本发明涉及一种生物抗菌细菌纤维素敷料及其制备方法。系通过原花青素为交联剂，细菌纤维素与生物防腐剂ε一聚赖氨酸结合后制得，具有广谱抗菌活性。
背景技术：
敷料是临床上使用广泛的一种用以覆盖疮、伤口或其他损害的医用材料。传统的敷料主要包括天然纱布、合成纤维类敷料、泡沫类敷料、水凝胶类敷料等。天然高分子材料因具有良好的生物相容性、可降解性以及传统敷料所具有的优势特点，成为制备敷料的首选原料。敷料良好的吸水性，在使其具有创面清爽、干燥等优点的同时，也为细菌等微生物繁殖提供了温床。因此，具有抗菌功能的敷料受到了人们大量关注。而传统的负载银等无机抗菌剂对人体的伤害较大，天然有机抗菌剂，如乳酸链球菌、壳聚糖等表现出更大的优势，但其通常不具有广谱抗菌性。为维持这类抗菌材料的力学性能，常使用戊二醛等人工合成交联剂，但这类合成交联剂具有毒性，会影响高分子材料的性能且不利于创面的恢复。因此需要选用生物安全的交联剂来避免交联材料带来的副作用。
细菌纤维素(Bacterial Cellulose，简称BC)，是具有三维多孔网状结构的纳米级生物高分子聚合物，与植物纤维素相比，不含有半纤维素、木质素等杂质，且其纯度、聚合度高，持水性好，拉伸强度和弹性模量高，具有良好的生物适应性和可降解性，目前已广泛应用于食品、造纸、医疗等领域。其天然的多孔结构，表面丰富的羟基，使其可以充当基体和增强体来制备具有特殊功能的复合材料。使用BC作为伤口敷料能够迅速吸收伤口血液和组织液，防止伤口感染化脓，又能为慢性伤口附近的组织再生提供湿润的环境促进伤口愈合和减轻疼痛。同时纤维素不会和伤口粘连，不会造成二次伤害，剥离时也不会有残留。
ε一聚赖氨酸(ε-polylysine，简称ε-PL)是一种由微生物发酵生产的赖氨酸同聚物，由25-35个赖氨酸残基通过α-羧基和ε-氨基连接而成。ε一聚赖氨酸是一种对人体安全无毒的聚阳离子多肽，能够抑制革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性菌、真菌甚至某些病毒，具有抑菌谱广泛的特点。自从通过小鼠实验证明ε一聚赖氨酸安全性后，日本、韩国、美国等国家将其作为天然食品防腐剂并广泛应用。
原花青素(Procyanidins，简称PA)是一种分子结构非常特殊的生物类黄酮，能够溶在水和大多数有机溶剂中，含有很多酚羟基，是国际上公认的天然抗氧化剂，其氧化能力是维生素C的20倍，维生素E的50倍，并能够清除人体内自由基。它的提取过程一般是从葡萄籽或法国海岸松树皮中提取出来。在人体内具有非常强的活性，对人体无毒无害。
据检索，发现以下相关文献和专利。
专利201010218930.6，公开了“一种生物抗菌棉纤维或棉布及其制备方法”，其使用ε一聚赖氨酸作为抑菌剂，使其与经过高碘酸钠氧化处理的棉纤维或棉布进行接枝反应，或直接与未氧化处理的棉纤维或棉布进行吸附结合，从而制备出一种具有抗菌抑菌效果的棉纤维或棉布。
专利200810053871.4，公开了“有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法”，其利用具有渗氧透功能的管材为载体，利用木醋杆菌在载体表面生物合成细菌纤维素管，然后将细菌纤维素管与ε一聚赖氨酸复合制备具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法。
专利201110009673.X，公开了“用于急性创伤的细菌纤维素基抗菌干膜及制备方法和应用”，抗菌干膜组分包括：细菌纤维素干膜和抗菌剂，细菌纤维素基抗菌干膜的载药量为0.3-6.0mg/cm2；其制备包括：将细菌纤维素湿膜切成膜片，干燥后，浸渍于预先配制好的无机抗菌剂溶液中，经二次干燥制得。
专利201510128924.4，公开了“一种原花青素交联明胶抗菌敷料及其制备方法”，其包括以下步骤：(1)配制一定浓度的明胶溶液，浇铸到模具中；(2)将步骤(1)所得的明胶冷冻干燥48小时以上，获得结构均匀的明胶海绵支架；(3)分别配制一定浓度的原花青素溶液和抗生素溶液；(4)将步骤(2)得到的明胶海绵支架浸泡到(3)得到的原花青素溶液中进行交联，同时加入抗生素溶液，使抗生素小分子进入明胶内部；(5)将步骤(4)得到的负载抗生素的交联明胶水凝胶冷冻干燥后，即得到一种新的抗菌敷料。其制备的材料具有较好的理化性能和生物相容性，并且成型可控，可用于医疗领域中创面的修复和替代，其制备工艺简单，设备简易，原料价廉易得。
Nguyen等人发表的“Potential of a nisin-containing bacterial cellulose film to inhibit Listeria monocytogenes on processed meats”一文中，制备了可以抵抗革兰氏阳性斯特菌的nisin/BC复合材料，将其应用于香肠的真空包装表面，最适浓度和接触时间分别为2500IU/ml和6h，在冷冻保存14d后与对照组相比，斯特菌显著减少到2log CFU/g。
