载有BMP的明胶‑海藻酸钙核壳结构缓释微球及其制备方法与流程

本发明属于骨科材料及其制备技术领域，具体涉及一种以核-壳结构的明胶/海藻酸钙为主要材料包覆活性成分的缓释微球及其制备方法。

背景技术：

骨缺损、骨不连是骨科棘手的难题之一，股骨头缺血性坏死更是骨科临床的难点和热点之一。对于股骨头缺血性坏死，传统的治疗方法就是手术，但手术大多是以关节废用为代价，而不得不使用人工关节置换术，但对于青年患者而言，人工关节的使用年限不能满足患者的要求。股骨头缺血性坏死早期治疗不当或是没有及时治疗都会导致股骨头塌陷、变形和引起创伤性关节炎，给患者带来极大的损失。

骨形态发生蛋白(BMP)在临床的价值无可限量，近年来，骨形态发生蛋白的高效成骨活性以及安全性都得到了充分的证实。BMP对于治疗骨缺损和骨不连都是非常安全有效的，有研究证实，骨形态发生蛋白能够有效促进脊柱融合，现已应用于临床，同时对于治疗股骨头缺血性坏死，BMP也有着良好的应用前景。

骨形态发生蛋白在体内被机体的酶类降解，很快就会失去作用，而其价格也很贵，这对于患者来说无疑是巨大的压力。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种缓释效果好、副作用小、成本低、无毒副作用的载有BMP的明胶-海藻酸钙核壳结构缓释微球，还相应提供一种操作简单、调控方便、成本低、有利于实现本发明产品的工业化的载有BMP的明胶-海藻酸钙核壳结构缓释微球的制备工艺。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种载有BMP的明胶-海藻酸钙核壳结构缓释微球，所述核壳结构缓释微球由内到外依次包括内核层和外包覆层，所述内核层主要由均匀分散有骨形态发生蛋白的明胶微球组成，所述内核层外包覆的外包覆层主要由海藻酸钙组成。

传统技术中大多采用高分子材料或生物大分子材料对BMP活性蛋白进行包覆，得到的是一种复合缓释材料，但本发明的特点在于：引入具有多重核-壳结构的微球设计来包覆BMP；通过核壳结构微球设计，将BMP包覆于明胶的内核，外部再包覆海藻酸钙壳层，使BMP均匀地分布在微球中，通过壳层的厚度及交联度调控，以达到BMP能够持续、缓慢的释放效果，这相比单一的BMP包覆结构微球而言，可实现BMP的长效缓释。

上述的载有BMP的明胶-海藻酸钙核壳结构缓释微球，优选的，该核-壳结构缓释微球是表面光滑的球形体，且该核-壳结构缓释微球的平均粒径为95-120μm；每毫克所述核壳结构缓释微球上骨形态发生蛋白的载药量为25-35微克。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的载有BMP的明胶-海藻酸钙核壳结构缓释微球的制备方法，包括以下步骤：

(11)先制备空白明胶微球，具体步骤包括：配置明胶溶液置于水浴中预热，将预热的明胶溶液逐滴滴加到液体石蜡中，边滴加边搅拌，滴加完后继续搅拌均匀，然后迅速转入冰水浴中进行处理，再加入交联剂交联，交联完成后用洗涤液进行洗涤，得到淡黄色微球；再置于低温环境下继续固化一段时间，最后用洗涤液再次充分洗涤，过筛，分装；

(12)将步骤(11)制备得到的空白明胶微球作为原料，并与海藻酸钠溶液混合制备明胶/海藻酸钠空白核-壳结构缓释微球；

(13)将步骤(12)制备得到的明胶海藻酸钠空白核-壳结构缓释微球加入到骨形态发生蛋白的PBS缓冲溶液中，充分震荡后，得到载有BMP的明胶-海藻酸钙核壳结构缓释微球。

