷单体(纯度≥98％)。7.将上述矢车菊苷单体和莫诺苷单体按重量配比(1∶1)混合均匀，即得治疗糖尿病肾病的药物组合物。实施例2治疗糖尿病肾病药物组合物的制备1.取桑葚药材1000g，用6倍量30％乙醇在60℃以下提取1小时，药渣再加4倍量30％乙醇提取0.5小时。合并2次滤液，浓缩至1000ml。2.将上述醇提物经LSA-10大孔树脂分离，收集合并5％、15％乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至1000ml。3.将上述浓缩物上样于ODS-AG50μm反相硅胶柱，以甲醇-水系统梯度洗脱，收集甲醇-水(5∶90)洗脱部位，合并减压浓缩，经冷冻干燥后重结晶，得矢车菊苷单体(纯度≥98％)。4.取山茱萸或忍冬藤药材1000g，用6倍量50％乙醇回流提取1小时，过滤。药渣再加4倍量50％乙醇回流提取0.5小时，过滤。合并2次滤液，回收溶剂，浓缩至1000ml。5.将上述醇提物，上样于D101或XAD-6型大孔树脂上，依次用6倍量水、10％乙醇、30％乙醇洗脱，收集合并10％及30％乙醇洗脱液；回收乙醇，浓缩至1000ml。6.把上述提取物上样于ODS-AG50μm反相硅胶柱，以甲醇-水系统梯度洗脱，收集甲醇-水(9∶1)洗脱部位，收集液经冷冻干燥后重结晶，得莫诺苷单体(纯度≥98％)。7.将上述矢车菊苷单体和莫诺苷单体按重量配比(1∶1)混合均匀，即得治疗糖尿病肾病药物组合物。实验研究LN、FN和COL-IV法测定矢车菊苷、莫诺苷及药物组合对高糖环境下肾系膜细胞的影响摘要目的：观察矢车菊苷、莫诺苷及药物组合对糖尿病肾系膜细胞的影响。方法：体外培养大鼠肾小球系膜细胞(GMC)，用高糖刺激GMC使造成损伤，测定GMC受损后释放FN、COL-IV、LN水平的变化。结果：与模型组比较，不同剂量的矢车菊苷、莫诺苷及药物组合，在均可抑制高糖受损的肾小球系膜细胞释放LN、FN和COL-IV，但药物组合组明显大于矢车菊组及莫诺苷组，具有显著性差异。结论：矢车菊苷和莫诺苷两个成分单独对糖尿病肾系膜细胞具有一定的保护作用，但两者1∶1配伍后对肾系膜细胞的保护作用更强，与膜型组相比具有显著性差异。1实验材料1.1细胞株大鼠肾小球系膜细胞株(GMC)，购自中国典型培养物保藏中心。1.2试剂磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)，福州迈新生物技术开发有限公司，批号ZLI-9062；DMEM低糖培养液，美国Hyclone公司，批号；NXE0644；胰蛋白酶(Trypsin-EDTA)，美国Gibco公司，批号1369113；胎牛血清，杭州四季青公司，批号130905；双抗(青霉素-链霉素溶液)，上海碧云天生物技术有限公司，批号C0222；无水乙醇，南京化学试剂有限公司，批号：13031310316。1.3试剂盒层粘连蛋白(LN)试剂盒，国外进口，批号：13051603；纤维连接蛋白(FN)试剂盒，国外进口，批号：13051602；IV型胶原(COL-IV)试剂盒，国外进口，批号：13051601。1.4仪器滤器(0.22μm)，MilliPORE公司；细胞培养板、细胞培养瓶，美国Corning公司；全自动细胞计数器，Countstar公司；电子分析天平(FA1104)，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；立式自动电热压力蒸汽灭菌器(LDZX-50KBS)，上海申安医疗器械厂；电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9023A型)，上海精宏实验设备有限公司；电热恒温振荡水槽(DKZ-2型)，上海精宏实验设备有限公司；低速离心机(LD25)，北京医用离心机厂；净化工作台(SW-CJ-IF)，苏州净化设备有限公司；CO2恒温细胞培养箱，日本三洋电器；光学显微镜(CKX31)，OLYMPUS公司；超纯水系统(Direct-Q)，MilliPORE公司；-20℃冰箱，青岛海尔集团公司；-80℃冰箱，日本SANYO公司；酶标仪(SynergyHT)，美国Bio-Tek公司。