一种用于细胞培养的三维支架及其制备方法与流程

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种用于细胞培养的三维支架及其制备方法。

背景技术：

细胞培养泛指所有体外培养，其含义是指从动物活体体内取出组织，通过机械的方法或酶消化的方法将组织分离成单细胞，模拟体内生理环境等特定的体内条件下，进行孵育培养，使之生存并生长。

常规的细胞培养模式包括二维细胞培养，是在细胞培养板如2、4、6、12、24、48、96孔细胞培养板或细胞培养瓶、生物反应器等中进行，细胞在培养基中以一种二维方式单层贴壁生长。然而，多项研究发现在体外二维培养的细胞的基因表达、信号转导和形态学都可能与在生物体内三维生长的细胞有差异。

壳聚糖又称为脱乙酰甲壳素，是一种天然高分子材料，具有良好的生物相容性、血液相容性、安全性和微生物降解性，在医药、食品、化妆品、化工等领域的应用研究均取得了重大进展，胶原是构成细胞外基质的骨架，在生物、医药、化妆品等行业也具有广泛的应用价值。

由于壳聚糖和胶原能够交联键合获得复合材料，该复合材料由于具有良好的生物相容性而被应用于生物敷料、皮肤支架材料等方面，能够促进细胞的生长，加快创面修复，而在细胞培养方面的应用还未见报道，尤其是三维细胞培养急需要开发出一种具有良好生物相容性、良好的稳定性和微循环特性的支架材料。

技术实现要素：

为达到上述目的，本发明实施例提供一种用于细胞培养的三维支架及其制备方法，能够为细胞培养提供符合生产要求的三维支架结构，模拟体内培养环境，提高细胞的体外培养效果。

一方面，本发明实施例提供一种用于细胞培养的三维支架，所述三维支架包括多孔支架材料，所述多孔支架材料的含水量小于等于1％；所述多孔支架材料包括：胶原和壳聚糖。

优选的，所述三维支架还包括：包埋在所述多孔支架材料中或者贴合在所述多孔支架材料表面的纳米纤维膜，所述纳米纤维膜通过静电纺丝的方法制备获得。

可选的，所述多孔支架材料还包括：交联剂，所述交联剂选自三偏磷酸钠、六偏磷酸钠和京尼平中的任意一种。

优选的，所述三维支架为柱状。

进一步的，所述三维支架的横截面为圆形。

可选的，所述纳米纤维膜的孔径为100-1000nm。

另一方面，本发明实施例提供一种如上所述的三维支架的制备方法，包括：

步骤1)配制所述胶原-壳聚糖的乙酸溶液；

步骤2)将所述胶原-壳聚糖的乙酸溶液脱泡后注入容器中，冷冻干燥，剪裁成预设形状，获得多孔支架材料；

或者，选择具有多个孔的细胞培养孔板，其中，所述细胞培养孔板满足以下条件：所述细胞培养孔板包括设置在边缘的环绕孔以及由所述环绕孔包围在中心的中心孔；

将所述胶原-壳聚糖的乙酸溶液脱泡后注入所述中心孔中至预设高度，在所述环绕孔内注入水至预设高度，对其进行冷冻干燥，获得多孔支架材料。

优选的，所述方法还包括：

步骤3)将纳米纤维膜裁剪成与所述多孔支架材料的表面形状一致的形状，将其贴合在所述多孔支架材料的表面，获得三维支架。

可选的，所述将所述胶原-壳聚糖的乙酸溶液脱泡后注入容器中或者将所述胶原-壳聚糖的乙酸溶液脱泡后注入所述中心孔中至预设高度之前还包括：

将所述纳米纤维膜裁剪成与所述容器或者所述细胞培养孔板的孔的横截面形状一致的形状，并置于所述容器或者所述中心孔中。

进一步的，所述步骤2)中冷冻干燥之后还包括：

对冷冻干燥后的产品依次进行中和处理和交联处理，并再次进行冷冻干燥处理。

优选的，所述交联处理所采用的交联剂为三偏磷酸钠、六偏磷酸钠和京尼平中的任意一种。

进一步的，所述交联处理的温度为30-50℃，时间为0.5-3h。

本发明实施例提供一种用于细胞培养的三维支架及其制备方法，由于壳聚糖具有良好的生物相容性、血液相容性和安全性，胶原是构成细胞外基质的骨架，两者混合之后冻干能够获得具有多孔结构的支架材料，该多孔支架材料有利于细胞的粘附、生长，为细胞生长提供支撑，将其作为支架应用于细胞培养，能够模拟体内的三维培养环境，与二维培养方式相比，细胞的分化更接近于体内分化，使得细胞的基因表达、信号转导和形态学均能够获得有效研究。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的一种细胞染色图片；