作为一个总的技术构思，本发明还提供另一种上述的载有BMP的明胶-海藻酸钙核壳结构缓释微球的制备方法，包括以下步骤：

(21)先制备载有BMP的明胶微球，具体步骤包括：配置明胶溶液置于水浴中预热，将预热的明胶溶液逐滴滴加到液体石蜡中，边滴加边搅拌，滴加完后继续搅拌均匀，然后迅速转入冰水浴中进行处理，再加入骨形态发生蛋白的PBS缓冲溶液，然后加入交联剂交联，交联完成后用洗涤液进行洗涤，得到淡黄色微球；再置于低温环境下继续固化一段时间，最后用洗涤液再次充分洗涤，过筛，分装；

(22)将步骤(21)制备得到的载有BMP的明胶微球作为原料，并与海藻酸钠溶液混合，制备得到载有BMP的明胶-海藻酸钙核壳结构缓释微球。

上述本发明的第一种方法是先制备明胶/海藻酸钠空白微球，再进行载药，第二种方法是先制备载有BMP的明胶微球，再包覆海藻酸钠得到载药微球，本发明中第一种方法获得的载药量高于第二种方法。

上述的制备方法中，优选的，所述水浴中预热的温度控制在40℃-60℃，预热时间为7-15min；所述冰水浴的温度控制在5℃以下，冰水浴中进行处理的时间控制在15-25min。在前述优选的工艺参数条件下，能保证获得球形度更好、表面更光滑平整的微球。

上述的制备方法中，优选的，所述明胶溶液的浓度为0.1-0.3g/ml，所述液体石蜡中含有1％-5％质量分数的斯潘80；所述交联剂为戊二醛，交联反应时间为1-3h；所述洗涤液为丙酮-水混合溶液，低温环境下继续固化的时间为12-36h。

上述的制备方法中，优选的，与海藻酸钠溶液混合的具体操作步骤如下：

先配制海藻酸钠溶液作为水相待用；再配制含有斯潘80、吐温80的异辛烷溶液作为油相，在油相中加入所述空白明胶微球或载有BMP的明胶微球，搅拌均匀，置于水浴锅中预热，然后高速乳化，再将海藻酸钠溶液逐滴加入油相中，边滴加边搅拌，搅拌充分后，逐滴加入CaCl₂溶液继续搅拌均匀，得到的微球用乙醇溶液充分洗涤，室温干燥，过筛，分装。

上述的制备方法中，优选的，所述海藻酸钠溶液的质量浓度为0.5％-2％；所述油相中含有1％-5％质量分数的斯潘80；所述油相中含有0.1％-0.5％质量分数的吐温80；所述水相、油相的体积比为1:1-1:6；所述CaCl₂溶液的质量浓度为2％-8％。

上述的制备方法中，优选的，所述水浴锅中预热的温度为35℃-60℃，预热时间为7-15min；所述高速乳化的时间控制在7-15min，加入所述CaCl₂溶液后继续搅拌均匀的时间为30min-3h。

上述的制备方法中，优选的，所述海藻酸钠的用量与所述空白明胶微球或载有BMP的明胶微球的质量比为5:1～15:1；所述骨形态发生蛋白的PBS缓冲溶液中骨形态发生蛋白浓度为100μg/ml-300μg/ml，加入微球的质量为50-100mg。所述骨形态发生蛋白与明胶、海藻酸钠的总质量之比为1:160-1:1000。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1.本发明引入具有多重核-壳结构的微球设计来包覆BMP；通过核壳结构微球设计，将BMP包覆于明胶内核，外部再包覆海藻酸钙壳层，通过壳层的厚度及交联度调控，可进一步控制BMP的释放，相比单一的明胶包覆BMP等微球结构而言，可有效实现BMP的长效缓释；

