可注射性脱钙骨基质水凝胶及其制备方法与流程

本发明涉及生物组织工程技术，具体是一种可注射性脱钙骨基质水凝胶及其制备方法。

背景技术：

由于创伤、感染、肿瘤等所导致的骨不连和大面积骨缺损，一直是骨科临床面临的难题。目前，临床骨缺损常用的治疗方法为自体骨、异体骨和人工骨移植来修复。自体骨量少及取骨并发症而难以满足临床；异体骨免疫排斥问题仍难以完全解决；而人工合成骨移植材料骨诱导和骨增殖差，寻找理想的骨移植材料成为学者们研究的焦点。

现今外科临床手术操作呈现微创化趋势，骨科手术亦如此，尤其是微创脊柱外科发展迅速，椎间融合植骨、经皮椎体成形术（PVP）、经皮椎体后凸成形术（PKP）对可注射性植骨材料需求越来越多。

水凝胶是具有亲水性的三维网状结构的聚合物，在水中无法溶解，具有流动性和良好的生物相容性，具有可注射性，原位凝胶化，操作简单。

骨组织是坚硬的结缔组织，由细胞和基质组成。基质分为有机质和无机质，有机质含有大量的胶原纤维，无机质是大量的无机钙盐，胶原包埋在钙盐基质中，分子结构为三条多肽链，呈三维螺旋结构，是一种天然的水凝胶，可满足临床对注射性植骨材料的需要。

技术实现要素：

本发明就是为了提供一种新的满足临床需要的注射性植骨材料，所提出的一种可注射性脱钙骨基质（DBM）水凝胶及其制备方法。

本发明是按照以下技术方案实现的。

一种可注射性脱钙骨基质水凝胶，所述水凝胶是由同种或异种骨组织经过脱脂、脱钙、脱细胞所形成的在弱酸下溶解，在生理温度、中性pH值和适宜盐浓度（0.O1～0.1mol/L）条件下固化成具有一定粘性且含有成骨活性因子的骨胶原水凝胶。

所述同种或异种骨组织来源于猪、或牛、或羊、或人的松质骨。

所述水凝胶含有松质骨细胞外基质、粘多糖和I型胶原。

一种上述可注射性脱钙骨基质水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

a 制备含脱钙骨基质冻干海绵

①用含苯甲基磺酰氟的Tris-HCl缓冲液浸泡同种或异种骨组织，并将骨组织粉碎，蒸馏水反复冲洗；

②用氯仿和甲醇进行脱脂12～72h，蒸馏水反复冲洗；

③用HCl溶液进行脱钙12～72h，蒸馏水反复冲洗；

④加入CaCl₂溶液搅拌1～3h，蒸馏水反复冲洗；加入EDTA溶液搅拌1～3h，蒸馏水反复冲洗；加入LiCl溶液搅拌1～3h,蒸馏水反复冲洗；

⑤加入含Triton X-100和苯甲基磺酰氟的Tris-Hcl缓冲液震荡12～24h；

⑥超纯水反复冲洗、沥干；

⑦加入DNase I与RNase A震荡消化12～24h，超纯水反复冲洗；

⑧冷冻干燥；

b 含脱钙骨基质水凝胶的制备

①用HCl溶液溶解步骤a中获得的冻干骨基质，再加入胃蛋白酶，搅拌12～96h；

②溶液pH调至中性，加入10×PBS和1×PBS混匀；

③20～37℃条件下放置20～60分钟固化成水凝胶。

所述步骤a①中骨组织粉碎成0～5mm×0～5mm×0～5mm大小的颗粒。

所述步骤a①和a⑤中Tris-HCl缓冲液浓度为0.01～0.1mol/L，pH7.4～7.5；步骤a①和a⑤中苯甲基磺酰氟浓度为0.035～0.35 mmol/L；步骤a②中氯仿和甲醇的体积比为1:1～2:1；步骤a③中HCl溶液的浓度为0.01～0.5 mol/L；步骤a④中CaCl₂溶液的浓度为2～3.6mol/L，EDTA溶液的浓度为0.01～0.5mol/L，LiCl溶液的浓度为2～8mol/L；步骤a⑦中DNase I与RNase A浓度分别为10～50 U/ml，1～5 U/ml。

所述步骤b①中HCl浓度0.01～0.5 mol/L；胃蛋白酶：冻干骨基质=50～150mg：1g；步骤b②中调整pH值至中性的NaOH浓度为0.01～1mol/L。

