含人间充质干细胞因子的精华液的制备方法与流程

本发明涉及一种精华液的制备方法，具体涉及含人间充质干细胞因子的精华液的制备方法。

背景技术：

间充质干细胞是指具有三胚层分化潜能的一类干细胞亚群，在特定环境下，理论上可以诱导分化为人体任何一种组织细胞，主要来源于人体中广泛存在的间质组织，特别是骨髓、脂肪、脐带和胎盘等，由于其具有强大的增殖能力，较强的分化能力，低免疫原性和免疫调节功能，其在临床上的应用价值越来越受人们关注。随着对间充质干细胞研究的不断深入，其分泌因子已成为研究的热点。间充质干细胞可以分泌多种细胞因子，这些细胞因子可有效地调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞。

同时干细胞内部含有大量的生物活性物质，已报道的干细胞裂解液中包含血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、IL-6 与IL-7、巨核细胞集落刺激因、肿瘤坏死因子、干扰素等因子、脱氧核糖核酸及核糖核酸、活性多肽、以及免疫蛋白IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等，这些物质可以促进机体干细胞生长、增殖，起到活化干细胞作用。

细胞因子和活性物质添加到美容化妆品，不仅具有保湿美白功效，还能够修复受损皮肤，消除皮肤皱纹，收缩毛孔，改善面色。目前也有一些对干细胞培养上清进行纯化及干细胞裂解的报道，但都效果不佳，例如上清液中的糖分残留，培养上清中含有胎牛血清，浓缩过程细胞因子活性下降等问题，导致修复效果不佳，使用安全性低等问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，现提供一种通过提取健康人脐带、胎盘羊膜或脂肪组织的干细胞，经过体外扩增培养，收集上清和细胞，利用低温浓缩技术获得高纯度、高活性的干细胞活性因子浓缩液，低温真空抽干成冻干粉；溶媒中含有干细胞裂解液和多种皮肤滋养和保湿成分，能够很好的溶解细胞因子，并保持细胞因子活

性的含人间充质干细胞因子的精华液的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：含人间充质干细胞因子的精华液的制备方法，其创新点在于：经过人间充质干细胞因子冻干粉的制备、溶媒的制备和混合步骤完成含人间充质干细胞因子的精华液的制备方法，所述步骤具体如下：

a.人间充质干细胞因子冻干粉的制备：经过人间充质干细胞的分离与培养、细胞传代、间充质干细胞的鉴定、上清液的收集、上清液的浓缩和冻干粉的制备步骤完成人间充质干细胞因子冻干粉的制备；所述具体步骤如下：

（1）人间充质干细胞的分离与培养：将健康的人脐带、胎盘、脂肪组织放入百级超净台内，洗涤消毒后，加入浓度为0.1-0.5%混合胶原酶，在37℃，120-180rpm震荡消化6-50 min，补充等量生理盐水，150目筛网过筛，收集细胞初悬液，将细胞初悬液经三次梯度离心后，取离心得到的沉淀加入专用培养基重悬，将细胞悬液接种于培养瓶内，放入37℃，5%的CO₂培养箱内培养，待细胞长至85%汇合度，进行细胞传代；

（2）细胞传代：倒掉无菌培养瓶内的培养基，用浓度为0.9%的生理盐水洗涤细胞表面两次，加入5 ml浓度0.075%-0.125%的胰蛋白酶消化，显微镜下观察到细胞开始变圆，加入等量培养液终止消化，将脱落的细胞和培养液转移到离心管内，离心，将离心所得的细胞沉淀用培养基重悬，接种进行P1代培养，待细胞长到85%以上汇合度，将P1代细胞消化后以500-800万/ml的密度加入冷冻保护液低温保存备用；

（3）间充质干细胞的鉴定：随机抽取P1-P10代细胞进行流式鉴定，吸取100 µl细胞悬液，加5 µl抗体，在常温下孵育20 min，然后加400 µl的磷酸盐缓冲液，振荡混匀，转移到1.5 ml的EP管内，1200 rpm，离心6 min，弃上清，然后再加入400 µl的磷酸盐缓冲液吹打后转移到上样管内上机；

（4）上清液的收集：从液氮中复苏一支间充质干细胞，将细胞接种至T175培养瓶中，加入40 ml培养液，放入37℃，5%的CO₂培养箱培养，每三天将细胞1：3传代培养，在细胞传至P4时将细胞接种至四层细胞工厂，连续培养至P10代，收集全部上清，做好标识，同时将细胞消化下来，用培养液重悬后置于-80度备用；