2.本发明的产品具有良好的生物相容性。本发明采用的包覆材料明胶和海藻酸钠都是生物大分子材料或其衍生物，均为可降解天然高分子物质，具有无毒和良好的组织相容性。海藻酸钠是天然的高分子多糖碳水化合物，是从褐藻类的海带或马尾藻中提取而来，是海藻细胞壁和细胞间质的主要成分，具有良好的生物降解性、生物相容性以及生物粘附性，且来源丰富，成本低廉。明胶是一种天然的高分子材料，是经胶原断裂后得到的一类蛋白质，其蛋白质的含量高达82％以上，其分子量从几万到十几万不等。明胶继承胶原的优异生物功能，例如，明胶有良好的生物相容性，无毒，作为优良的医用生物材料，明胶可降解，并且降解产物容易被吸收而不产生副作用，同时也为创伤提供营养产生疗效等。这两种材料的合并使用不仅没有排斥现象，而且可以改善BMP在微球中的分布，提升BMP的缓释效果。

3.本发明的制备方法具有可控性。采用乳化交联法进行微球的制备，通过水油比的改变能够简单、容易地调控微球粒径。

总体而言，本发明相比直接注入BMP或者用单一微球作为载体而言，本发明的核壳结构缓释微球能够达到更好地缓释作用，使得BMP能够更加持续的、缓慢的在体内释放，减少了BMP的分解，延长了其作用时间，提高了活性成分BMP的利用度，能够有效降低医用成本，减轻患者的经济负担。另外，本发明的制备方法操作简单，调控方便，成本低，有利于实现本发明产品的工业化、规模化量产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例中1中制备的明胶缓释微球的扫描电镜图。

图2为本发明实施例中1中制备的载有BMP的明胶-海藻酸钙核壳结构缓释微球的扫描电镜图。

图3为本发明实施例中1中制备的载有BMP的明胶-海藻酸钙核壳结构缓释微球的剖切电镜图。

图4为本发明实施例中2中制备的载有BMP的明胶微球的扫描电镜图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1：

一种如图2、图3所示载有BMP的明胶/海藻酸钙核壳结构缓释微球，该核壳结构缓释微球由内到外依次包括内核层和外包覆层，内核层主要由均匀分散有骨形态发生蛋白的明胶微球组成，内核层外包覆的外包覆层主要由海藻酸钙组成。该核壳结构缓释微球是表面光滑的球形体，且该核壳结构缓释微球的直径为72.61-151.37μm，平均粒径为109μm。每毫克本实施例的核壳结构缓释微球上骨形态发生蛋白的载药量为32.99微克。

本实施例的载有BMP的明胶-海藻酸钙核壳结构缓释微球的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)制备空白明胶微球：

配制0.2g/ml的明胶溶液，置于60℃水浴中预热，10min后，将预热的明胶溶液逐滴滴加到含有5％质量分数(0.05g/ml)斯潘80的液体石蜡中，边滴加边搅拌，滴加完后继续搅拌10min，迅速转入5℃以下冰水浴中，20min后，加入戊二醛交联1h，用丙酮-水溶液洗涤，得到淡黄色微球(参见图1)，再加入丙酮，置于冰箱中继续固化24h后取出，用丙酮和蒸馏水充分洗涤，过筛，分装。

(2)制备明胶/海藻酸钠空白核-壳结构缓释微球：

配制质量浓度为2％的海藻酸钠溶液，离心，过滤，作为水相待用；配置含有5％质量分数的斯潘80和0.5％质量分数吐温80的异辛烷溶液作为油相，在油相中加入上述步骤(1)制备的空白明胶微球(海藻酸钠的用量与空白明胶微球的质量比为15:1)，搅拌均匀，置于三口烧瓶中于40℃水浴锅中预热10min后，高速乳化10min；然后将海藻酸钠溶液逐滴加入油相中，取水油相体积比为1:1，边滴加边搅拌，搅拌30min后，逐滴加入质量浓度为8％的CaCl₂溶液后继续搅拌均匀3h，得到的微球用无水乙醇和蒸馏水充分洗涤，室温干燥，过筛，分装。

(3)制备载有BMP的明胶-海藻酸钙核壳结构缓释微球：

将步骤(2)制备得到的100mg明胶/海藻酸钠空白核-壳结构缓释微球加入到200μg/ml的骨形态发生蛋白的PBS缓冲溶液中，骨形态发生蛋白与明胶、海藻酸钠的总质量之比为1:160，充分震荡后，得到载有BMP的明胶-海藻酸钙核壳结构缓释微球。

