本发明属于生物医药领域，涉及头孢呋辛酯的新用途，具体涉及头孢呋辛酯的药物组合物及其在脱发中的应用。
背景技术：
：头孢呋辛酯为头孢呋辛的乙酰乙酯。在体内水解后释出头孢呋辛而发挥其抗菌活性，头孢呋辛酯之作用机制、抗菌谱和抗菌作用皆与头孢呋辛同。与其他口服头孢菌素相比，头孢呋辛酯对革兰阳性球菌包括肺炎双球菌、A组(溶血性)链球菌和金葡菌作用并不弱，而对革兰阴性菌如淋球菌、流感杆菌、卡他摩拉菌和大肠杆菌科等的作用则优于头孢克洛(cefaclor)。头孢呋辛酯为第二代头孢菌素类抗生素。口服经胃肠道吸收后，在酯酶作用下迅速水解为头孢呋辛而发挥抗菌作用。对革兰阳性球菌的活性与第一代头孢菌素相似或略差，但对葡萄球菌和革兰阴性杆菌产生的β内酰胺酶显得相当稳定。除耐甲氧西林葡萄球菌、肠球菌属和李斯特菌属外，其他阳性球菌(包括厌氧球菌)对头孢呋辛酯均敏感。头孢呋辛酯对金黄色葡萄球菌的抗菌活性较头孢唑啉差，1～2mg/L的头孢呋辛酯可分别抑制对青霉素敏感和耐药的全部金黄色葡萄球菌。迄今为止，尚未见头孢呋辛酯及其药物组合物与脱发的相关性报道。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种头孢呋辛酯的药物组合物，该药物组合物中含有头孢呋辛酯和一种结构新颖的天然产物，头孢呋辛酯和该天然产物可以协同治疗脱发。本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：一种头孢呋辛酯的药物组合物，包括头孢呋辛酯、化合物(Ⅰ)和药学上可以接受的载体，制备成需要的剂型；所述化合物(Ⅰ)具有如下结构式：进一步地，药学上可以接受的载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体或润滑剂。进一步地，所述剂型包括片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。进一步地，所述剂型包括片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。进一步地，化合物(Ⅰ)是从防风中分离出来的天然化合物，它包含以下分离步骤：(a)将防风粉碎，用75～85％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中正丁醇取物用大孔树脂除杂，先用25％乙醇洗脱8个柱体积，再用70％乙醇洗脱12个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物；(c)步骤(b)中70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、45:1、25:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为72％的甲醇水溶液等度洗脱，收集10～16个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物(Ⅰ)。进一步地，化合物(Ⅰ)的制备方法中，所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂。上述头孢呋辛酯的药物组合物在制备治疗脱发的药物中的应用。本发明的优点：本发明提供的头孢呋辛酯的药物组合物中含有头孢呋辛酯和一种结构新颖的天然产物，头孢呋辛酯和该天然产物单独作用时，对脱发具有治疗作用；二者联合作用时，对脱发的治疗效果进一步提高，可以开发成治疗脱发的药物。本发明与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。具体实施方式下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。实施例1：化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证分离方法：(a)将防风(2kg)粉碎，用80％乙醇热回流提取(15L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用D101型大孔树脂除杂，先用25％乙醇洗脱8个柱体积，再用70％乙醇洗脱12个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物；(c)步骤(b)中70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1(10个柱体积)、45:1(8个柱体积)、25:1(10个柱体积)和15:1(8个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1(10个柱体积)、15:1(8个柱体积)和1:1(6个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为72％的甲醇水溶液等度洗脱，收集10～16个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物(Ⅰ)(HPLC归一化纯度大于98％)。结构确证：HR-ESI-MS显示[M+H]+为m/z469.3238，结合核磁特征可得分子式为C30H44O4，不饱和度为9。