Wei等人发表的“Preparation and evaluation of a kind of bacterial cellulose dry films with antibacterial properties”一文中，将冻干的BC膜浸入在苯扎氯铵(benzalkonium chloride)溶液中，这属于阳离子表面活性剂抗菌剂，接下来冷冻干燥。制备的BC抗菌膜在0.102％的苯扎氯铵溶液中的BC干膜的载药能力大约为0.116mg/cm；其具有高的吸水能力，在去离子水中膨胀倍数为26.2，在盐水中为37.3；获得了一个稳定而持久的至少24小时的抗菌活性，特别是抵抗金黄色葡萄球菌和枯草杆菌等革兰氏阳性菌上。
贾原媛发表的“细菌纤维素生物医学材料的性能改进”一文中，BC湿膜被ε-聚赖氨酸溶液处理后在一定浓度的丙三醇溶液中浸泡并干燥，经过对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行抑菌实验后发现，BC干膜经质量分数为3％的ε-PL溶液处理后抑菌效果最佳，但随着质量分数的增加BC膜颜色变深，其透光性下降。
Zhu等人发表的”Characterization of Bacteriostatic Sausage Casing：A Composite of Bacterial Cellulose Embedded with epsilon-Polylysine“一文中，将BC管浸泡在生物防腐剂ε-PL溶液中使ε-PL嵌入到细菌纤维素膜上制得抑菌肠衣。通过表征结果表明，这种ε-PL/BC复合膜不仅能够抑制革兰氏阳性菌，而且对革兰氏阴性菌同样有抑制作用，可以延长产品的货架期。这种绿色、环保、环境友好型的复合膜必将在包装材料方面有好的应用。
然而，BC上未交联的EPL涂层是水溶性的，这导致在水溶液中快速地溶解。因此，需要通过交联过程固定EPL分子到BC上。而文献中大部分所使用的交联剂对人体有害。因此，本发明以细菌纤维素为基质，使用生物防腐剂ε一聚赖氨酸作为抑菌剂，天然抗氧化剂原花青素为交联剂，通过溶液浸泡以及交联技术，从而制备出一种具有广谱抗菌活性、安全性高的抗菌复合敷料。因此本专利获得的具有抗菌功效的生物安全性敷料具有广阔的市场前景。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种生物抗菌细菌纤维素敷料及其制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种生物抗菌细菌纤维素敷料及其制备方法，包括以下步骤：
(1)将BC膜切成圆形状，并在去离子水中清洗几次；
(2)分别配置ε-PL和PA水溶液；
(3)将步骤(1)中的BC膜，在37℃下，浸泡在100ml的ε-PL水溶液中，140r/min震荡24h；
(4)配置PBS磷酸盐缓冲液；
(5)将步骤(3)中的复合膜，在37℃下，浸泡在100mL的(4)为缓冲液的PA水溶液中，140r/min震荡2h；
(6)将复合样本从溶液中取出并在去离子水中冲洗至中性，制得一种新的抗菌敷料。
所述的BC膜来源于液体培养基发酵制得，液体发酵基主要成分为(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白陈5，Na2HPO45，柠檬酸铵1，盐酸调节初始pH至6.0；用打孔器将BC膜切成直径为15mm-20mm的圆状。
所述的ε-PL水溶液的浓度为0.1-1wt％。
所述的PA水溶液的浓度为0.5-0.8wt％
所述的PBS磷酸盐缓冲液的制备方法为：氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，调节pH至7.4，定容到1L，然后高压蒸汽灭菌，室温保存。
有益效果：
由于EPL是聚阳离子物质，在水中会解离出-NH3+，而BC纳米纤维表面含有大量羟基，是聚阴离子物质。BC浸入到EPL溶液后，由于在-NH3+以及-OH之间的离子极性作用，BC纳米纤维吸收EPL分子。未交联的EPL涂层是水溶性的，这导致在水溶液中快速地溶解。因此，需要通过交联过程固定EPL分子到BC上。PA分子交联EPL分子主要是通过在EPL上的C＝O基团以及PA上的-OH基团间的氢键作用，这可使BC纳米纤维在交联之后，形成了稳定的EPL涂层，而且保留下来了-NH3基团。
本发明所使用的原料均为生物高分子材料，不含对人体有害的化学药品，属于纯绿色化生产过程。制得的细菌纤维素抗菌湿膜具有轻便柔软、生物相容性好、吸湿性高、透气性好，抗菌性持久等优点，且制备方法简便易行，成本低廉，应用于抗菌敷料中具有良好的抗菌效果，通过控制发酵参数可制备出裁剪成任意大小、形状及厚度的产品，不粘连也不刺激皮肤，丢弃后在环境中能迅速降解，可作为一种绿色环保的功能性抗菌敷料。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地说明，但本发明要求保护的范围并不局限于提到的实施例表示的范围。