图2为本发明实施例提供的一种细胞在扫描电镜下的生长形态的扫描图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

一方面，本发明实施例提供一种用于细胞培养的三维支架，所述三维支架包括多孔支架材料，所述多孔支架材料的含水量小于等于1％；所述多孔支架材料包括：胶原和壳聚糖。

本发明实施例提供一种用于细胞培养的三维支架，由于壳聚糖具有良好的生物相容性、血液相容性和安全性，胶原是构成细胞外基质的骨架，该多孔支架材料有利于细胞的粘附、生长，为细胞生长提供支撑，将其作为支架应用于细胞培养，能够模拟体内的三维培养环境，与二维培养方式相比，细胞的分化更接近于体内分化，使得细胞的基因表达、信号转导和形态学均能够获得有效研究。

本发明的一实施例中，所述三维支架还包括：包埋在所述多孔支架材料中或者贴合在所述多孔支架材料表面的纳米纤维膜，所述纳米纤维膜通过静电纺丝的方法制备获得。

通过加入纳米纤维膜，将纳米纤维支架与所述多孔支架材料两者相结合，能够相互支撑，克服纳米纤维膜在单独使用时刚性差、易损坏的缺陷，使得所述三维支架更接近三维立体形态，使得细胞生长更接近于三维形态，提升细胞的培养效果。

其中，静电纺丝技术是指在静电作用下进行纺丝制备纤维膜的技术。通常所述纳米纤维膜具有三维多孔结构，孔径为纳米级。

优选的，所述纳米纤维膜的孔径为100-1000nm。更优选为200-600nm。

本发明的一实施例中，所述纳米纤维膜的材料选自聚己内酯、聚乳酸、左旋聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、聚碳酸酯、聚氨酯、聚磷酸酯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚酯酰胺、聚氧乙烷、胶原蛋白、壳聚糖、淀粉、纤维素、明胶、纤维蛋白、丝素蛋白、透明质酸、海藻酸、硫酸软骨素、肝素、琼脂、葡聚糖、褐藻酸中的一种或者几种混合物。

其中，所述纳米纤维膜可以通过生物胶或者医用胶黏剂贴合在所述多孔支架材料的表面。生物胶或者医用胶黏剂可以为非细胞毒性的材料，例如天然橡胶、丙烯酸酯、胶原蛋白等，在此不做限定。

本发明的又一实施例中，所述多孔支架材料还包括：交联剂，所述交联剂选自三偏磷酸钠、六偏磷酸钠和京尼平中的任意一种。通过交联剂对所述壳聚糖和胶原进行交联处理，能够获得强度较高的复合材料，该复合材料强度和稳定性较高，从而使得在使用时更接近三维形态，不易损坏变形。

其中，对所述三维支架的形状不做限定，只要便于细胞粘附、为细胞生长提供三维空间即可。

本发明的一实施例中，所述三维支架为柱状。由于在细胞培养过程中，大多细胞均处于细胞培养孔板、反应器等容器中进行培养，便于对细胞的生长环境进行调控，因此，将所述三维支架做成柱状，并将其置于所述细胞培养孔板、反应器中，能够为细胞进行三维培养提供方便。