（5）上清液的浓缩：将收集的干细胞培养上清经0.22 µm的滤膜过滤，然后通过分子量为50KD的Vivaflow 50回旋流/切向流超滤器进行干细胞上清液的浓缩，接着将浓缩液通过分子量为3KD的Vivaflow 50回旋流/切向流超滤器，收集截留液，即为细胞因子浓缩液；

（6）冻干粉的制备：将细胞因子浓缩液中加入冻干保护剂，恒温震荡混匀，然后进行分装，每瓶2-3 ml，放入-80度超低温冰箱冷冻处理16-24 h，冷冻冻干，选用上海亿佰的YB-FD-1冷冻干燥机，真空度1-10Pa，冷阱温度-60--70度，抽真空时间为18-36 h；

b.溶媒的制备：将人白蛋白，玻尿酸，甘油，细胞裂解液，beta-葡聚糖，胶原蛋白，M98和超纯水，在百级超净台内按比例配制，放入恒温振荡器，震荡5-10 min，振荡均匀后进行分瓶包装，每瓶15 ml；所述人白蛋白占总体积的1-5%，所述玻尿酸占总体积的0.2-0.6%，所述甘油占总体积的2-6%，所述细胞裂解液占总体积的0.1-0.5%，所述beta-葡聚糖占总体积的0.01-0.08%，所述胶原蛋白占总体积的0.01-0.05%，所述M98占总体积的0.05-0.1%，超纯水补至终体系；

c.混合：将1瓶冻干粉溶解到1瓶溶媒中，均匀混合，完成含人间充质干细胞因子的精华液的制备。

进一步的，所述步骤（1）中的混合胶原酶为胶原酶P和胶原酶I的混合物，所述胶原酶P与胶原酶I的混合质量比为3：2。

进一步的，所述步骤（6）中冻干保护剂成分为甘露醇、右旋糖酐、人白蛋白、维生素C和丙二醇，所述甘露醇占总体积的15-25%，所述右旋糖酐占总体积的3-5%，所述人白蛋白占总体积的0.5-2%，所述维生素C占总体积的0.2-1%，所述丙二醇占总体积的8-20%。

进一步的，所述甘露醇占总体积的20%，所述右旋糖酐占总体积的3.5%，所述人白蛋白占总体积的1%，所述维生素C占总体积的0.6%，所述丙二醇占总体积的12%。

进一步的，所述细胞裂解液的制备方法为：将体外培养的细胞传代至P5-P10代消化后离心收集，计数后，将细胞与培养上清按4-8×10⁷/ml的密度制成细胞混悬液，将细胞混悬液放入-80度超低温冰箱，10度水浴反复冻融3-5次，将裂解液通过0.45 µm无菌滤膜，收集滤液，放入-80度超低温冰箱待用。

进一步的，所述制备完成的冻干粉和溶媒均保存在4-8度环境下。

本发明的有益效果如下：

（1）本发明在溶媒的制备过程中选用了细胞裂解液，干细胞裂解液中包含血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、白介素-6、白介素-7、巨核细胞集落刺激因、肿瘤坏死因子、干扰素因子及脱氧核糖核酸、核糖核酸、活性多肽、以及免疫蛋白IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，这些物质可以促进机体干细胞生长、增殖，起到活化干细胞作用，用于精华液的制备，使用精华液时可以从根本上调节人体生理机能。

（2）本发明采用Vivaflow 50回旋流/切向流超滤器制备细胞因子浓缩液，在恒流泵的的作用下，将不同规格的超滤器串联使用，整个管路完全处于无菌封闭状态，并且不仅能够提高因子的回收率，截掉糖类，大分子蛋白等杂质，而且减少人为的干预，自动化的程度高，适用于规模化浓缩。

（3）本发明通过将冻干粉和溶媒保存在4-8度环境下，可以有效保持干细胞生长因子和活性物质的活性。

附图说明

图1为本发明的实施例1中第3天显微镜下观察对照组细胞的生长状态；

图2为本发明的实施例1中第3天显微镜下观察配方1细胞的生长状态；

图3为本发明的实施例1中第3天显微镜下观察配方2细胞的生长状态；

图4为本发明的实施例1中细胞培养6天的生长曲线图；

图5 羊膜间充质干细胞流式图；

图6 脂肪间充质干细胞流式图；

图7 脐带间充质干细胞流式图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

含人间充质干细胞因子的精华液的制备方法，经过人间充质干细胞因子冻干粉的制备、溶媒的制备和混合步骤完成含人间充质干细胞因子的精华液的制备方法，步骤具体如下：

a.人间充质干细胞因子冻干粉的制备：经过人间充质干细胞的分离与培养、细胞传代、间充质干细胞的鉴定、上清液的收集、上清液的浓缩和冻干粉的制备步骤完成人间充质干细胞因子冻干粉的制备；具体步骤如下：

