本发明涉及医药
技术领域：
，尤其涉及campneosideII的用途。
背景技术：
：脑血管疾病是世界最常见的疾病之一，因其发病率高、致残率高、死亡率高的特点，严重威胁人类生命与健康。缺血性脑血管病(ischemiccerebrovasculardisease,ICVD)指供应大脑血流的主要动脉发生狭窄或闭塞，结果导致脑组织(特别是大脑中动脉区域)急剧缺血缺氧，最终引起局部脑组织发生缺血或坏死,出现相应的临床症状。缺血性脑卒中后可通过溶解血栓或机械再通的方式恢复缺血区的血液灌注，但一些病人在缺血后再灌注后不仅没有使组织功能恢复,反而使缺血所致的功能障碍和结构破坏进一步加重，即我们所说的脑缺血再灌注损伤(cerebralischemia-reperfusion(IR)injury)。脑缺血再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程，近来研究发现,脑血流中断和再灌注使脑的细胞产生损伤是一个快速的级联反应，这个级联反应包括许多环节，如能量障碍、细胞酸中毒、兴奋性氨基酸释放增加、细胞内钙失稳态、自由基生成、凋亡基因激活等。这些环节互为因果，彼此重叠，并相互联系，形成恶性循环，最终导致细胞凋亡或坏死。目前虽然对脑缺血的病理生理机制研究取得重大进展，但治疗选择仍然有限。目前，常见的治疗脑缺血疾病药物有尼莫地平、消苯地平缓释片、西比灵等，但是这些药副作用较强。近年来，中药治疗脑缺血疾病的研究逐渐引起人们的关注，而且由于很多中药组分属于天然提取药物，具有副作用小等优点。CampneosideII是从中药植物中提取苯乙醇苷类成分，其结构如式I所示：药理研究表明，该化合物具有壮阳、抗氧化、增强记忆力等多种作用。但是目前未见CampneosideII在制备治疗脑缺血疾病药物中应用的报道。技术实现要素：有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供campneosideII的用途，实验表明，campneosideII对缺糖缺氧-复糖复氧损伤后神经细胞存活率及细胞内活性氧含量均有明显的改善作用；同时在体内能显著的降低大脑中动脉缺血再灌注模型大鼠的脑梗死面积，表明该化合物具有治疗脑缺血疾病的作用和应用价值。本发明提供了CampneosideII在制备改善缺糖缺氧-复糖复氧损伤后细胞内活氧异常升高的药物中的应用。本发明实施例中进行试验的细胞为神经细胞；具体为人骨髓神经母细胞瘤；优选的，细胞株为SH-SY5Y。CampneosideII用于改善缺糖缺氧-复糖复氧损伤后细胞内活氧异常升高的浓度为25μg/mL～100μg/mL；优选的，浓度为50μg/mL。活性氧类(Reactiveoxygenspecies,ROS)，是生物有氧代谢过程中的一种副产品，包括氧离子、过氧化物和含氧自由基等。研究表明，ROS的异常升高与细胞的损伤、凋亡密切相关。以含DCFH-DA的荧光探针采用荧光酶标仪进行荧光检测。结果表明，细胞化学方法缺氧缺糖/复氧复糖损伤后，细胞存活率明显下降及细胞内活性氧异常升高，campneosideII高、中、低剂量组可以显著调节连二亚硫酸钠导致的SH-SY5Y细胞活性氧异常升高，对细胞生长、损伤具有保护作用。本发明提供了CampneosideII在制备保护缺糖缺氧-复糖复氧对细胞损伤的药物中的应用。本发明实施例中进行试验的细胞为神经细胞；具体为人骨髓神经母细胞瘤；优选的，细胞株为SH-SY5Y。CampneosideII用于保护缺糖缺氧-复糖复氧对细胞损伤的浓度为25μg/mL～100μg/mL；优选的，浓度为50μg/mL。缺糖缺氧-复糖复氧的过程中，细胞会产生一系列的反应，包括如能量障碍、细胞酸中毒、兴奋性氨基酸释放增加、细胞内钙失稳态、自由基生成、凋亡基因激活等。进而导致细胞的凋亡或坏死。在具体实施方式中，本发明采用MTS法测定campneosideII对连二亚硫酸钠所致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用，结果表明campneosideII高、中、低剂量组可以显著调节连二亚硫酸钠导致的SH-SY5Y细胞存活率，对细胞生长、损伤具有保护作用。实验表明，缺糖缺氧-复糖复氧损伤1h、复氧给药3h后，模型组的细胞存活率为67.16％，与溶剂对照组(DMSO组)比较有显著差异(P＜0.01)；阳性药及药物组作用3h后，细胞保护率明显增加，与模型组比较有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)。其中以CampneosideII化合物中剂量组对神经保护作用最好，可以明显改善缺糖缺氧-复糖复氧损伤所致细胞损伤，对其具有较好的保护作用。