一种应用于创面的复合敷料及其制备方法与流程

本发明涉及一种敷料，具体涉及一种应用于创面的复合敷料及其制备方法。

背景技术：

人体和动物体的创伤随处可见，各种创伤均会造成不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损，必须通过细胞增生和细胞间基质的形成来进行组织修复。虽然目前治疗创伤或止血的药物种类多样，琳琅满目，但有相当一部分止血药物需口服后经过体内一系列复杂的生理过程来完成，而不靠其药粉简单地直接作用于伤口血管，来达到止血的目的。有一些药物虽然能直接敷于伤口处，但药物干燥，活动受伤处容易牵扯伤口，引起疼痛或再度开裂，且由于药物不能被皮肤吸收，使用后或换药时需要清理伤口处留下的药沫或碎屑，造成病人的痛苦，还可能延缓伤口的愈合。

本申请的敷料将中国传统医学与生物材料结合，构建模拟机体组织和功能的基质和支架系统，重建或恢复皮肤屏障是受伤创面治疗的最终目标。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种应用于创面的复合敷料及其制备方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

一种应用于创面的复合敷料，所述敷料的成分为：毛发角蛋白和中药成分，该中药成分的成分包括三七、重楼、独定子、冰片和麝香。

进一步地，所述毛发角蛋白和中药成分的重量比为1～3:3～1；所述中药成分中的各种成分的重量份数为：三七20～40份、重楼10～25份、独定子10～20份、冰片20～40份和麝香0.001～0.8份。

进一步地，所述毛发角蛋白由毛发制备而成，所述毛发包括人头发和动物毛发中的任意一种。

进一步地，所述毛发角蛋白包括颗粒状的毛发角蛋白或凝胶化得毛发角蛋白；所述动物毛发包括羊毛。

一种根应用于创面的复合型敷料的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)毛发角蛋白的制备：该毛发角蛋白包括颗粒状的毛发角蛋白或凝胶化得毛发角蛋白：具体方法为：

S1：脱脂与软化：称取毛发进行脱脂和软化；

S2：脱色：将软化后的毛发放置于脱色溶液中进行脱色，所述脱色溶液的成分为焦磷酸钠3～5重量份、过硫酸钾1～2重量份、双氧水70～90体积份、浓氨水22～33体积份以及水350～450体积份；

S3：清洗、烘干：将脱色后的毛发进行清洗，并且干燥；

S4：粉末制备：在干燥后的毛发剪碎，并加入液氮冷冻研磨，得到长度为0.1～2mm的毛发粗粉；将粗粉放在球磨罐中，放入玛瑙珠，加入生理盐水，旋转，球磨，直至粒径50μm～90μm为止，则为毛发角蛋白颗粒匀浆；

S5：毛发角蛋白颗粒：在匀浆中加入生理盐水进行离心，弃去上清液，并去除沉淀的表层和底层，取中段颗粒大小均匀的毛发角蛋白，加生理盐水混匀继续离心，重复上述操作2～4次，最后仍然取中段颗粒大小均匀的毛发角蛋白，则得到为高纯度的颗粒状的毛发角蛋白；

S6：灭菌：包装，密封，采用钴⁶⁰辐照法灭菌，保存，待用；

S7：凝胶化的毛发角蛋白：将步骤S6中灭菌后的颗粒状的毛发角蛋白加入水，充分混匀，放置于温箱中孵育2-3小时，至呈现较为均一的颜色和性状为止；灭菌，得到毛发角蛋白凝胶；

(2)中药成分的制备：

按比例称取中药成分中的三七、重楼、独定子、冰片和麝香，将各种分别研磨成粉末，并混合均匀得到中药成分；

(3)敷料的制备：

将步骤(1)中制备得到的颗粒状的毛发角蛋白或凝胶化的毛发角蛋白与步骤(2)中得到的中药成分混合分散均匀，得到复合辅料。

进一步地，步骤(1)的S1中，所述脱脂和软化的方法为：用乙醇浸泡20～60分钟，浸泡过程中每间隔3～10分钟搅拌一次，浸泡完毕后流水冲洗；冲洗后，将毛发放置于次氯酸钠与水配制的溶液中浸泡20～60分钟，在该浸泡过程中间隔3～10分钟搅拌一次，浸泡完毕后流水冲洗；

步骤(1)的S2中，将软化后的毛发放置于脱色溶液中2-3个小时，在脱色过程中间隔10～30分钟搅拌一次，浸泡完毕后流水冲洗，洗掉脱色溶液为止；所述脱色溶液的成分为焦磷酸钠4重量份、过硫酸钾1.5重量份、双氧水80体积份、浓氨水27.5体积份以及水400体积份；

