技术领域本发明属于医药技术领域，主要涉及树莓果实冻干粉或其提取物(包括树莓成熟果实，树莓叶片提取物)在制备治疗急/慢性炎性肠道疾病药物制剂中的应用。
背景技术：
炎性肠病，简称IBD，是一种特殊的慢性肠道炎症性疾病，主要包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)。临床上，患者会表现为反复的腹痛、腹泻、粘液、血便，甚至出现各种全身并发症，如视物模糊、关节疼痛、皮疹等。在美国，大约有140万美国人患有炎性肠道疾病(IBD)，而且每年有3万新增病例；溃疡性结肠炎可以在大肠上皮层促使验证和溃疡，而且溃疡性结肠炎可以增加患者结肠直肠癌的风险。近30年来，我国IBD发病率有不断攀升的趋势。根据国内文献报道，近5年的病例数是上世纪90年代同期的8倍，IBD已逐渐成为我国消化科的常见病。IBD患者肠道不能正常吸收进食的碳水化合物、蛋白质、脂肪、维生素及多种微量元素，加上肠道炎症或服用的药物可能造成食欲不佳，因此IBD常伴随着不同程度的营养不良，甚至影响小孩正常的生长发育。营养支持对IBD症状缓解及促进愈合有重要的作用，因此保持自身良好的营养状态是治疗IBD一个重要的部分。IBD并没有存在专门的特殊饮食，不同人能耐受的食物有异，因此IBD总的饮食原则是保证自己膳食平衡同时避免一些使疾病恶化的食物。因此开发针对炎性肠道疾病的药物是本领域不断研发的方向。专家认为，炎性肠病并不可怕，只要养成健康的生活方式，保证进食、休息、用药规律，定期随访监测病情，炎性肠病通过免疫治疗，生物治疗及营养支持治疗，以及一些小分子化合物的应用及联合应用是可以控制的。树莓是蔷薇科悬钩子属的多年生落叶半灌性果树，因其成熟果实颜色有黑色、红色及黄色，而分别称为红树莓，黑树莓和黄树莓，作为第三代水果，其营养丰富而齐全，含有多种易被人体吸收和人体不可缺少的营养元素。如维生素C的含量是苹果的5倍，氨基酸及铁、锌磷等含量高于苹果和葡萄，特别是含有的生物活性的化学物质种类繁多。现有技术中，并未有树莓或其提取物在治疗急/慢性炎性肠道疾病的相关的报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供树莓冻干粉或其提取物在防治以肠道菌群代谢紊乱，肠壁溃疡损伤及肥大细胞过度激活为主要特征的急/慢性炎性肠道疾病中的应用。本发明，以树莓冻干粉或其提取物为有效成分，其总有效剂量为：树莓冻干粉20-40g/天，树莓冻干粉提取物1-100mg/kg/天。本发明，树莓冻干粉或其提取物可单独应用，也可以和临床上炎性肠病治疗通用的肠内营养剂联合应用。本发明，将树莓冻干粉或其提取物与药学上可接受的赋型剂混合制成药用剂型。所述的药用剂型为口服剂型。所述口服剂型是片剂、粉剂、悬浊液、乳浊液、胶囊、颗粒剂、糖衣片、药丸、液体、糖浆或柠檬水剂。本发明的有益效果是：本发明，通过对体内炎性肠道疾病小鼠模型的炎症改善作用及小鼠粪便菌群的分析研究发现，树莓冻干粉或其提取物对于炎症因子的异常升高有显著降低作用，对于炎性肠道疾病模型鼠中肠道致病细菌起到了明显的抑制作用，并且对肠道有益菌如丁酸盐产生菌起到了促进作用。结果表明，树莓冻干粉或其提取物可以通过调控肠道菌群进而对炎性肠道疾病有显著的治疗作用。附图说明图1是树莓提取物对于炎性肠病小鼠粪便DNA基于T-rflp图谱聚类分析树状图。图2是树莓提取物对有益菌奈瑟氏菌属的作用图；*p＜0.05vs模型组,**p＜0.01vs模型组。图3是树莓提取物对有益菌丁酸盐产生菌的作用图；*p＜0.05vs模型组,**p＜0.01vs模型组。图4是树莓提取物对致病菌弯曲杆菌的作用图；*p＜0.05vs模型组,**p＜0.01vs模型组。