（1）人间充质干细胞的分离与培养：将健康的人脐带、胎盘、脂肪组织放入百级超净台内，洗涤消毒后，加入浓度为0.1-0.5%混合胶原酶，在37℃，120-180rpm震荡消化6-50 min，补充等量生理盐水，150目筛网过筛，收集细胞初悬液，将细胞初悬液经三次梯度离心后，取离心得到的沉淀加入专用培养基重悬，将细胞悬液接种于培养瓶内，放入37℃，5%的CO₂培养箱内培养，待细胞长至85%汇合度，进行细胞传代；混合胶原酶为胶原酶P和胶原酶I的混合物，胶原酶P与胶原酶I的混合质量比3：2。

（2）细胞传代：倒掉无菌培养瓶内的培养基，用浓度为0.9%的生理盐水洗涤细胞表面两次，加入5 ml浓度0.075%-0.125%的胰蛋白酶消化，显微镜下观察到细胞开始变圆，加入等量培养液终止消化，，将脱落的细胞和培养液转移到离心管内，离心，将离心所得的细胞沉淀用培养基重悬，接种进行P1代培养，待细胞长到85%以上汇合度，将P1代细胞消化后以500-800万/ml的密度加入冷冻保护液低温保存备用；

（3）间充质干细胞的鉴定：随机抽取P1-P10代细胞进行流式鉴定，吸取100 µl细胞悬液，加5 µl抗体，在常温下孵育20 min，然后加400 µl的磷酸盐缓冲液，振荡混匀，转移到1.5 ml的EP管内，1200 rpm，离心6 min，弃上清，然后再加入400 µl的磷酸盐缓冲液吹打后转移到上样管内上机；

（4）上清液的收集：从液氮中复苏一支间充质干细胞，将细胞接种至T175培养瓶中，加入40 ml培养液，放入37℃，5%的CO₂培养箱培养，每三天将细胞1：3传代培养，在细胞传至P4时将细胞接种至四层细胞工厂，连续培养至P10代，收集全部上清，做好标识，同时将细胞消化下来，用培养液重悬后置于-80度备用；

（5）上清液的浓缩：将收集的干细胞培养上清经0.22 µm的滤膜过滤，然后通过分子量为50KD的Vivaflow 50回旋流/切向流超滤器进行干细胞上清液的浓缩，接着将浓缩液通过分子量为3KD的Vivaflow 50回旋流/切向流超滤器，收集截留液，即为细胞因子浓缩液；

（6）冻干粉的制备：将细胞因子浓缩液中加入冻干保护剂，恒温震荡混匀，然后进行分装，每瓶2-3 ml，放入-80度超低温冰箱冷冻处理16-24 h，冷冻冻干，选用上海亿佰的YB-FD-1冷冻干燥机，真空度1-10Pa，冷阱温度-60--70度，抽真空时间为18-36 h；冻干保护剂成分为甘露醇、右旋糖酐、人白蛋白、维生素C和丙二醇，甘露醇占总体积的15-25%，右旋糖酐占总体积的3-5%，人白蛋白占总体积的0.5-2%，维生素C占总体积的0.2-1%，丙二醇占总体积的8-20%。

b.溶媒的制备：将人白蛋白，玻尿酸，甘油，细胞裂解液，beta-葡聚糖，胶原蛋白，M98和超纯水，在百级超净台内按比例配制，放入恒温振荡器，震荡5-10 min，振荡均匀后进行分瓶包装，每瓶15m；人白蛋白占总体积的1-5%，玻尿酸占总体积的0.2-0.6%，甘油占总体积的2-6%，细胞裂解液占总体积的0.1-0.5%，beta-葡聚糖占总体积的0.01-0.08%，胶原蛋白占总体积的0.01-0.05%，M98占总体积的0.05-0.1%，超纯水补至终体系；

c.混合：将1瓶冻干粉溶解到1瓶溶媒中，均匀混合，完成含人间充质干细胞因子的精华液的制备；制备完成的冻干粉和溶媒均保存在4-8度环境下。

细胞裂解液的制备方法为：将体外培养的细胞传代至P5-P10代消化后离心收集，计数后，将细胞与培养上清按4-8×10⁷/ml的密度制成细胞混悬液，将细胞混悬液放入-80度超低温冰箱，10度水浴反复冻融3-5次，将裂解液通过0.45 µm无菌滤膜，收集滤液，放入-80度超低温冰箱待用。