步骤(1)的S3中，将脱色后的毛发在水中浸泡，浸泡完毕用水冲洗，过滤，在鼓风干燥箱中37℃烘干过夜。

进一步地，步骤(1)的S1中，所述次氯酸钠与水的体积比为1～5:9，所述次氯酸钠为10％次氯酸钠；

步骤(1)的S2中，将放置有毛发的脱色溶液置于37℃恒温中进行脱色；所述焦磷酸钠为99％焦磷酸钠，过硫酸钾为99.5％过硫酸钾，双氧水为30％双氧水，浓氨水为25％浓氨水。

进一步地，步骤(1)的S4中，球磨：将粗粉2g，放在球磨罐中，放入玛瑙珠，加入生理盐水10ml，球磨1～3小时，在显微镜下观察粒径大小，再加入生理盐水5ml继续研磨，直至形成粒径约60μm-80μm；所述玛瑙珠的数量：直径1cm玛瑙珠20颗，直径60mm玛瑙珠100颗；

步骤(1)的S6中，将得到的高纯度的毛发角蛋白泥包装采用钴60辐照法灭菌，剂量12Kg。

进一步地，步骤(1)的S7中，颗粒状的毛发角蛋白中加入水充分混匀，放置于37℃温箱孵育2-3小时。

进一步地，所述毛发角蛋白为凝胶化的毛发角蛋白，所述凝胶化的毛发角蛋白的浓度(g/ml)为0.1～5％。

进一步地，所述凝胶化的毛发角蛋白的浓度为0.8～3％。

进一步地，所述毛发角蛋白凝胶的制备方法还能够通过以下方法替换：

(1)毛发角蛋白成盐：①称取毛发，在毛发中加入乙醇和水的混合溶液，加热，逐渐升高温度至溶液开始回流，边回流边滴加碱溶液，至pH值为6.5～7.5时，回流与滴加同时结束，结束后，继续搅拌，使反应完全，得到成盐毛发角蛋白；②将所得到的成盐毛发角蛋白滤出，洗液冲洗，洗涤至不呈碱性，干燥，得到毛发角蛋白磺酸盐；③将所得到的毛发角蛋白磺酸盐粉碎至微米级，冻干，得到毛发角蛋白磺酸盐粉末；(2)毛发角蛋白凝胶的制备：称取毛发角蛋白磺酸盐粉末，加入水，充分混匀，放置于温箱中，至呈现较为均一的颜色和性状为止，采用钴60辐照法灭菌，得到毛发角蛋白凝胶。

本发明提供了一种应用于创面的复合敷料及其制备方法，其主要具有的有益效果为：

本发明将中国传统中医学与生物材料结合，毛发角蛋白生物材料具有利于细胞渗入、粘附和增殖的三维支架结构，在细胞粘附和增殖方面具有明显优于其他材料的特性，同时具有神经诱导性，在止血方面也显示出很好的效果，以毛发角蛋白凝胶等作为中药成分外伤修复的载体，可以形成具有生物敷料性质的创面覆盖物，其是一种效果极佳的创面覆盖物，同时，随着创伤慢慢愈合和自身皮肤生长，为促进皮肤的再生提供一个有利于创面愈合的环境。具体地，(1)其止血效果非常好，并能有效加速创面愈合；(2)其有效阻止细菌感染，(3)具有良好的生物相容性，(4)控制和吸收创面渗液，(5)透气性强，适合气体和水蒸气透过，(6)保护新生组织，(7)无毒副作用等优势，采用人头发或羊毛等毛发制备敷料无免疫原性，不会过敏；；(8)只需外敷，使用方便，效果显著；更重要的是，该工程敷料能自行溶解被机体吸收，免除了解除时流血多及病人的痛苦，也不会留下碎屑而延缓伤口的愈合，避免普通辅料黏着创面的再次损伤，为促进皮肤的再生提供一个有利于创面愈合的环境。该工程敷料能够极好的应用于人体或动物体的创伤面处。

