莪术醇干预子宫内膜间质细胞的应用的制作方法

本发明涉及属于生物医学技术领域，尤其是一种莪术醇干预子宫内膜间质细胞的应用。

背景技术：

子宫腺肌病是子宫内膜腺体和间质细胞向肌层良性浸润并在其中弥漫性生长的疾病，主要发生于育龄妇女；近年来发病率有明显上升趋势，已成为人们日益重视的妇科难治症。我们及前人研究发现：子宫内膜间质细胞在子宫腺肌病发病过程中起重要作用，可以作为子宫腺肌病治疗的靶点。

临床上对子宫腺肌病的治疗多采用激素或手术，但激素治疗副作用大，而手术治疗多有一定的适应症，且复发率都较高，二者均有一定局限性。近年来中药用于治疗子宫腺肌病表现出较可靠的疗效，且无明显不良反应。

莪术醇是从莪术中分离的一种单体，具有抗肿瘤、抗菌和活血化瘀等功效。莪术醇的抗肿瘤效应主要通过杀伤肿瘤细胞、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制血管生成、抑制核酸代谢、增加细胞内活性氧水平所介导，所观察到的临床副作用较少。子宫腺肌病虽是一种良性疾病，却表现出侵袭、增生、转移等类肿瘤行为。

目前，对于莪术醇能够治疗子宫腺肌病及其能够通过干预子宫内膜间质细胞的增殖、侵袭迁移、凋亡等水平而治疗子宫腺肌病尚未见报道。本发明拟取临床确诊的子宫腺肌病患者异位子宫内膜病理组织，分离、纯化培养子宫内膜间质细胞；莪术醇作用子宫内膜间质细胞后，CCK8检测细胞增殖、细胞划痕检测细胞迁移、Transwell实验检测细胞侵袭、流式细胞术检测细胞凋亡和细胞内活性氧水平。从子宫内膜间质细胞水平上初步探讨中药单体莪术醇对子宫腺肌病的治疗效果，寄希望于找到子宫腺肌病的治疗新靶点及临床治疗效果好，不良反应少的新药物。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种莪术醇干预子宫内膜间质细胞的应用，该莪术醇对子宫内膜间质细胞的作用及应用。

本发明的技术方案为：一种莪术醇干预子宫内膜间质细胞的应用，其特征在于：莪术醇为一种中药单体化合物，分子式为C₁₅H₂₄O₂，分子量236.3，能够抑制子宫内膜间质细胞的增殖、侵袭和迁移、并能诱导子宫内膜间质细胞的凋亡及活性氧产生；所述莪术醇用于通过干预子宫内膜间质细胞而达到治疗子宫腺肌病的用途。

本发明的优点在于：本发明得到中药单体莪术醇能够较好地抑制子宫内膜间质细胞的增殖、侵袭、迁移作用、此外还具有促凋亡和诱导细胞内活性氧产生的效应。

附图说明

图1为子宫内膜间质细胞的鉴定；

图2为莪术醇对子宫内间膜间质细胞增殖的影响；

图3为莪术醇不同处理时间对子宫内膜间质细胞迁移的影响；

图4为莪术醇对子宫内膜间质细胞侵袭的影响；

图5为莪术醇处理子宫内膜间质细胞后对细胞凋亡的影响；

图6为莪术醇处理子宫内膜间质细胞对ROS生成的影响。

具体实施方式

实施例1

(1)原代子宫内膜间质细胞的分离：

1)将收集到的新鲜子宫内膜组织放入超净台平皿里，用灭菌剪刀剪碎至1mm³，PBS冲洗干净；

2)加入9mL DMEM/F-12+1mL稀释的Ⅳ型胶原酶，混匀后转移至离心管；

3)放入预热(37℃)洁净水浴锅，恒温水浴120-180min，每隔15min摇晃混匀一次；

4)超净台内组织悬液过80目灭菌筛网；

5)过滤液过300目筛网，吸取过滤后液体至离心管；

6)离心1000rpm，6-8min；

7)弃上清，管内加PBS液吹匀；

8)离心1000rpm，6-8min；

9)弃上清，离心管内加含10％FBS培养液重悬，得到细胞悬液；

10)将细胞悬液转移至培养瓶，放入37℃ CO₂孵育箱培养3-4h；

11)待细胞贴壁后更换培养液得到子宫内膜间质细胞。

(2)原代子宫内膜间质细胞的鉴定：

1)细胞爬片

a)配制多聚赖氨酸(PLL)：取1mL PLL+10mL灭菌三蒸水，混匀。将已经高压蒸汽灭菌的盖玻片浸入配好的PLL中5min，取出，至超净台中室过夜，风干。第二天将盖玻片用培养基冲洗后放入6孔板中；

b)选对数生长期细胞，细胞收集之前24h换液一次；

c)用PBS冲洗细胞两遍；

d)加入0.25％胰酶400μL及300μL PBS(以覆盖瓶底为限)；

e)37℃孵育或室温放置发现细胞质回缩，细胞间隙增大时，立即用含10％胎牛血清的高糖DMEM/F-12培养液终止消化；

f)用吸管轻轻反复吸打细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。注意避免形成泡沫；

g)离心(1000rpm×5min)，弃上清，细胞沉淀用含10％胎牛血清的高糖DMEM/F-12培养液重悬，接种于6孔板中。置孵育箱内培养(37℃，5％CO₂)。每隔2天换液一次。

