一种具有防治病毒性心肌炎作用的中药及其制备方法与流程

本发明属于中药领域，尤其是涉及一种具有防治病毒性心肌炎作用的中药及其制备方法。

背景技术：

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是病毒侵犯人体心脏组织实质或间质而引起的局限性或弥漫性病变，其病理变化主要是广泛或散在的心肌细胞坏死及周围间质细胞浸润。引起VMC最常见的病原体是柯萨奇B组病毒(coxsackie viruses group B，CVB)、腺病毒C组等较常见的病原体。近年来此病发病率有增多趋势，多数患者可完全恢复正常的心功能，少数患者临床症状可改善，但会遗留心功能不全，极少数患者进行性心脏扩大，可能转化为扩张性心肌病、慢性心力衰竭而死亡。

中医学无“病毒性心肌炎”病名，但根据其临床表现可归入“心悸”、“怔忡”、“胸痹”、“虚劳”、“温毒”、“猝死”等范畴。病因多为外感温热毒邪所致；病机关键为热毒淫心、气阴两虚；病位在心，与肺、脾关系密切。早期以热毒袭肺、侵心为主，随即转为气虚、阴虚、气虚血瘀等证。

病毒性心肌炎至今仍无特效疗法。现代医学研究表明，尽管CVB和腺病毒Z属于不同的病毒科，但可以和一共同的细胞(HeLa细胞)受体结合为柯萨奇病毒和腺病毒受体(coxsackie virus andadenovirus receptor，CAR)。编码CAR和小鼠CAR的CDNA克隆已分离出来，并且小鼠CAR同样可以作为CVB和腺病毒Z与靶细胞结合的受体，这对于探讨VMC的发病机制以及开拓新的治疗策略具有重要意义。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，申请人通过长期临床实践，总结出病毒性心肌炎的发病机理主要是外邪入侵、热毒淫心、心血亏虚，提出清热毒、复气阴、通血脉的养阴活血透毒方法，取得了可靠的临床疗效。

为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

一种具有防治病毒性心肌炎作用的中药，所述中药由以下物质组成：生黄芪、玄参、麦冬、虎杖、丹皮的处方剂量比为3∶1.5∶1∶1∶1。

作为本发明的优选技术方案，所述中药的剂型为汤剂、丸剂、膏剂、冲剂、口服液剂、胶囊剂、片剂、注射剂中的任何一种。

如上所述的具有防治病毒性心肌炎作用的中药的制备方法，包括如下步骤：

按比例合并水提后合并过滤、加质量百分比浓度60％～70％的乙醇，充分搅拌，静置得沉淀物即为所得中药。

作为本发明的优选技术方案，还包括将沉淀物浓缩、干燥步骤。

作为本发明的优选技术方案，所述水提次数至少为3次，水提时间分别为50min、40min、30min。

采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：黄芪为君药，益气透毒、补益脾肺之气；玄参、丹皮为臣药，清热凉血，虎杖、麦冬为佐药，可清热解毒养心，防心气好散。本方解毒益气，养阴清热、凉血养心。病毒性心肌炎是指人体感染嗜心性病毒，引起心肌非特异间质性炎症，可呈局限性或弥漫性。以心悸、胸闷胸痹或头晕乏力为主要临床表现，可归属于中医学“心悸”、“胸痹”、“温毒”等范围，病因多为外感温热毒邪所致，病机关键为热毒淫心，气阴两虚，病位在心，与肺、脾关系密切。中医认为病毒性心肌炎的发病机理主要是阴分血分热毒，经过长期临床实践，提出热毒清、气阴复、血脉通的养阴活血透毒方法，取得了可靠的临床疗效。

附图说明

图1是病理HE染色观察各组大鼠心肌的形态变化(光学显微镜，×400)；

图2是病理HE染色观察各组大鼠胸腺的形态变化(光学显微镜，×400)；

图3是病理HE染色观察各组大鼠脾脏的形态变化(光学显微镜，×400)。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图对本发明做进一步解释说明。