所述步骤a①-⑦和b②均在0～4℃条件下进行。

本发明获得了以下有益效果。

本发明通过对同种或异种骨组织进行脱脂、脱钙、脱细胞处理后，获得了在弱酸条件下溶解，在生理温度、中性pH值条件下固化成具有一定粘性且含有成骨活性因子的骨胶原水凝胶。本发明的脱钙骨基质水凝胶具有良好的生物可降解性，最重要的是具有可注射性；同时，由于进行脱细胞处理，免疫原性大大降低，具有较好的生物相容性，生物排斥反应降低；本发明取材简单，操作方便，成本低，可用于各种骨缺损填充及微创骨科植骨融合，具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1是本发明可注射性脱钙骨基质水凝胶主视图；

图2是本发明可注射性脱钙骨基质水凝胶侧视图；

图3是本发明可注射性脱钙骨基质水凝胶冻干海绵的主视图；

图4是本发明可注射性脱钙骨基质水凝胶冻干海绵的侧视图；

图5是本发明可注射性脱钙骨基质水凝胶冻干大体显微镜镜下图；

图6是本发明可注射性脱钙骨基质水凝胶扫描电镜图；

图7是本发明可注射性脱钙骨基质水凝胶HE染色图；

图8是本发明可注射性脱钙骨基质水凝胶番红“O”染色图；

图9是本发明可注射性脱钙骨基质水凝胶甲苯胺蓝染色图；

图10是本发明可注射性脱钙骨基质水凝胶免疫组化图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的说明。

本发明的一种可注射性脱钙骨基质水凝胶的制备方法如下：

a 制备含脱钙骨基质冻干海绵（以下操作均在0～4℃条件下）

取新鲜猪松质骨，①用pH7.4,0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液（含0.035 mmol/L苯甲基磺酰氟）浸泡松质骨块，用粉碎机（BILON,型号DS-1）将松质骨制成5mm×5mm×5mm大小颗粒状，蒸馏水反复冲洗；

②使用氯仿：甲醇=1:1混合液脱脂12～72h，蒸馏水反复冲洗；

③使用0.01mol/L HCl溶液（25-30ml/g骨）脱钙12～72h，蒸馏水反复冲洗；

④使用2mol/L CaCl₂搅拌1h，蒸馏水反复冲洗；0.5mol/L EDTA搅拌1h，蒸馏水反复冲洗；8mol/L LiCl搅拌1h,蒸馏水反复冲洗；

⑤加入含1% Triton X-100和0.035 mmol/L苯甲基磺酰氟的Tris-HCl缓冲液震荡12～24h；

⑥超纯水反复冲洗、沥干；

⑦加入50U/ml DNase I与5U/mlRNase A在37℃下震荡消化12h，超纯水反复冲洗；

⑧冷冻干燥，-20℃保存备用；

b 含脱钙骨基质水凝胶的制备

①取1g含脱钙骨基质冻干海绵，溶于20ml 0.01 mol/L的HCl溶液，加入胃蛋白酶100mg，搅拌24h；

②4℃条件下，取0.5ml松质骨细胞外基质，用0.1mol/L NaOH调整pH值至中性，加入0.11ml 10×PBS和0.29ml 1×PBS混匀；

③37℃下放置20分钟，即可固化成水凝胶。

图1、2为使用本发明所述方法所制备的脱钙骨基质水凝胶，水凝胶直径1cm，高度1cm，乳白色，表面光滑湿润。

图3、4为使用本发明所述方法所制备的脱钙骨基质水凝胶的冻干品，外观奶白色，有弹性，类似海绵。

图5为使用本发明所述方法所制备的脱钙骨基质水凝胶的冻干品大体显微镜下观，成孔性好，类似海绵。

图6扫描电镜图显示使用本发明所述方法所制备的脱钙骨基质水凝胶富含空隙，且孔隙互通。

图7显示使用本发明所述方法所制备的脱钙骨基质水凝胶苏木和伊红（HE）染色未见苏木蓝染细胞核（证实脱细胞彻底，细胞是免疫原性的主要来源，这样水凝胶的排斥反应明显降低），均可见伊红染色的细胞外基质。

图8显示使用本发明所述方法所制备的脱钙骨基质水凝胶番红“O”染色：可见染色的蛋白多糖（GAG）。

图9显示使用本发明所述方法所制备的脱钙骨基质水凝胶甲苯胺蓝染色显示染色胶原阳性。

图10显示使用本发明所述方法所制备的脱钙骨基质水凝胶免疫组化Ⅰ型胶原阳性。