2)免疫细胞化学鉴定

a)待盖玻片上的细胞贴满80％时，用PBS冲洗细胞3次×1min。

每孔加入4％多聚甲醛1mL于4℃固定30min。

b)吸弃残留液体，每块盖玻片滴一滴3％H₂O₂封闭内源性过氧化物酶，室温静置10min。

c)PBS冲洗3次×5min。

d)滴加一抗(波形蛋白稀释度为1:70，角蛋白稀释度为1:100)，以覆盖玻片为宜。置于37℃孵箱孵育1h。

e)PBS冲洗3次×5min。

f)滴加二抗(以覆盖玻片为宜)。置于37℃孵箱孵育30min。

g)PBS冲洗3次×5min。

h)DAB显色，镜下观察充分显色后自来水终止染色，显色约1-10min。拍照。结果如图1所示。

由图1可见，子宫内膜间质细胞分别用上皮细胞标记角蛋白和间质细胞标记波形蛋白的抗体染色：发现角蛋白染色为阴性，而波形蛋白染色阳性。表明分离的原代细胞为子宫内膜间质细胞。

(3)莪术醇干预子宫内膜间质细胞的增殖检测：

1)将密度为3×10³个/孔的ESCs细胞接种于96孔板，设加培养基的空白对照，以及溶解莪术醇所用的无水乙醇对照；板边缘的孔中加入PBS液。每孔体积为200μL，放入37℃细胞培养箱；

2)24h后，加入莪术醇，药物终浓度分别为6.25μg/mL、12.50μg/mL、25.00μg/mL、50.00μg/mL和100.00μg/mL。将96孔板放入37℃培养箱内继续孵育；

3)加药后，向每孔细胞中加入10μL CCK-8溶液，轻轻水平摇晃10min；

4)将96孔板放入酶标仪，选择450nm波长，读取各孔吸光值，用各孔平均吸光值减去空白对照孔的平均吸光值，记录结果；

5)连续测量5天，根据结果描绘细胞的增殖曲线。结果如图2所示。

由图2可见，6.25μg/mL、12.50μg/mL、25.00μg/mL、50.00μg/mL和100.00μg/mL莪术醇均能抑制子宫内膜间质细胞的增殖。其中，6.25μg/mL和12.50μg/mL莪术醇抑制细胞增殖的效应较其它浓度小，而25.00μg/mL莪术醇与50.00μg/mL和100.00μg/mL莪术醇抑制细胞增殖效果差异不明显。因此，我们选择25.00μg/mL莪术醇对子宫内膜间质细胞进行后续功能研究。

(4)莪术醇干预子宫内膜间质细胞的迁移实验：

1)接种细胞：胰酶消化对数期生长细胞后，调整细胞浓度至5×10⁴个/mL，将各细胞悬液分别接种到6孔板各孔内，待细胞贴壁面积达到70％左右，弃去孔内培养基，加入新鲜PBS洗2次，并加入1mL含10％FBS的DMEM/F-12培养基，以200μL枪头在孔内划线。

2)显微镜下拍摄划线区域细胞生长状态，随后8h和24h各拍摄一次，分析空白区域面积。结果如图3所示。

由图3可见，莪术醇处理子宫内膜间质细胞后能够抑制细胞的迁移。

(5)莪术醇干预子宫内膜间质细胞的侵袭实验：

1)Matrigel胶解冻：正式实验前24h将Matrigel置于4℃解冻；

2)包被基底膜：无血清培养基DMEM/F-12与Matrigel按6：1的比例稀释并混匀，每个小室于冰上加入50μL上述混合液于Transwell上室，置于细胞孵育箱孵化5h；

3)水化基底膜：吸出上室内多余液体，每小室滴加70μL的无FBS的DMEM/F-12培养基，37℃，30min；

4)各接种5×10³个细胞于24孔板上室，分别补充完全培养基、无水乙醇对照，以及25.00μg/mL莪术醇至200μL，下室加入500μL含20％FBS的DMEM/F-12培养基，将24孔板放入37℃培养箱孵育24h；

5)固定：取出24孔板，取出小室，吸弃室内液体，用PBS清洗小室基底2遍，于1mL 95％酒精中室温固定15min；

6)取出小室，吸弃室内液体，风干后于0.1％结晶紫染色15min；

7)PBS清洗3次，用湿棉签擦去上室底部的细胞；显微镜下计数。

实验结果如图4所示，表明25.00μg/mL莪术醇能够抑制子宫内膜间质细胞的侵袭。

(6)莪术醇干预子宫内膜间质细胞后的凋亡检测：

1)25.00μg/mL莪术醇处理子宫内膜间质细胞24h后，预冷PBS清洗细胞两次，胰蛋白酶消化细胞后，加入10mL含10％FBS的DMEM/F-12培养液，重悬后取2.5×10⁵个细胞，转移至15mL离心管；1000rpm离心5min，弃上清；

2)用预冷的PBS清洗细胞两次，弃上清，收集细胞沉淀用；

3)加400μL 1×Annexin V结合液重悬细胞；

4)加入5μL Annexin V-FITC染色液，轻柔混匀后避光置于4-8℃孵育15min；

5)加入10μL PI染色液后轻柔混匀置于4-8℃避光孵育5min；

6)1h内使用流式细胞仪检测。

实验结果如图5(表1)所示，表明莪术醇能够明显诱导子宫内膜间质细胞的凋亡。

表1.莪术醇诱导子宫内膜间质细胞凋亡检测

(7)莪术醇干预后的子宫内膜间质细胞的活性氧检测：

1)用1:1000无血清培养基稀释DCFH-DA，使其终浓度为10μM；

2)25.00μg/mL莪术醇干预4h后，胰酶消化获得5×10⁵个细胞，离心，用稀释好的DCFH-DA重悬；

3)37℃孵育20min；

4)用无血清培养基洗3遍，充分去除DCFH-DA；

5)流式上机检测。

实验结果如图6所示，表明莪术醇能够诱导子宫内膜间质细胞活性氧的产生。

最后需要说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。