优选的，所述三维支架的横截面为圆形。将所述三维支架做成与所述细胞培养孔板和反应器的内表面形状相匹配的形状，有利于细胞的粘附生长。

另一方面，本发明实施例提供一种如上所述的三维支架的制备方法，包括：

步骤1)配制所述胶原-壳聚糖的乙酸溶液；

步骤2)将所述胶原-壳聚糖的乙酸溶液脱泡后注入容器中，冷冻干燥，剪裁成预设形状，获得多孔支架材料；

或者，选择具有多个孔的细胞培养孔板，其中，所述细胞培养孔板满足以下条件：所述细胞培养孔板包括设置在边缘的环绕孔以及由所述环绕孔包围在中心的中心孔；

将所述胶原-壳聚糖的乙酸溶液脱泡后注入所述中心孔中至预设高度，在所述环绕孔内注入水至预设高度，对其进行冷冻干燥，获得多孔支架材料。

本发明实施例提供一种用于细胞培养的三维支架的制备方法，由于壳聚糖具有良好的生物相容性、血液相容性和安全性，胶原是构成细胞外基质的骨架，将两者混合并冻干后，能够获得具有多孔结构的支架材料，将其裁剪成一定的形状，或者将其在一定形状的模具中冻干，能够获得具有一定形状的多孔支架材料，将具有一定形状的多孔支架材料应用于细胞培养时，能够模拟体内的三维培养环境，与二维培养方式相比，细胞的分化更接近于体内分化，使得细胞的基因表达、信号转导和形态学均能够获得有效研究，并且，通过该方法能够对所述多孔支架材料进行批量化生产，从而能够满足细胞的大规模的体外培养，提高细胞的培养效率。

进一步地，通过在所述中心孔外围的环绕孔内加入水进行冷冻干燥，能够获得孔分布较为均匀的多孔支架材料。

其中，所述细胞培养孔板根据孔的多少包括2孔、4孔、8孔、12孔、24孔、48孔和96孔等，以96孔为例，环绕孔的个数为36，中心孔的个数为60。

其中，对配制所述胶原-壳聚糖的乙酸溶液的具体操作不做限定。

为了保证产品的细胞无毒性，在整个操作过程中可以对所使用的容器进行消毒，为了防止产品变质，可以在适宜的温度下进行操作，使得所述胶原、壳聚糖的生物活性得以保持。

本发明的一实施例中，配制浓度为0.1M/L的乙酸的水溶液，并进行无菌过滤；再将壳聚糖与所述乙酸的水溶液以一定的比例进行混合，并在搅拌下在45-60℃下加热，使得所述壳聚糖溶解于所述乙酸的水溶液中，获得壳聚糖的乙酸溶液；

而后，再将胶原蛋白溶液、水以一定的比例加入所述壳聚糖的乙酸溶液中，混合搅拌均匀，获得胶原-壳聚糖的乙酸溶液，其中，所述胶原的浓度为0.1g/L-5g/L，所述壳聚糖的浓度为1g/L-25g/L。

其中，需要说明的是，在将所述壳聚糖的乙酸溶液、胶原蛋白溶液进行混合时，由于溶液的粘度较大，通常使用取样枪进行移液，并且在配制过程中会产生大量的气泡，在移液之前可以对溶液进行脱泡处理。

脱泡处理可以采用离心的形式进行，也可以采用取样枪对溶液进行搅拌来实现。

其中，对所述预设高度不做限定，需要说明的是，由于在将细胞接种于所述三维支架表面时，需要预留一定的空间，因此，所述三维支架的高度小于所述细胞培养孔板中孔的容置高度。

本发明的又一实施例中，所述方法还包括：

步骤3)将纳米纤维膜裁剪成与所述多孔支架材料的表面形状一致的形状，将其贴合在所述多孔支架材料的表面，获得三维支架。

通过在所述多孔支架材料表面贴合所述纳米纤维膜，所获得的三维支架更接近于三维结构，能够模拟体内立体环境，使得细胞培养更接近于三维形态。

本发明的一实施例中，所述将所述胶原-壳聚糖的乙酸溶液脱泡后注入容器中或者将所述胶原-壳聚糖的乙酸溶液脱泡后注入所述中心孔中至预设高度之前还包括：

将所述纳米纤维膜裁剪成与所述容器或者所述细胞培养孔板的孔的横截面形状一致的形状，并置于所述容器或者所述中心孔中。

通过将所述纳米纤维膜事先放入所述容器或者所述中心孔中，在将所述胶原-壳聚糖的乙酸溶液注入时，由于纳米纤维膜比较轻，会漂浮在上层，这样，在冻干后，所述纳米纤维膜被包埋在所述多孔支架材料中，两者结合同样能够克服纳米纤维膜在单独使用时刚性差、易损坏的缺陷，从而使得所述三维支架更接近三维立体形态，使得细胞生长更接近于三维形态，提升细胞的培养效果。

其中，需要说明的是，所述冷冻干燥是指将物料冷冻到冰点以下从而使水转变为冰，在真空下冰直接转变为蒸汽而除去的干燥方法，冷冻干燥适用于热敏物质，例如，具有生物活性的物质等，通过冷冻干燥能够保持物料的稳定性与生物活性，并且冷冻干燥后的成品呈多孔状。