本发明还提供了CampneosideII在制备改善脑缺血再灌注后神经功能缺失的药物中的应用。神经功能缺失(neurodeficitscore,NDS)是脑缺血或脑缺血再灌注后常见的症状，按照longa评分标注，分为5个不同的程度。本发明实验表明，大脑中动脉缺血再灌损伤大鼠神经功能缺失评分可知，除假手术组外，各组动物清醒后出现不同程度的神经功能损伤，向患侧转圈、倾倒、不能站立、不能行走等，根据Longa5分制评分标准进行评分，1分以上即为模型成功，说明各组动物建立模型成功可用于后续实验。而给予CampneosideII的动物评分与模型组相比具有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)，说明CampneosideII对脑缺血再灌注后神经功能缺失具有改善作用。本发明还提供了CampneosideII在制备改善脑缺血再灌注后脑梗死的药物中的应用。脑梗死又称缺血性卒中，系由各种原因所致的局部脑组织区域血液供应障碍，导致脑组织缺血缺氧性病变坏死，进而产生临床上对应的神经功能缺失表现。本发明以灌胃(口服)给药方式测定campneosideII对大脑中动脉阻塞致缺血大鼠脑损伤的保护作用，结果表明，campneosideII能显著的降低大脑中动脉缺血再灌注模型大鼠的脑梗死面积，campneosideII对脑缺血损伤具有保护作用。基于以上实验结果，本发明还提供了CampneosideII在制备治疗和/或预防脑血管疾病的药物中的应用；所述脑血管疾病包括缺血性脑血管病和/或脑缺血再灌注损伤。一些实施例中，CampneosideII治疗脑血管疾病的剂量为6.5mg/kg·d-1～26mg/kg·d-1。优选的，CampneosideII治疗治疗脑血管疾病的剂量为26mg/kg·d-1。本发明还提供了一种治疗和/或预防脑血管疾病的药物，其中包括CampneosideII。本发明提供的治疗和/或预防脑血管疾病的药物中还包括药学上可接受的辅料。本发明提供的治疗和/或预防脑血管疾病的药物具体用于防治缺血性脑血管病和/或脑缺血再灌注损伤。本发明提供的治疗和/或预防脑血管疾病的药物的剂型为口服给药剂型、注射给药剂型、外用给药制剂。所述口服给药剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂。所述注射给药剂型为注射液剂或注射用粉针剂。所述外用给药制剂为栓剂、贴剂或凝胶剂。一些实施例中，治疗和/或预防脑血管疾病的片剂中包括：CampneosideII、淀粉、羧甲基淀粉钠、滑石粉、糊精、硬脂酸镁和淀粉浆。具体的，CampneosideII、淀粉、羧甲基淀粉钠、滑石粉、糊精与硬脂酸镁的质量比为350：5:7.5:0.8:50:0.8。一些实施例中，治疗和/或预防脑血管疾病的胶囊剂的内容物中包括：CampneosideII、淀粉、低取代羟丙基纤维素、微粉硅胶、硬脂酸镁和淀粉浆。具体的，CampneosideII、淀粉、低取代羟丙基纤维素、微粉硅胶与硬脂酸镁的质量比为350:32:6:4.5:1.5。一些实施例中，治疗和/或预防脑血管疾病的颗粒剂中包括：CampneosideII、蔗糖和糊精。具体的，CampneosideII、蔗糖和糊精的质量比为350:1000:500。一些实施例中，治疗和/或预防脑血管疾病的丸剂中包括：CampneosideII、聚乙二醇-6000和聚山梨酯-80。具体的，CampneosideII、聚乙二醇-6000和聚山梨酯-80的质量比为350:12:80.5。一些实施例中，治疗和/或预防脑血管疾病的注射液剂中包括：CampneosideII、大豆磷脂、甘油和水。具体的，CampneosideII的浓度为200g/L；大豆磷脂的浓度为15g/L；甘油的浓度为25g/L。注射时，将治疗和/或预防脑血管疾病的注射液剂稀释后，静脉滴注；所述稀释采用5％葡萄糖注射液；所述稀释的比例为1:250。本发明同时还提供了一种治疗和/或预防脑血管疾病的方法，其为给予本发明提供的治疗和/或预防脑血管疾病的药物。所述给予为口服或注射。本发明提供的治疗和/或预防脑血管疾病的药物每天的口服剂量以CampneosideII的质量计为6.5mg/kg动物体重～26mg/kg动物体重。优选为26mg/kg动物体重。本发明提供了campneosideII的用途，实验表明，campneosideII对缺糖缺氧-复糖复氧损伤后神经细胞存活率及细胞内活性氧含量均有明显的改善作用；同时在体内能显著的降低大脑中动脉缺血再灌注模型大鼠的脑梗死面积，表明该化合物具有治疗脑缺血疾病的作用和应用价值。