附图说明

下面根据附图对本发明作进一步详细说明。

图1是本发明实施例所述的在光镜下观察毛发角蛋白的结构示意图；

图2是本发明实施例所述的在扫描电镜(1.69×103)下观察毛发角蛋白的结构示意图；

图3是本发明实施例所述的在扫描电镜(1.25×103)下观察毛发角蛋白的结构示意图；

图4是本发明实施例所述的在透射电镜(1×105)下观察毛发角蛋白的结构示意图；

图5是本发明实施例所述的在透射电镜(2×105)下观察毛发角蛋白的结构示意图；

图6是本发明实施例所述的载有中药成分的毛发角蛋白的扫描电镜图；

图7是本发明实施例所述的将复合敷料敷于创面的动物模型示意图；

图8是本发明实施例所述的21天以后创面恢复后的示意图；

图9是本发明实施例所述的鼠真皮成纤维细胞的染色显示Ⅰ型胶原蛋白分泌情况；

图10是本发明实施例所述的4％的凝胶化的毛发角蛋白的性状。

具体实施方式

本发明实施例所述的一种应用于创面的复合敷料及其制备方法。下面以具体实验案例为例来说明具体实施方式，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种应用于创面的复合敷料，所述敷料的成分为：毛发角蛋白和中药成分，该中药成分的成分包括三七、重楼、独定子、冰片和麝香。

毛发角蛋白和中药成分的重量比为1～3:3～1，优选1:1～2，例如1:1。

中药成分中的各种成分的重量份数可以为：①三七20份、重楼25份、独定子10份、冰片20份和麝香0.001份；②三七40份、重楼10份、独定子20份、冰片40份和麝香0.8份；③三七30份、重楼18份、独定子15份、冰片30份和麝香0.1份；④三七25份、重楼12份、独定子18份、冰片35份和麝香0.03份；⑤三七33份、重楼23份、独定子13份、冰片25份和麝香0.008份；⑥三七22份、重楼15份、独定子11份、冰片38份和麝香0.08份。

作为进一步优选地实施方式，毛发角蛋白由毛发制备而成，毛发包括人头发和动物毛发中的任意一种；动物毛发可为羊毛等。

作为进一步优选地实施方式，所述毛发角蛋白包括颗粒状的毛发角蛋白或凝胶化的毛发角蛋白，优选凝胶化的毛发角蛋白。

作为进一步优选地实施方式，所述凝胶化的毛发角蛋白的浓度(质量/体积)可以为：①0.1％；②5％；③0.8％；④3％；⑤1.5％；⑥2％。

实施例2

一种根应用于创面的复合型敷料的制备方法，该方法具体方法如下：

(1)毛发角蛋白的制备：

S1：脱脂：称取5g头发，放在1000ml烧杯中。加入99.7％无水乙醇浸泡30分钟，间隔5分钟用玻璃棒搅拌一次，流水冲洗；

S2：软化：将清洗后的头发放置于≥10％次氯酸钠10ml和蒸馏水90ml配置的溶液中，常温浸泡30分钟，间隔5分钟用玻璃棒搅拌一次,流水冲洗；

S3：脱色：按5g头发的重量，称取99％焦磷酸钠(Na₄P₂O₇)4g，99.5％过硫酸钾(K₂S₂O₈)1.5g，30％双氧水(H₂O₂)80ml，25％浓氨水27.5ml，蒸馏水400ml,配置成脱色溶液，将软化的头发置于此溶液中，放置37℃恒温水槽中，每隔20分钟用玻璃棒搅拌1次，观察头发颜色至浅黄色，这一过程用时一般2-3个小时，比传统方法短很多；将脱色后的头发放置在筛网上，流水冲洗，直至洗掉脱色溶液。

S4：清洗、烘干：取去离子水浸泡上述脱色后的头发12小时以上，去除残留试剂；去离子水冲洗，过滤后放置在鼓风干燥箱中37℃烘干过夜；

S5：研磨：将烘干后的头发用剪刀剪碎后放在陶瓷研钵中，加入液氮冷冻研磨，至头发成1mm长，得到头发粗粉；

S6：球磨：称取头发粗粉2g，放在球磨罐中，放入玛瑙珠，加入生理盐水10ml,460转/min，球磨2小时，倒置电子显微镜下观察粒径的大小，再加入生理盐水5m继续研磨1-2个小时，直至形成粒径约60μm-80μm的人发角蛋白颗粒匀浆，优选70μm；上述的玛瑙珠的数量：直径1cm玛瑙珠20颗，直径60mm玛瑙珠100颗；

S7：装管：在上述匀浆中加入生理盐水30ml，将球磨罐中的液体清洗转移至50ml离心管中；

S8：离心：将离心管放在离心机的离心杯中，离心速度3000转/min，离心20min,弃去上清液，用钥匙去除角蛋白沉淀的表层和底层，取中段颗粒大小均匀的角蛋白移至新离心管中，加生理盐水40ml混匀，继续离心一次，弃去上清液，再用钥匙去除角蛋白沉淀的表层和底层，取中段颗粒大小均匀的角蛋白移至新离心管中，再加生理盐水40ml混匀，再次离心，弃上清液，再用钥匙去除角蛋白沉淀的表层和底层，取中段颗粒大小均匀的角蛋白移至新离心管中，得到高纯度的角蛋白泥，即颗粒状的毛发角蛋白；暂时放置在4℃保存；