核磁共振氢谱数据δH(ppm，CDCl3，600MHz)：H-1(1.49，m)，H-1(2.87，ddd，J＝13.3，7.0，4.2Hz)，H-2(2.41，ddd，J＝15.4，6.8，4.2Hz)，H-2(2.65，ddd，J＝15.4，11.2，7.0Hz)，H-5(1.37，d，J＝11.2Hz)，H-6(1.68，m)，H-6(1.93，m)，H-7(1.73，m)，H-7(1.87，m)，H-9(1.60，d，J＝9.4Hz)，H-11(4.17，d，J＝9.1Hz)，H-15(5.43，d，J＝10.3Hz)，H-16(5.52，d，J＝10.3Hz)，H-18(2.46，d，J＝8.4Hz)，H-19(1.41，m)，H-20(1.10，m)，H-21(1.28，m)，H-21(1.48，m)，H-22(1.36，m)，H-22(1.51，m)，H-23(1.32，s)，H-24(9.82，s)，H-25(1.06，s)，H-26(1.17，s)，H-27(1.24，s)，H-28(0.87，s)，H-29(0.90，d，J＝6.3Hz)，H-30(0.93，d，J＝6.1Hz)，OH-11(3.13，s)，OH-12(4.73，brs)；核磁共振碳谱数据δC(ppm，CDCl3，125MHz)：39.2(CH2，1-C)，22.3(CH2，2-C)，207.6(C，3-C)，34.5(C，4-C)，63.2(CH，5-C)，20.4(CH2，6-C)，40.9(CH2，7-C)，57.8(C，8-C)，51.6(CH，9-C)，38.2(C，10-C)，71.9(CH，11-C)，146.7(C，12-C)，119.2(C，13-C)，36.3(C，14-C)，128.9(CH，15-C)，139.5(CH，16-C)，41.4(C，17-C)，47.3(CH，18-C)，40.1(CH，19-C)，40.7(CH，20-C)，30.7(CH2，21-C)，39.2(CH2，22-C)，22.3(CH3，23-C)，201.1(CH，24-C)，15.7(CH3，25-C)，19.4(CH3，26-C)，20.9(CH3，27-C)，19.1(CH3，28-C)，17.2(CH3，29-C)，21.3(CH3，30-C)。红外波谱表明该化合物含有羟基(3478cm-1)，羰基(1760cm-1)，双键(1663cm-1)和醛基(1641cm-1)。13C-NMR、DEPT和HSQC谱中显示有30个碳信号，包括七个甲基，六个亚甲基，九个次甲基(一个连氧碳和两个烯烃碳，一个醛基)，以及八个季碳(一个酮基，一个含氧烯属季碳，一个烯属季碳)，以上功能结构再结合不饱和数表明该化合物为五环三萜结构。1H-NMR谱结合HSQC谱显示的五个叔甲基质子信号δH1.32(3H，s)，1.06(3H，s)，1.17(3H，s)，1.24(3H，s)和0.87(3H，s)，两个仲甲基质子信号δH0.90(3H，d，J＝6.3Hz)，0.93(3H，d，J＝6.1Hz)以及1H-NMR数据表明该化合物为乌苏烷型三萜类化合物。HMBC谱中H-5和H3-23与C-24的相关性表明C-4位连有一个醛基，NOESY谱中H-24与H3-25的相关信号暗示醛基处在β位。从红外谱中可知结构中含有羟基，而从1H-NMR数据可知含有两个羟基。HMBC谱中H-9和H-18与C-12，H-18和H3-27与C-13，OH-12与C-12相关信号以及它们的碳化学位移表明该化合物存在烯醇式结构，羟基连接在C-12位与C-12和C-13形成的双键构成烯醇式结构，此外根据HMBC谱中OH-11与C-11的相关信号以及化学位移确认另一个-OH连在C-11位。另C-15与C-16也形成双键结构，C-3位形成酮基。HMBC谱中H3-23和H-24与C-3的相关性以及它们的碳化学位移进一步确证C-3位形成酮基。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如下所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致。该化合物化学式及碳原子编号如下：实施例2：药理作用脱发是一种最常见皮肤疾病。长期以来，人们一直致力于寻找和研发治疗脱发的药物，如糖皮质激素、米诺地尔等。然而到目前为止，尚没有一种药物能完全治愈脱发，且存在较大的不良反应。因此，开发疗效确切、无不良反应的防治脱发的药物具有重要的社会意义和经济意义。本实施例采用环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)建立小鼠脱毛模型，观察药物对改善脱毛小鼠毛发生长的作用。1、材料与方法1.1动物SPF级，雄性C57BL/6小鼠，体质量18～20g，上海斯莱克实验动物有限公司。饲养环境：室温控制在24～26℃，光线每12h明暗交替，自由进食，隔日更换垫料。1.2试剂与样品头孢呋辛酯购自中国药品生物制品检定所。化合物(Ⅰ)自制，制备方法见实施例1。环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司)。CBA检测试剂盒(美国，BD公司)、CD4检测试剂盒(上海颖心实验室设备有限公司)、CD8检测试剂盒(上海颖心实验室设备有限公司)。