2统计方法实验数据采用SPSS17.0统计软件分析完成。计量数据资料先进行正态分布检验，符合正态分布者，两组间比较采用独立t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以p＜0.05、p＜0.01作为显著性和极显著性差异的标准。3实验方法3.1大鼠肾小球系膜细胞的培养大鼠肾小球系膜细胞常规培养于含10％胎牛血清的DMEM低糖培养液中，培养条件为37℃、饱和湿度5％CO2，于倒置显微镜观察细胞生长情况。待细胞接近融合状态时(约80％)，吸除旧培养基，用5mLPBS漂洗2次后，加入1mL含EDTA的0.25％胰蛋白酶消化1min，在显微镜下观察，待胞质回缩、细胞间隙增大且有部分细胞脱落时，加入2mL含10％FBS的DMEM低糖培养液终止消化，并吹打均匀。将细胞悬液转移至15mL尖底离心管中，800rpm离心5min，弃上清，加入含10％FBSDMEM低糖培养液按1∶2～1∶3的比例进行传代培养，每2～3d换液一次，传至5～7代可用于实验。3.2高糖损伤GMC后FN、COL-IV、LN水平的变化取对数生长期的GMC，用含10％FBS的DMEM低糖培养基以5×104个/mL密度接种于48孔板中，并设4个复孔。在37℃、5％CO2条件下静置培养24h。当细胞融合80％～90％时，换无血清的DMEM低糖培养液饥饿培养24h，使细胞同步于G0期，随后根据分组加入不同的特征成分及药物预处理1h，再加入高糖刺激相应组别。孵育细胞24h后取细胞培养上清液，测定细胞上清液中LN、FN、COL-IV的含量。4实验结果4.1不同浓度AGEs刺激24h对LDH的影响结果显示：加入高糖刺激(30mmol/L)能增加GMC释放的LN，与空白对照组比较有显著性差异(p＜0.01)，各给药组均能使LN的释放明显减少(p＜0.01；p＜0.05)，且MC组作用最强(p＜0.01)。不同浓度AGEs刺激24h对LN的影响(n＝3)4.2不同浓度AGEs刺激24h对FN的影响结果显示：加入高糖刺激(30mmol/L)能增加GMC释放的FN，与空白对照组比较有显著性差异(p＜0.01)，各给药组均能使FN的释放明显减少(p＜0.01；p＜0.05)，且MC组作用最强(p＜0.01)。不同浓度AGEs刺激24h对FN的影响(n＝3)##p＜0.01vs.Normal；*p＜0.05，**p＜0.01，vs.Model4.3不同浓度AGEs刺激24h对COL-IV的影响结果显示：加入高糖刺激(30mmol/L)能增加GMC释放的COL-IV，与空白对照组比较有显著性差异(p＜0.01)，各给药组均能使COL-IV的释放明显减少(p＜0.01；p＜0.05)，且MC组作用最强(p＜0.01)。不同浓度AGEs刺激24h对COL-IV的影响(n＝3)##p＜0.01vs.Normal；*p＜0.05，**p＜0.01，vs.Model5结论本试验经过反复的实验研究，比较了数十种药物单体成分及不同剂量的配伍组合，筛选出矢车菊苷和莫诺苷对糖尿病肾系膜细胞抗损伤作用效果较好，并最终确定两者1∶1配伍的药物组合对降低糖尿病肾系膜细胞的损伤作用明显大于单一矢车菊组及单一莫诺苷组，与模型组相比，具有显著性差异。以上3个药理实验结果为本发明提供了可靠的科学依据。