S9：灭菌：将得到的高纯度的颗粒状的毛发角蛋白装于塑料袋中，密封好，用纸箱包装后送到辐射中心进行Co⁶⁰照射灭菌，剂量12Kg，放置在4℃冰箱，待用；

将制备好的高纯度的角蛋白泥(即颗粒状的毛发角蛋白)在光镜观察(×20)下观察，其保持了毛发原有稳定的束状结构，如图1所示。

图2～5为该颗粒状的毛发角蛋白电镜图，图2为人发横断面SEM(1.69×10³)，图3为人发表面SEM(1.25×10³)，图4为人发TEM(1×10⁵)，图5为人发皮质TEM(2×10⁵)。

由扫描电镜(SEM)可见，经本专利方法处理的毛发材料表面比较光滑，无正常黑发的鳞片结构，呈浅凹凸斑片状；横断面毛皮质仍呈无结构均质状。由透射电镜(TEM)可见毛发角蛋白颗粒材料中黑色素都已崩解。

(2)中药成分的制备：

按比例称取中药成分中的三七、重楼、独定子、冰片和麝香，将各种分别研磨成粉末，大小为80～200目，优选120～150目，并将各种成分的粉末混合均匀得到中药成分。

(3)敷料的制备：

将步骤(1)中制备得到的颗粒状的毛发角蛋白与步骤(2)中得到的中药成分按比例混合分散均匀，得到复合辅料，如图6所示，图6为载有中药成分的毛发角蛋白的扫描电镜图SEM(3.88×10²)。

步骤(2)和(3)中的毛发角蛋白与中药成分的比例以及中药成分中各种成分的量如实施例1所示，这里不再重复限定。

实施例3

本发明中的凝胶化得毛发角蛋白的制备方法可以为以下两种方法的任意一种：

1、称取本发明得到的(例如实施例2)高纯度的颗粒状的毛发角蛋白50mg中加入5ml的水中，充分混匀，放置于温箱中孵育2-3小时，至呈现较为均一的颜色和性状为止；灭菌，得到凝胶化的毛发角蛋白，其浓度为1％。

2、S1：称取10g羊毛或人头发，放入装有180ml无水乙醇和20ml蒸馏水的混合溶液的三口烧瓶中，加热15分钟后升温至75℃，溶液开始回流；然后，边回流边滴加2ml的NaOH溶液，至氧化角蛋白的pH值为7，回流与滴加同时结束，时间持续90分钟；滴加和回流结束后，在25℃继续搅拌5小时，使反应完全，得到成盐毛发角蛋白。

S2：将成盐毛发角蛋白滤出，并用洗液冲洗，该洗液为无水乙醇与等量蒸馏水混合，除去未反应的NaOH，用pH试纸检测是否呈碱性，洗涤至不呈碱性，放入60℃鼓风干燥箱中干燥6小时，得到干燥的毛发角蛋白磺酸盐；

S3：经过上述处理而得到的毛发角蛋白磺酸盐呈脆性，在流星式球磨罐中粉碎得到角蛋白粉末，控制球磨条件(球料比，研磨时间，转速等)使毛发角蛋白磺酸盐粉末的颗粒在50μm左右，冻干；

S4：凝胶化的毛发角蛋白：在超净台里操作，取100mg步骤S3中得到的冻干后的毛发角蛋白磺酸盐粉中加入5ml无菌水，先采用搅拌器手工混匀材料，再用斡旋混匀机充分混匀，放置于37℃温箱孵育约2-3小时，则得到颜色和性状较为均一的毛发角蛋白凝胶，然后，采用钴60辐照法灭菌，得到凝胶化的毛发角蛋白，其浓度为2％。

图10为浓度是4％的凝胶化的毛发角蛋白的性状，2％的凝胶化的毛发角蛋白的性状更稀一些。

然后该凝胶化的毛发角蛋白与本发明的细中药成分制成本发明的复合敷料。毛发角蛋白与中药成分的比例如实施例1所示，这里不再重复限定。

实施例4

应用于创面的复合敷料的毒性测试如下：

(1)试样浸提液制备：载药敷料(即含有中药成分的毛发角蛋白)1g加入10ml生理盐水中，经液氮冷冻固化后粉碎，取1g加入10ml生理盐水中，振荡混匀后在细胞培养孵箱中37℃放置7d，离心后吸出上清液，制备载药敷料浸提液原液(初始100％浓度毛发材料100mg∶浸液1ml＝100mg/ml)，过滤除菌，备用。