实施例1
一种生物抗菌细菌纤维素敷料及其制备方法，包括以下步骤：
(1)将液体培养基发酵制得的BC膜，用打孔器切成直径为15mm的的圆形状，并在去离子水中清洗几次；
(2)配置0.1wt％的ε-PL水溶液和0.5wt％的PA水溶液；
(3)将步骤(1)中的BC膜，在37℃下，浸泡在100ml的0.1wt％的ε-PL水溶液中，140r/min震荡24h；
(4)配置PBS磷酸盐缓冲液，其配置方法为：氯化钠8g，氯化钾.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，pH调至7.4。
(5)将步骤(3)中的复合膜，在37℃下，浸泡在100mL的0.5wt％的(4)为缓冲液的PA水溶液中，140r/min震荡2h；
(6)将复合样本从溶液中取出并在去离子水中冲洗至中性，制得一种新的抗菌敷料。
实施例2
一种生物抗菌细菌纤维素敷料及其制备方法，包括以下步骤：
(1)将液体培养基发酵制得的BC膜，用打孔器切成直径为15mm的的圆形状，并在去离子水中清洗几次；
(2)配置0.25wt％的ε-PL水溶液和0.5wt％的PA水溶液；
(3)将步骤(1)中的BC膜，在37℃下，浸泡在100ml的0.25wt％的ε-PL水溶液中，140r/min震荡24h；
(4)配置PBS磷酸盐缓冲液，其配置方法为：氯化钠8g，氯化钾.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，pH调至7.4。
(5)将步骤(3)中的复合膜，在37℃下，浸泡在100mL的0.5wt％的(4)为缓冲液的PA水溶液中，140r/min震荡2h；
(6)将复合样本从溶液中取出并在去离子水中冲洗至中性，制得一种新的抗菌敷料。
实施例3
一种生物抗菌细菌纤维素敷料及其制备方法，包括以下步骤：
(1)将液体培养基发酵制得的BC膜，用打孔器切成直径为15mm的的圆形状，并在去离子水中清洗几次；
(2)配置0.5％的ε-PL水溶液和0.5％的PA水溶液；
(3)将步骤(1)中的BC膜，在37℃下，浸泡在100ml的0.5％的ε-PL水溶液中，140r/min震荡24h；
(4)配置PBS磷酸盐缓冲液，其配置方法为：氯化钠8g，氯化钾.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，pH调至7.4。
(5)将步骤(3)中的复合膜，在37℃下，浸泡在100mL的0.5wt％的(4)为缓冲液的PA水溶液中，140r/min震荡2h；
(6)将复合样本从溶液中取出并在去离子水中冲洗至中性，制得一种新的抗菌敷料。
实施例4
一种生物抗菌细菌纤维素敷料及其制备方法，包括以下步骤：
(1)将液体培养基发酵制得的BC膜，用打孔器切成直径为15mm的的圆形状，并在去离子水中清洗几次；
(2)配置0.75％的ε-PL水溶液和0.8％的PA水溶液；
(3)将步骤(1)中的BC膜，在37℃下，浸泡在100ml的0.75％的ε-PL水溶液中，140r/min震荡24h；
(4)配置PBS磷酸盐缓冲液，其配置方法为：氯化钠8g，氯化钾.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，pH调至7.4。
(5)将步骤(3)中的复合膜，在37℃下，浸泡在100mL的0.8wt％的(4)为缓冲液的PA水溶液中，140r/min震荡2h；
(6)将复合样本从溶液中取出并在去离子水中冲洗至中性，制得一种新的抗菌敷料。
实施例5
一种生物抗菌细菌纤维素敷料及其制备方法，包括以下步骤：
(1)将液体培养基发酵制得的BC膜，用打孔器切成直径为15mm的的圆形状，并在去离子水中清洗几次；
(2)配置1％的ε-PL水溶液和0.8％的PA水溶液；
(3)将步骤(1)中的BC膜，在37℃下，浸泡在100ml的1％的ε-PL水溶液中，140r/min震荡24h；
(4)配置PBS磷酸盐缓冲液，其配置方法为：氯化钠8g，氯化钾.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，pH调至7.4。
(5)将步骤(3)中的复合膜，在37℃下，浸泡在100mL的0.8wt％的(4)为缓冲液的PA水溶液中，140r/min震荡2h；
(6)将复合样本从溶液中取出并在去离子水中冲洗至中性，制得一种新的抗菌敷料。
将实施例1-5制得的抗菌细菌纤维素敷料，进行抗菌效果测试，具体情况请见表1。
表1
本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。