人参皂苷Rb1的医药用途的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体涉及人参皂苷Rb1的医药用途。

背景技术：

小RNA病毒代表了小型含核糖核酸的病毒的一个非常巨大的病毒家族，是造成多种严重的人类和动物疾病的原因。小核糖核酸病毒包括四种主要类群：肠道病毒、鼻病毒、心病毒和口疮病毒。

肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科肠道病毒属的成员，归属于人类肠道病毒A，引起手足口病(HFMD)和中枢神经系统疾病，具有较高的病死率和致残率。目前还没有有效的药物和疫苗用来预防、检测和治疗EV71的感染。

柯萨奇病毒是小RNA病毒科肠道病毒属成员，其感染可引起多种疾病，已报道的CV共有29个血清型，根据其对乳鼠的致病特点及对细胞敏感性的不同，可将其分为A和B两组，即CVA(CVA1-22，24)和CVB(CVB1-6)。其中CVB3是非常重要的一种亚型。CVB3与很多疾病相关，包括心肌炎、脑膜炎、胰腺炎等，其所致的病毒性心肌炎严重危害人类健康，部分患者可发展为扩张型心肌病，也是新生儿猝死的重要原因，目前尚无有效的预防和治疗方法。

人鼻病毒(HRV)是小RNA病毒科鼻病毒属，可以根据血清型进行分类，已知其存在的血清型有100多种。HRV是引起人类病毒性呼吸道感染的首要原因，不同年龄段的人群均可感染HRV。尽管HRV引起的呼吸道疾病通常轻微并且具有自限性，然而工作和学习停顿所造成的社会经济影响以及不恰当使用抗生素的程度是显著的。而且越来越多的证据表明HRV感染和更严重的医学并发症之间的联系。例如HRV引起的感冒是急性中耳炎和鼻窦炎重要的易感因素，并且是引起成人和小孩哮喘恶化的主要因素。迄今为止，预防或治疗HRV感染引起的疾病还没有经批准的有效抗病毒疗法。

技术实现要素：

本发明目的是提供人参皂苷Rb1的医药用途，以解决现有技术的不足。

本发明第一方面提供了人参皂苷Rb1在制备用于治疗小RNA病毒科病毒感染药物中的应用。

本发明第二方面提供了人参皂苷Rb1在制备用于治疗EV71药物中的应用。

本发明第三方面提供了人参皂苷Rb1在制备用于治疗CVB3药物中的应用。

本发明第四方面提供了人参皂苷Rb1在制备用于治疗HRV3药物中的应用。

本发明的人参皂苷Rb1可通过商业途径购买，其纯度符合药用标准，以纯度不低于98％为佳。

本发明人参皂苷Rb1在制备治疗上述病毒药物时，可以单独使用或以药物组合物的形式使用，药物组合物包括作为活性成分的人参皂苷Rb1及一种或多种其它药物，或者药物上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的填充剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂、吸收促进剂、填充剂、表面活性剂和稳定剂等等，必要时还可加入香味剂、色素和甜味剂等等。

本发明人参皂苷Rb1以及其药物组合物可按本领域常规方法制备并可以通过肠道或非肠道给药，制成胶囊、丸剂、粉剂、片剂、口服液和注射液等多种形式。

本发明的有益效果：人参皂苷Rb1应用于制备治疗小RNA病毒科病毒感染药物，特别是制备治疗EV71、CVB3或HRV33药物，疗效好，安全性高，适于实际推广使用。

附图说明

图1为细胞感染造模结果(A：空白对照；B：感染15h；C：感染18h；D：感染24h)。

图2为实施例1不同处理对病毒的致细胞病变效应的影响(A、B、C分别为D、E、F的对照组，D、E、F的Rb1处理浓度分别为1.25mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml，G为未感染病毒的阴性对照组，H为感染病毒的阳性对照组)。

图3为实施例1不同处理RD细胞中VP1的表达量。

图4为实施例2不同处理乳鼠存活率结果。

图5为实施例2不同处理乳鼠平均体重。

图6为实施例2不同处理乳鼠肌肉组织病理切片。

图7为实施例3各处理组中病毒RNA的相对含量(A：Rb1对CVB3的抑制作用，B：Rb1对HRV3的抑制作用)。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。

以下实施例涉及的EV71、CVB3与HRV3由武汉大学病毒学国家重点实验室提供。

实施例1

细胞水平上Rb1的抗EV71作用

细胞感染模型：利用EV71能感染和复制的RD细胞(人横纹肌瘤细胞)。细胞种板密度为80％，种板6小时后开始感染病毒。病毒感染滴度以感染后24小时有30％细胞坏死为标准。造模结果如图1所示，表明EV71能在RD细胞中感染与复制，并引起RD细胞凋亡与坏死，可以作为筛选抗EV71的药物模型。