实施例1

一、干细胞上清液浓缩前和浓缩后，细胞因子浓度的变化

使用ELASIA试剂盒对表皮生长因子、血管内皮生长因子、血小板源生长因子为代表的生长因子进行检测，试验中分别对脂肪，胎盘羊膜，脐带间充质干细胞，不同来源培养上清液浓缩前和浓缩后进行含量和回收率比较，如表1所示：

表1

从表1中可以看出，本发明中的联合闭路超滤膜过滤法得到的细胞上清液浓缩了40倍左右，且细胞因子的回收率较高基本在90%以上，血小板源生长因子是一种重要的促有丝分裂因子，具有刺激特定细胞群分裂增殖的能力，再生血管，促进胶原蛋白合成，延缓衰老。血管内皮生长因子能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性，保持皮肤红润光泽，淡斑美白，延缓衰老。表皮生长因子对受损皮肤、敏感皮肤、创伤皮肤以及改建性皮肤具有良好的修复、护理作用；美白，祛斑，滋润皮肤，增强皮肤弹性，减少皮肤皱纹和防止皮肤衰老，缩短创伤愈合时间以及减少疤痕形成，是一种多功能的生长因子，在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用。化妆品中添加此类因子嫩肤、除皱，美白、修复、淡斑等护肤功效。

将不同规格的超滤器串联使用，减少了手动浓缩过程中人为的干预，自动化的程度高，效率高，适用于大规模浓缩。

二、冻存保护剂的成分和抽真空时间对冻干粉含水量的影响

取胎盘羊膜上清浓缩细胞因子，加入下列不同配比的冻存保护剂，分瓶后，-80度冷冻16-24h，真空冻干。

配方1：细胞因子浓缩液加入甘露醇15%，右旋糖酐3%，人白蛋白0.5%，维生素C0.2%，丙二醇8%；

配方2：细胞因子浓缩液加入甘露醇20%，右旋糖酐3.5%，人白蛋白1%，维生素C0.6%，丙二醇12%；

配方3：细胞因子浓缩液加入甘露醇25%，右旋糖酐5%，人白蛋白2%，维生素C 1%，丙二醇20%；

具体对比如表2所示：

表2

从表2中可以看出，本发明的配方2冻干粉含水量低，冻干效果评价为优秀，冻干粉表面平整，无气泡和塌陷。

三、干细胞浓缩上清细胞因子活性验证

将干细胞上清浓缩液或干细胞裂解液以一定的浓度加入到培养基中，培养胎盘羊膜间充质干细胞，观察细胞的生长形态和增殖情况。配制方法如下

对照组：DMEM/F12+10%血清替代物

配方1：1000 ml培养基成分：DMEM/F12 15.6g、10%血清替代物、30%的浓缩上清，超纯水补至1000 ml，0.22um过滤，4度备用

配方2：DMEM/F12+10%血清替代物+9 ng/mlEGF+15 ng /ml VEGF+7 ng /ml PDGF

第3天显微镜下观察细胞的生长状态如图1、图2和图3所示，图1为对照组，图2为配方1，图3为配方2，与对照组相比，添加干细胞上清浓缩液的细胞形态呈典型的梭形或纺锤体型，细胞核明显，与外源添加因子组形态无明显差异。

将细胞连续培养6天，通过胎盼蓝染色计数细胞活力和数目，并绘制生长曲线如图4，曲线1为对照组，曲线2为配方1，曲线3为配方2，从图中可以看出，添加干细胞上清浓缩液的细胞增殖速度高，明显高于对照组，而与外源添加干细胞生长因子组没有显著差别。

实施例2

羊膜源间充质干细胞上清液的收集、浓缩和冻干

一、组织的获取：

胎盘必须是符合伦理道德规范下产妇自愿捐献的，产妇HBV抗原、抗HCV抗体，抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、HTLV、EB病毒，HCMV等检测项目均为阴性，无既往病史和家族史；