中药的制备

生黄芪30g、玄参15g、麦冬10g、丹皮10g、虎杖10g五味药采用传统方法结合现代工艺，称取全方所需药量，第一次加入药量10倍的水提取50min后，剩余的药渣再次加入药渣量8倍的水提取40min，然后剩余的药渣再次加入药渣量8倍的水提取30min，最后合并过滤浓缩至45升，加质量百分比浓度60％-70％乙醇，充分搅拌，静置24小时，得沉淀，上清液回收乙醇，60℃减压浓缩，浸膏备用。

观察本发明所述中药对病毒性心肌炎小鼠的干预作用

将小鼠随机分为5组，每组15只。即阳性药对照(利巴韦林，117mg/kg/d+辅酶Q，3.9mg/kg/d)组、本发明所述中药大剂量组(14.0g生药/kg/d)、小剂量组(7.0g生药/kg/d)及正常对照组，腹腔接种CVB3病毒液建立病毒性心肌炎模型，灌胃给药时间为28d。观察比较不同时段5组小鼠心肌组织形态学改变，同时进行血清肌钙蛋白T(cTnT)、白介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子(TNF-α)血清和组织中含量的检测。结果显示，本发明所述中药可使小鼠心肌组织坏死程度减轻，范围缩小，受损害的心肌组织逐渐修复，对小鼠心肌组织和血液中IL-2和TNF-α含量及水平均有一定的降低作用(P<0.05，P<0.05)。因此，本发明所述中药对早期病毒性心肌炎小鼠有一定疗效，并能减少血清和组织中炎症因子的含量发挥抗病毒的作用。

本发明所述中药对实验性柯萨奇B3病毒性心肌炎保护作用的研究

1实验材料

实验动物，60只，清洁级，ICR(Institute of Cancer Researcch，ICR)小鼠，雌雄各半，周龄为4～6周，体重18～20g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。动物许可证编号：SCXK(京)2008-0009。清洁级动物室饲养，定时给与全价营养饲料喂食，室内温度控制23～26℃，湿度50％～70％。

本发明所述中药剂药物组成：生黄芪、麦冬、虎帐、玄参、丹皮。制备药液，每毫升生药含量控制为2.0g生药/ml，由中国中医科学院西苑医院中药制剂室提供，具体制备方法如前面所述；辅酶Q胶囊，10mg/粒，上海信宜药厂有限公司生产，批号：090903；利巴韦林片，100mg/片，由湖北纽兰 药业公司生产，批号：20091101。

2实验方法

2.1病毒性心肌炎模型建立及分组 50只小鼠腹腔接种0.3mL CVB₃诱导小鼠VMC模型(VMC)，在隔离实验室饲养，小鼠柯萨奇病毒(Coxsachievirus)IgG、IgM酶联免疫检测阳性入选实验研究。小鼠腹腔接种0.3mL CVB₃诱导小鼠VMC模型(VMC)，在隔离清洁动物室饲养。按随机表随机分为模型组10只，灌胃等量蒸馏水；阳性药物组10只，给与利巴韦林片117mg/kg/d和辅酶Q 3.9mg/kg/d；本发明所述中药小剂量组10只，7.0g生药/kg/d；本发明所述中药大剂量组10只，14.0g生药/kg/d。另取10只小鼠同法接种0.3mL不含病毒的Eagle液，饲养于常规清洁动物室，作为假手术组(对照组)，灌胃等量蒸馏水。所灌胃药物稀释同等容量，72h后开始灌胃给药，灌胃28d，正常组和模型组灌胃等体积的蒸馏水。

2.2血清和病理标本取材灌胃结束后，麻醉小鼠，每组随机选出5只动物，无菌取出心脏、胸腺和脾脏组织，生理盐水冲洗干净，于10％中性甲醛溶液固定，做病理和免疫组织化学染色。小鼠全部取血，1509.30g离心力/min离心15min，于-80℃保存待测。取出心脏组织，用冷冰水冲洗后，取心尖部位心肌组织100mg，加入2ml低温生理盐水(0℃)，高速分散机(Ultra TurraxT18，德国IKA集团公司生产)匀浆后，离心取上清液，于-80℃保存待测。