(2)体外急性全身毒性试验：对载药敷料(即本发明所述的敷料)制备过程中可能造成的急性毒性加以初步评价。

结果显示：按照急性毒性试验的标准方案，对实验小鼠进行常规灌胃，并与术后不同时间点进行观察。结果显示，小鼠一般情况较好，7天观察期内无死亡，72h观察期内各组动物未见中毒症状或不良反应，无死亡，体重增长正常，方差分析表明两试验组与生理盐水组之间小鼠体重变化不存在明显差异，这表明毛发角蛋白颗粒和凝胶化的毛发角蛋白两种形式材料浸提液均无急性毒性作用。

(3)细胞毒性试验：MTT法法测定细胞相对数和相对活力：

结果显示：载药敷料材料的不同浓度浸提液在三个时间点测得的细胞相对增殖率均达80％以上，细胞毒性分级为一级，具有良好的细胞相容性，无细胞毒性，说明在加工过程中并为造成毛发自身性质和相容性的改变。见表1：

表1粉体MTT结果统计分析

小鼠骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核试验：评价材料可能的遗传毒性。微核率指含有微核的嗜多染红细胞数，以千分率(‰)表示。

结果显示：粉体匀浆组(即本发明所述的毛发角蛋白)的微核发生率与阴性对照组无显著差异(P>0.05)，而与阳性对照组比较差异显著(P<0.01)，受试物小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验呈阴性，说明毛发角蛋白颗粒组无致染色体畸变毒性作用。见表2

表2骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核试验结果

实施例5

动物实验研究：

1、不同比例中药成分人发角蛋白材料对创面愈合影响的实验研究

创面修复实验

取健康SD大鼠，戊巴比妥麻醉(30mg/kg)，在其背部脊柱一侧旁开1cm，利刀全层切除皮肤，形成一个直径1.8cm、面积2.54cm²的圆形全层皮肤切除创面，对侧对称部位皮肤作为正常自身对照。将制备的毛发角蛋白和成纤维细胞组织复合而成的本发明的复合型敷料均匀敷于创面，纱布覆盖创面，打包法处理伤口，如图7所示。

观察：实验组动物伤后3d天创面有所缩小，可见新生肉芽组织生成。伤后21～28d，大部分创面愈合，如图8所示。

2、不同比例中药成分人发角蛋白粉剂对创面愈合影响的实验研究

HE染色组织切片观察：测真皮层增厚，4周时平均厚度约0.58mm，可见大量的角蛋白颗粒真皮下聚集，角蛋白之间有细胞及纤维组织生长，有少量多核巨细胞，内吞噬有角蛋白颗粒。

免疫组织化学染色观察：切片中鼠真皮成纤维细胞大量分泌Ⅰ型胶原蛋白，胶原纤维排列紧密，染色呈褐色，Ⅰ型胶原蛋白与组织细胞交错分布；第8周后填充部位皮肤免疫组织化学染色观察图如图9所示，图9为染色显示Ⅰ型胶原蛋白分泌情况。

3.细菌感染观察：在受伤至痊愈后未见明显细菌感染情况。

结论：本发明的复合敷料效果非常显著，在没有任何用药的情况下，未出现明显发炎，且伤后21－28d，绝大部分创面愈合，12周时角蛋白凝胶可基本降解。

具体地，毛发角蛋白生物材料具有利于细胞渗入、粘附和增殖的三维支架结构，在细胞粘附和增殖方面具有明显优于其他材料的特性，同时具有神经诱导性，在止血方面也显示出很好的效果；再配合本发明的毛发角蛋白，使其效果极其显著。

实施例6

对于本发明应用于创面的复合敷料的临床应用情况如下：

(1)受试者选择：选择成人各种创面各30例。

(2)处理方法：常规处理创面，分别采用含有本发明的中药成分的人发角蛋白凝胶/粉剂(粉剂即本发明的颗粒)处覆盖创面，与传统处理方法比较。

(3)观测指标

观察周期：1个月；

局部大体观察：凹陷填充部位平整度的变化，注射部位皮肤有无红肿渗液及硬结等；

本发明的含有中药成分和毛发角蛋白的复合敷料效果非常显著，在志愿者在没有任何用药的情况下，未出现明显发炎，且伤后21－28d，绝大部分创面恢复良好。

注：上述研究均在伦理委员会和受试者知情同意的情况下进行。

最后应说明的是：以上所述的各实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或全部技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。