将上述实施例1的产品用蒸馏水充分洗涤后收集，取洗涤离心后的上清液，用酶标仪检测BMP的含量，计算微球BMP的载药量和包封率。

载药量＝(投药量-上清液中含药量)/加入微球质量；

包封率＝(投药量-上清液中含药量)/投药量*100％。

经检测，本实施例1产品的载药量＝32.99μg/mg；

包封率为65.98％。

将本实施例中得到的载有BMP的明胶-海藻酸钙核壳结构缓释微球进行测试，释放24h，累计释放量为27.6％，释放14d时，药物的释放量为60.69％，释放前24h没有突释现象，而单一的明胶微球在前24h内对药物释放速度较快且有突释现象，而现有常规的缓释明胶微球，释放12h后，药物释放量接近90％。

实施例2：

一种载有BMP的明胶-海藻酸钙核壳结构缓释微球，该核壳结构缓释微球由内到外依次包括内核层、中间层和外包覆层，，内核层主要由均匀分散有骨形态发生蛋白的明胶微球组成，内核层外包覆的外包覆层主要由海藻酸钙组成。该核壳结构缓释微球是表面光滑的球形体，且该核壳结构缓释微球的直径为71.50-156.27μm，平均粒径为108μm。每毫克本实施例的核壳结构缓释微球上骨形态发生蛋白的载药量为29.32微克。

本实施例的载有BMP的明胶-海藻酸钙核壳结构缓释微球的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)制备载有BMP的明胶微球：

配制0.2g/ml的明胶溶液，置于60℃水浴中预热，10min后，将预热的明胶溶液逐滴滴加到含有5％质量分数(0.05g/ml)斯潘80的液体石蜡中，边滴加边搅拌，滴加完后继续搅拌10min，迅速转入5℃以下冰水浴中，20min后，加入骨形态发生蛋白0.1g，加入戊二醛交联1h，用丙酮-水溶液洗涤，得到淡黄色微球(参见图4)，再加入丙酮，置于冰箱中继续固化24h后取出，用丙酮和蒸馏水充分洗涤，过筛，分装。

(2)制备载有BMP的明胶-海藻酸钙核壳结构缓释微球：

配制质量浓度为2％的海藻酸钠溶液，离心，过滤，作为水相待用；配置含有5％质量分数的斯潘80和0.5％质量分数吐温80的异辛烷溶液作为油相，在油相中加入上述步骤(1)制备的载有BMP的明胶微球100mg，搅拌均匀，骨形态发生蛋白与明胶、海藻酸钠的总质量之比为1:160，置于三口烧瓶中于40℃水浴锅中预热10min后，高速乳化10min；然后将海藻酸钠溶液逐滴加入油相中(海藻酸钠的用量与载有BMP的明胶微球的质量比为15:1)，取水油相体积比为1:1，边滴加边搅拌，搅拌30min后，逐滴加入质量浓度为8％的CaCl₂溶液后继续搅拌均匀3h，得到的微球用无水乙醇和蒸馏水充分洗涤，室温干燥，过筛，分装，得到载有BMP的明胶-海藻酸钙核壳结构缓释微球。

将本实施例中得到的载有BMP的明胶-海藻酸钙核壳结构缓释微球进行测试，释放24h，累计释放量为25.4％，释放14d时，药物的释放量为56.38％，释放前24h没有突释现象，而单一的明胶微球在前24h内对药物释放速度较快且有突释现象，而现有常规的缓释明胶微球，释放12h后，药物释放量接近90％。

将上述实施例2的产品用蒸馏水充分洗涤后收集，取洗涤离心后的上清液，用酶标仪检测BMP的含量，计算微球BMP的载药量和包封率。

载药量＝(投药量-上清液中含药量)/加入微球质量；

包封率＝(投药量-上清液中含药量)/投药量*100％。

经检测，本实施例1产品的载药量＝29.32μg/mg；

包封率为58.64％。