2.3实验分组病毒诊断及炎症标本检测小鼠柯萨奇病毒IgG、IgM酶联免疫检测试剂盒，采用ELISA法检测；血中IL-2、TNF-α含量测定，均采用ELISA法检测。酶标仪(Multiskan MK3型,芬兰雷勃生物医学有限公司)的操作过程严格按说明书程序进行。心肌组织IL-2、TNF-α含量用放射免疫方法测定，r-911型全自动放射免疫计数仪(中国科技大学实业总公司生产)，同时用考马斯亮蓝蛋白测定法检测每个组织标本的蛋白含量，得出数值后，将每毫升匀浆液中的细胞因子含量换算成每毫克蛋白中的细胞因子含量。

2.4病理及免疫组织化学检测固定的病理组织经过脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋。连续切片约5μmm厚，捞片于多聚赖氨酸防脱处理过的载玻片上。根据SABC试剂盒说明书操作，大鼠心肌、胸腺、脾脏切片常规脱腊，封闭内源性过氧化物酶，10％正常山羊血清封闭。分别滴加一抗IL-2抗体 (1:200)和TNF-α抗体(1:400)，37℃孵育1h，磷酸缓冲液(PBS)冲洗；滴加二抗生物素化山羊抗小鼠IgG，室温20min，PBS溶液冲洗；滴加SABC复合物，室温20min，PBS溶液冲洗；DAB-H₂O₂显色，苏木素轻度复染；乙醇脱水、透明、中性胶封片，选取同批染色切片进行光学显微镜下观察。每张切片随机选取3个不重叠的视野(×400)，每只共计15个视野，以心肌炎症部位的胞浆染成棕褐色为阳性细胞标志，采用显微彩色图像处理系统(DpxView Pro型，丹麦DeltaPix公司生产)分析每只动物心肌组织IL-2、TNF-α阳性细胞的面积。

2.5统计学处理所有数据以均数±标准差(x±s)表示，使用SPSS16.0软件进行统计学分析。单因素方差分析各组别之间的差异，组间两两比较采用LSD法，P<0.05表示差异有统计学意义。

3.实验结果

3.1本发明所述中药对小鼠心肌、胸腺和脾脏组织病理形态的影响

正常对照组小鼠心肌HE染色可见心肌细胞排列整齐，细胞间隙紧凑，未见空泡变性及单核细胞浸润感染；胸腺髓质和皮质界限清晰，淋巴细胞和上皮网状细胞排列整齐，小叶形状清晰；脾脏组织红髓和白髓组织结构清晰。CVB3接种后小鼠心肌充血严重，间质水肿，裂隙增大，心肌细胞出现浑浊肿胀，细胞横纹模糊不清，可见灶状分布的炎性细胞浸润；胸腺组织有水肿，细胞界限模糊，皮质中的淋巴细胞受损；脾脏组织可见淋巴组织间隙增大，有炎症细胞浸润。灌胃本发明所述中药28d后，小鼠心肌组织炎性细胞浸润减少，还可见心肌组织充血水肿，心肌细胞坏死等病理改变，但心肌病理受损程度明显见减轻；胸腺织皮质的淋巴细胞明显清晰，水肿逐步消退；脾脏致密网状组织有显著改善。结果见图1、2、3。

3.2本发明所述中药对CVB₃病毒感染小鼠心肌组织IgG、IgM的影响

免疫学检测结果表明，和正常小鼠心肌组织比较，接种CVB₃ 28d后小鼠心肌组织IgG水平增高显著(P<0.05)，利巴韦林+辅酶Q和本发明所述中药大剂量组可以显著降低IgG含量，与模型组比较有统计学差异(P<0.05)。28d后小鼠心肌组织IgM水平趋于下降，和正常小鼠心肌组织比较无显著差异(P>0.05)。结果见表1。

表1.本发明所述中药对CVB₃感染小鼠心肌组织IgG、IgM的影响(n＝10，)

注：与正常组比较，▲P<0.05；与模型组比较，*P<0.05

3.3本发明所述中药对小鼠心肌组织IL-2、TNF-α含量的影响

28d后，模型组小鼠心肌IL-2、TNF-α含量仍然高于正常组水平，有统计学差异(P<0.01，P<001)。本发明所述中药大剂量组具有降低大鼠IL-2和TNF-α含量的作用，和模型组比较有统计学意义(P<0.01，P<0.01)。结果见表2。