1.3仪器JEM-1010型电镜(日本，日本电子公司)、C6型流式细胞仪(美国，BD公司)、MK3型酶标仪(美国，Thermo公司)。1.4小鼠分组及模型制备C57BL/6小鼠用麻醉机麻醉。麻醉后，将松香和石蜡按1∶1的比例混合加热融化，并均匀涂抹于项背部，凝固变硬后揭去，诱导生长期毛发，每只小鼠脱毛面积约为2.0cm×2.0cm。注意不要烫伤小鼠皮肤。脱毛后9天(小鼠背部皮肤诱导生长期毛囊产生)，根据随机数字表，将小鼠分为5组，每组20只，分别是空白对照组、模型对照组、头孢呋辛酯组(280mg·kg-1)、化合物(Ⅰ)组(280mg·kg-1)、头孢呋辛酯与化合物(Ⅰ)组合物组【140mg·kg-1头孢呋辛酯+140mg·kg-1化合物(Ⅰ)】。所有小鼠脱毛区皮下注射CTX150mg/kg后，模型组任其自然生长，空白对照组给予生理盐水(100mg/kg)灌胃治疗，其他组药物灌胃治疗，持续8周。1.5组织取材分别在给药后1、2、4、8周，每组随机选取小鼠各5只，行眼眶采血，每只1～2mL。用于ELISA检测：每组取2个血样，加入EDTA抗凝，3000r/min离心30min取上清，于－20℃保存备用。用于流式细胞术检测：每组取3个血样，分离血清，于-70℃保存备用。所有动物取血后立即处死，取其脱毛区域皮肤组织。经10％福尔马林固定，常规石蜡包埋，石蜡切片，切片厚4～5μm，-80℃下保存备用。1.6ELISA检测外周血CD4+、CD8+表达水平样本室温下平衡20min。设置标准品孔、样本孔和空白孔。空白孔什么都不加，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。待测样本先加样本稀释液40μL，再加待测样本10μL，随后标准品孔和样本孔(空白孔不加)加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃恒温箱孵育60min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，重复5次。所有孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。加终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔OD值。统计CD4和CD8的OD值，将CD4/CD8均值作为结果进行统计分析。1.7统计学方法结果以均数±标准差(x±s)表示。采用SPSS17.0统计软件分析数据，组间比较应用单因素方差分析。2、实验结果2.1体质量变化和毛发生长情况小鼠经CTX诱导脱毛至实验结束，各组小鼠体质量无明显差异(P＞0.05)。脱毛小鼠经头孢呋辛酯、化合物(Ⅰ)、头孢呋辛酯与化合物(Ⅰ)组合物给药后1～2周，各组小鼠脱毛区局部皮肤由粉色逐渐转变成灰黑色，小鼠脱毛区皮肤灰黑色区域明显比模型组和生理盐水组要大；给药至4～8周，各组小鼠脱毛区呈黑色，且有毛发逐渐长出、伸长。给药组毛发相对于模型组和生理盐水组，毛发更为致密。2.2对脱毛小鼠外周血CD4+/CD8+比值表达水平的影响头孢呋辛酯组、化合物(Ⅰ)组、头孢呋辛酯组与化合物(Ⅰ)组合物组外周血CD4+/CD8+比值随着时间的延长，呈下降趋势。1、2、3、4周，与模型对照组比，头孢呋辛酯组与化合物(Ⅰ)组合物组外周血CD4+/CD8+比值显著下降(P＜0.01)；与模型对照组比，头孢呋辛酯组、化合物(Ⅰ)组外周血CD4+/CD8+比值下降(P＜0.05)。试验结果见表1。表1对脱毛小鼠外周血CD4+/CD8+比值表达水平的影响组别1周2周3周4周模型对照组5.48±0.065.37±0.054.99±0.094.83±0.11头孢呋辛酯组5.15±0.054.76±0.064.40±0.174.12±0.08化合物(Ⅰ)组4.87±0.024.34±0.134.16±0.063.65±0.27头孢呋辛酯与化合物(Ⅰ)组合物组3.94±0.043.67±0.023.29±0.252.94±0.08脱毛模型最常用实验动物为C57BL/6小鼠，由于其为有色种属，皮肤颜色随毛囊的发育而表现不同的颜色，是研究毛囊发育和再生一种很好的实验动物。目前关于脱发的病理生理机制尚未明确，可能的原因主要与局部感染、神经毒物、精神抑郁、内分泌因素等因素相关。近年来随着遗传、基因、分子水平的不断发展，国内外诸多学者认为脱发主要是一种由T细胞免疫介导的自身免疫性炎症疾病，由于毛囊异常暴露于潜在免疫活性的免疫系统，再通过毛囊的抗原物质激活强大的免疫系统，诱发释放大量炎症，继而引起脱发。CD4+和CD8+T细胞在脱发患者毛囊内及周围的浸润是引起毛发脱落的关键，CD8+T细胞一直被认为对毛囊发挥直接的细胞毒作用，而CD4+T细胞起辅助细胞作用，在脱发的发病过程中两者是共同发挥作用的。头孢呋辛酯、化合物(Ⅰ)、头孢呋辛酯组与化合物(Ⅰ)组合物维持治疗对脱毛小鼠具有明显疗效，显著改善了小鼠脱毛区的毛发生长情况，通过下调外周血CD4+/CD8+比值来发挥作用，为临床脱发的药物治疗提供了新的治疗方案。其中，头孢呋辛酯和化合物(Ⅰ)联合作用时，对毛发生长的改善作用效果显著，优于头孢呋辛酯或化合物(Ⅰ)单独的作用效果，可以开发成防治脱发的药物。上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。当前第1页1 2 3