图5是树莓提取物对致病菌拟杆菌属的作用图；*p＜0.05vs模型组,**p＜0.01vs模型组。图6是细菌T-rflp分析显著性片段。图7是树莓提取物对炎性肠病小鼠肠内炎性细胞因子异常升高的抑制作用图。图8是不同浓度树莓提取物对于炎性肠病小鼠粪便体外扩培养菌群的抑制作用图。具体实施方式实施例1树莓提取物在制备治疗急/慢性炎性肠道疾病药物中的应用(一)黑树莓成熟果实提取物(BRBFE)将黑树莓成熟果实捣碎，过0.02英寸孔径筛网，过滤去籽，制成果泥，果泥倒入于表面涂布聚乙烯薄膜的1英寸的冷冻干燥盘中，在通风的冷冻室中保存。进一步通过升华器进行冷冻干燥，得黑树莓果实冻干粉。将黑树莓果实冻干粉加入乙醇：水(80:20)溶剂，浸泡提取，温度25℃；时间10h；乙酸乙酯萃取去除果实中脂肪类成分，减压回收溶剂后得到黑树莓成熟果实提成取物(BRBFE)。(二)模型溃疡性结直肠炎性小鼠模型的建立1.4-6周龄C57BL/J小鼠，随机分组，设空白对照组，模型组，实验组(两个剂量：5％和10％)共四组。空白对照组和模型组小鼠食用普通饲料，实验组小鼠食用BRBFE。2.根据小鼠体重给予腹腔注射氧化偶氮甲烷(Azoxymethane,AOM)，第1、8天，模型组和实验组小鼠腹腔注射AOM，注射剂量为10mg/kg。3.模型组和实验组小鼠2％葡聚糖硫酸钠(DextranSodiumnsulfate,DSS)摄水，连续7天，第8天，换正常的饮水持续14天。空白对照组为正常饮用水。4.2％DSS摄水共3个循环，即1、4、7周分别为2％DSS摄水，其他时间均为正常饮水。(三)BRBFE对于炎性肠病小鼠粪便DNA基于T-rflp聚类分析研究空白对照组和模型组小鼠食用普通饲料，实验组小鼠食用BRBFE。模型组和实验组小鼠2％DSS摄水，连续7天，第8天，换正常的饮水持续14天。空白对照组为正常饮用水。2％DSS摄水共3个循环，即1、4、7周分别为2％DSS摄水，其他时间均为正常饮水。小鼠处死后，挑拣肠道内新鲜粪便，按照试剂盒说明书提取小鼠粪便中DNA。T-rflp方法用三种酶(HaeIII、HhaI和MSPI)分析菌群变化情况。对检测结果做T-rflp图谱聚类分析，结果如图1所示，图中B代表BRBFE组，C代表空白组，M代表模型组。结果：由图1可见，聚类图谱数据显示：与炎性肠病模型鼠相比，经过BRBFE喂食9周的处理组的小鼠肠道菌群与空白对照组相似度更大一些，而与炎性肠病模型鼠相比有较为显著的差异。定性的表明本发明的树莓冻干粉或其提取物对引起炎性的小鼠肠道菌群具有抑制作用。(四)BRBFE对炎性肠病小鼠粪便中有益菌和致病菌的作用小鼠处死后，挑拣肠道内新鲜粪便，按照试剂盒说明书提取小鼠粪便中DNA。T-rflp方法用三种酶(HaeIII、HhaI和MSPI)分析菌群变化情况。如图2-图5：细菌T-rflp分析显著性片段，如图6：T-rflp图谱分析。1、丁酸盐是结肠上皮最好的氧化底物，占结肠细胞氧耗量的80％，丁酸无需经过肝胆吸收和复杂的三羧循环系统，可以直接为肠上皮细胞提供能量，是肠上皮细胞的快速能量源，尤其是肠细胞(盲肠和结肠细胞)首选的能量，且极易从肠腔内吸收，对肠黏膜修复及结肠炎和结肠癌的预防起作用。经BRBFE处理过的小鼠粪便中丁酸盐产生菌含量增多，与空白组相比提高了6％，而模型组含量为1％。经BRBFE处理过的小鼠粪便中奈瑟氏菌属含量增多，与空白组相比提高了5％，而模型组含量为0％。结果显示，BRBFE对于肠道益生菌有着明显的正性调控作用。2、弯曲杆菌和拟杆菌为肠道内主要的致病菌,经BRBFE处理过的小鼠粪便中弯曲杆菌、幽门螺杆菌、产琥珀酸沃廉菌,含量降低，与模型组相比降低了15％。经BRBFE处理过的小鼠粪便中拟杆菌属和普氏菌属，含量降低，与模型组相比降低了72％，结果显示，BRBFE对于肠道致病菌具有显著的抑制作用。