表2.本发明所述中药对CVB₃感染小鼠心肌组织IL-2、TNF-α含量的影响(n＝10，)

3.4本发明所述中药对小鼠血清cTnT、IL-2、TNF-α水平的影响

动物接种CVB₃ 28d后，血清cTnT含量高峰已经回落，虽然cTnT异常水平持续时间较长，但各组之间无统计学差异。本发明所述中药大剂量组对大鼠IL-2和TNF-α水平有显著降低作用，和模型组比较有统计学意义(P<0.05，P<0.05)。各给药组之间无显著差异，结果见表3。

表3.本发明所述中药对CVB₃感染小鼠血清cTnT、IL-2、TNF-α的影响 (n＝10，)

注：与模型组比较，*P<0.05

中医认为病毒性心肌炎的发病机理主要是阴分、血分热毒，可归属于中医学“心悸”、“胸痹”、“温毒”等范围。本方以黄芪为君药，益气透毒、补益脾肺之气；玄参、丹皮为臣药，清热凉血，虎杖、麦冬为佐药，可清热解毒养心，防心气好散。以上方药共奏解毒益气，养阴清热、凉血养心之功效。柯萨奇B组病毒引起的心肌炎表现为间质的单核细胞浸润，伴有一定程度的水肿和心肌纤维坏死，左心室扩张及肥厚，镜下为致密纤维组织及慢性炎症细胞浸润。病理过程中的组织形态学检查是最直接、最客观指标，而心肌炎病程早期又以病毒对心肌损伤为主，因此心肌中病毒含量检测可反映心肌病变程度。

本研究通过动物实验检测CVB₃具有较强的心肌亲嗜性，并且病理检查发现心肌细胞水肿，间隙增大，炎症细胞浸润，造成了心肌的永久性损伤。而中药抗病毒的主要途径是药物对病毒的直接抑制或损伤作用，间接抗病毒作用是中药通过对机体免疫系统的调节而起到，这是中药抗病毒机制中不可忽视的重要方面。免疫球蛋白，是人体B淋巴细胞激活后转变P细胞而产生的。IgM是人体受到感染产生早期的免疫球蛋白，也是初次体液免疫应答中最早出现的抗体，而IgG则产生要晚一些，临床用于感染后期或既往感染的指标。实验结果表明，利巴韦林+辅酶Q和本发明所述中药颗粒大剂量可以显著降低IgG含量，维持机体的免疫机制平衡。具有多种生物活性的细胞因子TNF-a、IL-2与VMC的发病过程及病情程度存在一定的关系，对其的检测对进一步的研究和治疗心肌炎病情诊断和治疗将具有重要的临床价值。实 验结果表明，本发明所述中药具有降低CVB₃感染后心肌及血清中炎症因子含量的作用，阻断细胞炎症因子的作用，使心肌损伤明显改善。通过实验表明，本发明所述中药能减少CVB₃病毒性心肌炎小鼠的血清IgM阈值，降低组织中炎症因子的水平，对小鼠早期病毒性心肌炎具有防治作用。

对比例

对比试验与本发明中的中药制备方法完全相同，不同的是配伍，其中，生黄芪30g、玄参10g、麦冬10g、丹皮10g、虎杖15g，将得到的中药采用与本发明相同的方法进行检测，其中，对CVB₃感染小鼠心肌组织IL-2、TNF-α含量的影响没有太大变化，本发明所述中药对CVB₃感染小鼠血清cTnT、IL-2、TNF-α的影响没有太大变化，唯一有较大变化的是对CVB₃感染小鼠心肌组织IgG、IgM的影响，具体结果如下表4所示。

表4.对比例所述中药对CVB₃感染小鼠心肌组织IgG、IgM的影响(n＝10，)

从表4可以看出，采用对比例所述的中药配伍得到的中药IgG高于本发明所述中药的值，而IgM阈值范围高于本发明所述中药的值，由此可见，本发明所述的中药取得了预料不到的技术效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。