二、间充质干细胞的分离、培养：将胎盘从保存液中取出，平放在无菌托盘上，羊膜面向上，用75%的酒精棉顺时针擦拭，重复2遍，从胎盘上以脐带为中心剥离消毒好的羊膜组织，将羊膜组织放入90cm的无菌培养皿内，用含500 IU/ml头孢氨苄，800U/ml庆大霉素，3ug/ml两性霉素的生理盐水洗涤2次，再用生理盐水洗涤2次，将羊膜放入50 ml离心管内，约3 g/管，剪成1 mm³ 左右小块，加入0.1-0.5%混合胶原酶37℃，120-180 rpm震荡消化6-50 min，补充等量生理盐水，150目筛网过筛，收集细胞初悬液，将细胞初悬液经三次梯度离心后，取离心得到的沉淀加入专用培养基重悬，将细胞悬液接种于培养瓶内，放入37℃，5%的CO2培养箱内培养，待细胞长至85%左右汇合度，进行细胞传代。P1代培养2天细胞即可达到85%以上汇合度，将P1代细胞消化后以500-800万/ml的密度加入冷冻保护液低温保存备用。

三、上清液的收集：从液氮中复苏一支间充质干细胞，将细胞接种至T175培养瓶中，加入40 ml培养液，放入37℃，5%CO2培养箱培养，每三天将细胞1：3传代培养，在细胞传至P4时将细胞接种至四层细胞工厂，连续培养至P10代，收集全部上清，做好标识。同时取P10代细胞进行表型检测，检测结果如下表3和图5所示：

表3

由上表3和图5可以看出，P10代的细胞高表达CD73，CD90，CD105，低表达CD34，HLA-DR，符合间充质干细胞的表面标志特征。

四、上清浓缩

将收集的干细胞培养上清经0.22 um的滤膜过滤，然后通过分子量为50KD的Vivaflow 50回旋流/切向流超滤器进行干细胞上清液的浓缩，接着将浓缩液通过分子量为3KD的Vivaflow 50回旋流/切向流超滤器，收集截留液，即得到细胞因子浓缩液。

五、冻干粉的制备

将细胞因子浓缩液中加入甘露醇20%，右旋糖酐3.5%，人白蛋白1%，维生素C 0.6%，丙二醇12%，震荡混匀，然后进行分装，每瓶3 ml，放到入-80度超低温冰箱冷冻处理16 h，冷冻干燥机冻干，真空度1Pa，冷阱温度-70度，抽真空时间为24 h。

实施例3

间充质干细胞来源于脂肪组织，由专业医院或美容机构通过肿胀法吸脂手术获得腹部、大腿根部、背部浅表层的脂肪组织。脂肪组织从无菌采集瓶内吸出，放入50 ml离心管内，每管10-25 ml，加入等量生理盐水，离心6-10 min，剔除上层油脂和底层血水，重复一次，加入混合胶原酶消化，其他步骤同实施例2。取P10代细胞进行表型检测，检测结果如表4和图6所示：

表4

由表4和图6可以看出，P10代的细胞高表达CD73，CD90，CD105，低表达CD34，HLA-DR，符合人脂肪间充质干细胞的表面标志特征。

实施例3间充质干细胞来源于脐带组织，将脐带从保存液中取出，放入预先含有75%酒精的无菌培养皿内，浸泡30s-2 min，用0.9%的生理盐水洗涤3次，剪取脐带，每段2-3 cm。将脐带剥开后，除去1根脐静脉和2根脐动脉，将分离的华通氏胶放入离心管内，用剪刀剪成1-3 mm³小块，加入混合胶原酶消化，其他步骤同实施例2，取P10代细胞进行表型检测，检测结果如表5和图7所示：

表5

由表5和图7可以看出，P10代的细胞高表达CD73，CD90，CD105，低表达CD34，HLA-DR，符合人脐带间充质干细胞的表面标志特征。

本发明在溶媒的制备过程中选用了细胞裂解液，干细胞裂解液中包含血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、白介素-6、白介素-7、巨核细胞集落刺激因、肿瘤坏死因子、干扰素因子及脱氧核糖核酸、核糖核酸、活性多肽、以及免疫蛋白IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，这些物质可以促进机体干细胞生长、增殖，起到活化干细胞作用，用于精华液的制备，使用精华液时可以从根本上调节人体生理机能；本发明采用Vivaflow 50回旋流/切向流超滤器制备细胞因子浓缩液，在恒流泵的的作用下，将不同规格的超滤器串联使用，整个管路完全处于无菌封闭状态，并且不仅能够提高因子的回收率，截掉糖类，大分子蛋白等杂质，而且减少人为的干预，自动化的程度高，适用于规模化浓缩；本发明通过将冻干粉和溶媒保存在4-8度环境下，可以有效保持干细胞生长因子和活性物质的活性。

上述实施例只是本发明的较佳实施例，并不是对本发明技术方案的限制，只要是不经过创造性劳动即可在上述实施例的基础上实现的技术方案，均应视为落入本发明专利的权利保护范围内。