(五)BRBFE对于炎性肠病小鼠肠内炎性细胞因子异常升高的抑制作用小鼠肠上皮细胞的提取将空肠、回肠、结肠纵向剖开，PBS洗净，各取一段置入20ml冰PBS，接着将以上各组织移入37℃15mMEDTA30ml，37℃振荡，220r,30min。先用手振荡，再振荡器充分振荡后，去除肠肌肉组织。4℃离心，5000r,5min，先弃去上清，5ml冷PBS重悬细胞，分装于1.5mlEP管。4℃离心，3000r,5min。弃去上清，EP管开盖置于液氮。取出后，开盖置于－80℃过液。次日将EP盖管上。小鼠肠上皮细胞RNA的提取及cDNA的合成用Trizol法提取小鼠肠上皮细胞RNA，按照cDNA第一链合成试剂盒说明书，将总RNA进行逆转录合成cDNA，-20℃存放。引物设计及Real-TimePCRIL-1:R:5’-GCAACT-GTTCCTGAACTCAACT-3’,F:5’-ATCTTTTGGGGT-CCGTCAACT-3’；IL-6:R:5’-TAGTCCTTCCTACCCCAAT-TTCC-3’,F:5’-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3’；IL-10:R:5’-GCTCTTACTGACTGGCATGAG-3’,F:5’-CGCAGCTCTAGGAGCATGTG-3’；COX2:R:5’-TGAGCAACTA-TTCCAAACCAGC-3’,F:5’-GCACGTAGTCTTCGATCA-CTATC-3’；TNF-a:R:5’-CCCTCACACTCAGATCATCTTCT-3’,F:5’-GCTACGA-CGTGGGCTACAG-3’；β-actin:R:5’-AGGCAAACCGTGAAAAGATG-3’,F:5’-AGGCAAACCGTGAAAAGATG-3。以cDNA为模板，按UItraSYBRMixture试剂说明书进行Real-TimePCR，处理实验数据，得到图7。如图7，经5％BRBFE和10％BRBFE处理过的小鼠肠上皮细胞中IL-1的表达量降低，与模型组相比分别降低了30％和55％。经5％BRBFE和10％BRBFE处理过的小鼠肠上皮细胞中IL-6的表达量降低，与模型组相比分别降低了58％和19％。经5％BRBFE和10％BRBFE处理过的小鼠肠上皮细胞中IL-10的表达量降低，与模型组相比分别降低了23％和58％。经5％BRBFE和10％BRBFE处理过的小鼠肠上皮细胞中COX2的表达量降低，与模型组相比分别降低了40％和55％。经5％BRBFE和10％BRBFE处理过的小鼠肠上皮细胞中TNFα的表达量降低，与模型组相比分别降低了67％和21％。(六)不同浓度BRBFE对体外培养的粪便菌群的影响用96孔板对BRBFE抑菌浓度进行筛选，将各组小鼠粪便菌群上清液1毫升于200毫升液体培养基中加入扩大培养，37℃，180转，14小时后检测其吸光值，各组吸光值在600nm处OD＝0.4。将菌悬液稀释100倍后加入96孔板中，每孔加入200微升，并取相同体积的液体培养基做空白对照组。取各浓度的BRBFE2微升加入菌悬液中，同时取氨苄霉素2微升做阳性对照组，分别做三组平行，标记好后放入细菌培养箱中培养24小时。24小时后用酶标仪检测每孔吸光值进行计算作图，结果如图8所示。由图8可见，在0-250μg/mlBRBFE浓度时，其抑菌效果也逐渐增强，抑制率分别为0.96％、4.8％、40.3％、59.4％、59.7％、70.2％，在500μg/ml和2500μg/mlBRBFE浓度时，其抑菌效果降低，抑制率分别为68.4％和47.5％。阳性对照组抑制率为38.2％。