具体实施方式本发明提供了campneosideII的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明采用的药品、生物材料或仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1campneosideII对连二亚硫酸钠所致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用1.实验材料SH-SY5Y细胞系，南京凯基生物科技发展有限公司；RPMI-1640培养基(gibco，批号：8113041)，无糖RPMI-1640培养基(gibco，批号：124813)，胎牛血清(gibco，批号：608759)，胰蛋白酶(Biotopped，批号：BH01018)，尼莫地平(中国药品生物制品检定所，批号：00270-200002)，DMSO(sigma，批号：RNBC6511)，连二亚硫酸钠(国药集团化学试剂有限公司，批号T20101206)，CCK-8细胞毒性检测试剂盒(贝博)，脂质氧化检测试剂盒(碧云天)，总SOD活性检测试剂盒(碧云天)，DCFH-DA(sigma)，SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞株购于中国科学院典型培养物保藏中心上海细胞库。2、实验方法2.1细胞培养与给药细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24小时，吸弃上清，按照实验要求分为空白组、模型组、阳性药组、提取物组。空白组给予完全培养基100μL，其余各组给予100μL含终浓度为20mmol/L的连二亚硫酸钠的无血清无糖培养基100μL。缺糖缺氧1h，PBS清洗细胞孔一次，空白组和模型组给予完全培养基100μL，给药组给予完全培养基配制的终浓度为20μmol/L的尼莫地平溶液和CAMPNEOSIDE高剂量(100ug/mL)、中剂量(50ug/mL)、低剂量(25ug/mL)II溶液各100μL。复氧3h后，进行细胞活性、活性氧(ROS)检测。2.2MTS测定各孔加入MTS溶液20μL，同时设置空白孔(培养基和MTS，无细胞)和对照孔(不加培养基和MTS，有细胞)。37℃孵育4h后，酶标仪在490nm测定吸光度，按公式：存活率＝(不同给药组OD490/DMSO组OD490)*100％计算各组细胞存活率。。2.3细胞内活性氧(ROS)的测定PBS清洗细胞孔一次，各孔加入含DCFH-DA荧光探针(10nM/L)的PBS液100μL，37℃暗处孵育20min后，荧光酶标仪进行荧光检测。3、实验结论表1campneosideII对连二亚硫酸钠致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用(n＝3)注：△△P＜0.01，与正常对照组比较；**P＜0.01，与模型对照组比较。表2campneosideII对连二亚硫酸钠致SH-SY5Y细胞损伤的ROS的影响(n＝3)组别FLUO±SD正常对照组126.41±6.10模型对照组384.25±19.30△△阳性对照组263.21±15.12**低剂量295.32±10.58**中剂量305.45±9.87**高剂量290.12±7.15**注：△△P＜0.01，与正常对照组比较；**P＜0.01，与模型对照组比较结果如表1-2所示，细胞化学方法缺氧缺糖/复氧复糖损伤后，细胞存活率明显下降及细胞内活性氧异常升高，campneosideII高、中、低剂量组可以显著调节连二亚硫酸钠导致的SH-SY5Y细胞存活率及细胞内活性氧异常升高，其中以campneosideII化合物高剂量组对细胞生长、损伤具有保护作用最好。实施例2campneosideII对大脑中动脉阻塞致缺血大鼠脑损伤的保护作用1.实验材料健康雄性SD大鼠；尼莫地平(Nimodipine),拜耳医药保健有限公司；TTC，Sigma公司。2.实验方法2.1脑缺血模型的建立健康雄性SD大鼠，术前12h禁食不禁水。大鼠麻醉，以3.5％水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉，颈部用碘伏消毒，颈部正中切口，长度4～5cm，暴露右侧颈动脉，分离右侧颈总动脉(commoncarotidartery，CCA)、颈外动脉(externalcarotidartery，ECA)、颈内动脉(internalcarotidartery，ICA)并穿线备用。用双极电凝器电烧闭合由ECA发出的分支—甲状腺动脉及通常从颈内外动脉分叉处发出的枕动脉，切断，并充分游离ECA主干，在ECA残桩根部用1号线打一紧结。