在细胞完全贴壁后，细胞密度约为80％，吸去10％胎牛血清DMEM培养基，加已孵温并含EV71的10％胎牛血清DMEM培养基一毫升，感染2小时后，各药物处理组加不同浓度的人参皂苷Rb1培养基一毫升，Rb1终浓度分别达到1.25mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml，各相应对照组只加相同浓度的Rb1，不加病毒。在感染后24h小时取样，用倒置荧光显微镜观察病毒的致细胞病变效应(Cytopathic Effect，CPE)现象，如图2所示，结果表明浓度2.5mg/ml以上Rb1处理，CPE细胞比例很低。

在细胞完全贴壁后，细胞密度约为80％，吸去10％胎牛血清DMEM培养基，加已孵温并含EV71的10％胎牛血清DMEM培养基一毫升，感染2小时后，各药物处理组加不同浓度的人参皂苷Rb1培养基一毫升，Rb1终浓度分别达到0.625mg/ml、1.25mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml，24h后收集细胞，定量PCR检测不同浓度Rb1处理的RD细胞中EV71的结构蛋白VP1的表达量，VP1的表达反映了病毒复制的量，是病毒复制的标志，表达量越低，表示病毒复制量越低。如图3所示，RD表示感染的细胞系，药物处理组未标识，从左到右分别为未做任何处理的RD细胞(阴性对照组)、感染EV71但未用药物处理的RD(阳性对照组)，其它均为不同浓度药物处理的感染EV71的RD细胞，结果表明：浓度2.5mg/ml以上的Rb1在细胞水平有很好的抑制EV71的作用。

实施例2

动物水平上Rb1的抗EV71作用

实验方案：动物实验在上海公共卫生临床中心完成。

1)小鼠品系：用P8(高致病性EV71毒株，上海公共卫生临床中心提供)感染3日龄ICR小鼠。

2)感染方法是腹腔注射

3)实验分组：共分成6组，每组十只乳鼠，同时，每组设三个平行组，共180只乳鼠：阴性组(Normal，非感染组，注射生理盐水，30只乳鼠)，阳性组(Model，感染但不用任何药物处理，仅注射生理盐水，30只乳鼠)，对照组(Positive Control，感染并用利巴韦林(Ribavirin)处理，50mg/Kg，30只乳鼠)，实验组分高中低三组(5(L)、10(M)、20(H)mg/Kg，感染24小时后给药，90只乳鼠)。每次给药总体积为20ul。

4)给药方式：腹腔注射给药，腹腔注射感染前禁食5小时。开始给药后，每隔24小时给一次。

5)检测指标包括：存活率，平均体重，病理分析等。

6)实验结果：

6.1小鼠存活率观察：如图4所示，对照组存活率为0，低剂量组与阳性组存活率为50％，中剂量组存活率为90％，阴性组、高剂量组存活率为100％。

6.2存活小鼠的平均体重：如图5所示，结果表明，高剂量组小鼠的平均体重均较其它组高。

6.3感染三天后肌肉组织病理切片分析：根据6.1和6.2的结果，药物处理组选用15mg/Kg、20mg/Kg的Rb1，如图6所示，A：从感染第三天(给药两天)开始，EV71对乳鼠的肌肉组织就有明显的破坏作用，利巴伟林对EV71没有任何保护作用，Rb1有明显的保护作用，并随着浓度的增加而增加。B：感染第五天(给药第四天)，模型组与利巴伟林组出现明显的肌肉坏死与横纹肌断裂，而Rb1高剂量组(20mg/Kg)病变程度较少。

实施例3

细胞水平上Rb1的抗CVB3、HRV3作用

Hela细胞系作为CVB3与HRV3感染细胞系。具体方法为将Hela细胞种在六孔板中，种板密度为60％，6小时后，吸去10％胎牛血清1640培养基，将含有CVB3病毒与HRV3病毒的10％胎牛血清1640培养基一毫升分别加入到六孔板中，在37℃二氧化碳培养箱中培养2小时后，再吸去感染培养基，加入两毫升新鲜的含不同浓度的Rb1的10％胎牛血清1640培养基，使药物处理组Rb1的终浓度分别为0.625mg/ml、1.25mg/ml、2.5mg/ml与5mg/ml。再在37℃二氧化碳培养箱中培养48小时，轻轻吹起细胞，在离心管中分别3000转/分钟离心10分钟，去上清，收集细胞，用TRIZOL试剂并参照说明书方法提取病毒RNA，反转，以未加Rb1处理的阳性对照组为参照，定量PCR检测各处理组中病毒RNA的相对含量。结果如图7所示，结果表明随着Rb1处理浓度的升高，CVB3与HRV3的相对滴度越低，表明Rb1对CVB3与HRV3有明显的抑制作用。