用缝合线暂时阻断CCA和ICA的血流，在ECA残端剪一约0.2mm三角形小口，将准备好的栓线插入ECA，进入ICA颅内段，当遇到轻微阻力时停止，结扎ECA根部丝线。尼龙栓线插入深度为19～22mm，其头端恰好位于大脑中动脉起始处，阻断了该动脉的血流。将多余的栓线剪去，将其尾端置于正中切口皮下，缝合切口。再灌注时，将大鼠再次麻醉，剪开切口缝合线，抽出尼龙栓线，使其头端退至ECA残端内，此时MCA血流再通。再灌注3h后，采用Longa5分制评分标准进行首次神经功能缺失评分，分数小于1的动物记为模型不成立，予以剔除不进行后续的实验。2.2动物分组及给药SD大鼠，雄性，体重240-280g,由扬州大学比较医学中心提供。根据每只大鼠神经功能缺失的情况，将造模成功的大鼠随机分为5组。分别为：模型组，campneosideII低剂量组(6.5mg/kg),campneosideII中剂量组(13mg/kg)，campneosideII高剂量组(26mg/kg),尼莫地平组(21mg/kg),各组均为12只。采用灌胃给药的方式，在再灌注开始时给药一次，其余每隔12h给药一次，最后一次给药在再灌注47h，共给药5次。1.4参照Longa5分制评分标准，对其神经功能缺失症状进行评定。0分：无神经损伤症状；1分：对侧前爪不能完全伸直；2分：行走时向对侧转圈；3分：站立不稳，向对侧倾倒；4分：不能自发行走；意识丧失。根据上述的评分标准，缺血期3小时首次进行神经功能缺失评分，旨在评价缺血模型是否成功。2.3指标检测TTC染色，大鼠再灌注48h后处死，迅速断头取脑，将其放在置于冰盒上的脑槽中自额极向枕极进行冠状切片，每片2mm，共5片，立即将脑切片放入2％的TTC溶液中，避光条件下，37℃孵育15min。正常的脑组织被染成红色，而缺血的组织则成白色。将染色结果输入计算机，利用图像处理软件分别计算出5个脑片缺血侧的总面积(正反两侧)S1和梗死区域的面积S2，求出梗死区域占大脑半球总面积的百分比如下：梗死面积(％)＝S2/S1×100％。3、实验结论结果如表3所示，大脑中动脉缺血再灌损伤大鼠神经功能缺失评分可知，除假手术组外，各组动物清醒后出现不同程度的神经功能损伤，向患侧转圈、倾倒、不能站立、不能行走等，根据Longa5分制评分标准进行评分，1分以上即为模型成功，说明各组动物建立模型成功可用于后续实验。表3campneosideII对脑缺血再灌注大鼠神经行为学、脑梗死面积的影响组别剂量(mg.kg-1)神经功能学评分脑梗死面积(％)假手术---模型-2.81±1.0225.52±5.33##尼莫地平211.11±1.33**13.71±7.21**高剂量261.49±1.03**15.71±6.23**中剂量131.60±0.88*17.23±5.34**低剂量6.51.79±1.0517.84±8.62与假手术组比较，##p<0.01；与模型组比较，*p<0.05,**p<0.01.由表3可知，TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)能与正常组织中的琥珀酸脱氢酶反应成红色，而缺血组织内琥珀酸脱氢酶活性下降，不能反应，呈白色。脑梗死面积可以反应脑组织缺血的严重程度。与假手术组相比，模型组脑梗死面积显著增加；与模型组比较，campneosideII中高剂量组可以显著降低脑梗死面积。实施例3胶囊剂将350gcampneosideII和32g淀粉、6g低取代羟丙基纤维素、4.5g微粉硅胶、1.5g硬脂酸镁、及适量10％淀粉浆混合，装入胶囊，得到的胶囊制剂1000粒。每日3次，每次1粒。实施例4颗粒剂将350gcampneosideII和1000g蔗糖及500g糊精混合，按照常规方法制成1000包颗粒剂。每日3次，每次1粒。实施例5片剂将350gcampneosideII和50g淀粉、7.5g羧甲基淀粉钠、0.8g滑石粉、50g糊精、0.8g硬脂酸镁及适量10％淀粉浆适混合，按照常规方法制成片剂1000片。每日3次，每次1片。实施例6丸剂将350gcampneosideII和12g聚乙二醇-6000、80.5g聚山梨酯-80、适量液状石蜡混合，按照常规方法制成丸剂1000粒。每日3次，每次1粒。实施例7注射剂将200gcampneosideII和15g注射用大豆磷脂、25g注射用甘油，注射用水定容至1000mL，按照常规方法制成注射剂1000支。每日1次，每次1支，至少采用250mL5％葡萄糖注射液稀释后静脉滴注。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3