其中，对所述冷冻干燥的具体操作以及具体条件不做限定，只要能够获得具有多孔结构的支架材料即可。

冷冻干燥过程具体如下表1所示，分为三个阶段：预冻结段、一次干燥阶段与二次干燥阶段，在预冻阶段要严格控制预冻温度(通常比预冻物质的共熔点低几度)。如果预冻温度不够低，则可能会发生不能被完全冻结，在抽真空升华时会膨胀起泡；若预冻温度太低，不仅会增加不必要的能量消耗，而且对于某些生物活性物质，会降低其冻干后的活性保持率。在一次干燥阶段即在真空下升华的阶段，为保证冰的升华，应开启加热系统，不断供给冰升华所需的热量；二次干燥阶段所除去的水分为结合水分，此时固体表面的水蒸气压呈不同程度的降低，干燥速度明显下降。在保证产品质量的前提下，在此阶段内应适当提高温度，以利于水分的蒸发。

表1

本发明的一实施例中，所述步骤2)中冷冻干燥之后还包括：

对冷冻干燥后的产品依次进行中和处理和交联处理，并再次进行冷冻干燥处理。

通过对所述冷冻干燥后的产品进行中和处理、交联处理以及再次冷冻干燥处理，能够对所述多孔支架材料进行优化处理，其中，通过中和处理，能够将所述多孔支架材料的pH值调节至与人体相适应，有利于模拟体内pH环境，通过交联处理，能够使得胶原和壳聚糖发生交联反应形成网状结构，提高所述多孔支架材料的韧性与强度，通过再次冷冻干燥处理进而获得具有多孔结构的三维支架。

在中和处理过程中所采用的中和试剂不做限定，所述中和试剂可以为氢氧化钠、氢氧化钾等。

本发明的一实施例中，所述中和处理所采用的中和试剂为氢氧化钠或者磷酸氢二钠。采用该中和试剂，不会对胶原-壳聚糖的多孔支架材料产生腐蚀。

其中，对所述交联处理所采用的交联剂不做限定，所述交联剂可以为碳化二亚胺，也可以为京尼平。

优选的，所述交联处理所采用的交联剂为三偏磷酸钠、六偏磷酸钠和京尼平中的任意一种。其中，所述三偏磷酸钠和所述六偏磷酸钠通常作为食品添加剂，所述三偏磷酸钠对细胞安全，无毒性；所述六偏磷酸钠可少量添加，对细胞毒性较低；所述京尼平是一种优良的天然生物交联剂，可以与蛋白质、胶原、明胶和壳聚糖等交联制作生物材料，如人造骨骼、伤口包扎材料等，其毒性远低于戊二醛和其他常用化学交联剂。

本发明的又一实施例中，所述交联处理的温度为30-50℃，时间为0.5-3h。温度过高不利于产品的成型，并且会对胶原等具有生物活性的物质产生破坏，温度过低交联速度缓慢，时间过短可能会导致交联效率较低，时间过长影响工时。

为了客观说明本发明所带来的技术效果，下面通过实施例和实验例来详细说明本发明。以下实施例仅以具体实施过程中各组分的实际添加浓度为例进行说明，实际使用时，各组分的浓度并不对本发明目的的实现构成影响。

实施例1

为了方便描述，将实施例1所制备的三维支架记为A。

具体制备方法如下：

1)配制胶原-壳聚糖的乙酸溶液，其中，胶原的浓度为0.1g/L，壳聚糖的浓度为1g/L；

具体的，先配制浓度为0.1M/L的乙酸的水溶液，并进行无菌过滤；再将壳聚糖与所述乙酸的水溶液以一定的比例进行混合，并在搅拌下在45℃下加热，使得所述壳聚糖溶解于所述乙酸的水溶液中，获得壳聚糖的乙酸溶液；

而后，再将胶原蛋白溶液、水以一定的比例加入所述壳聚糖的乙酸溶液中，混合搅拌均匀，获得胶原-壳聚糖的乙酸溶液。

2)将所获得的胶原-壳聚糖的乙酸溶液注入直径为10cm的平皿中，将该平皿置于冻干机中以表1所示冻干程序进行冻干，获得冻干产品。

3)将冻干产品利用氢氧化钠(浓度为0.1mol/L)中和未反应的乙酸溶液至pH值为7。

4)利用三偏磷酸钠(0.1mol/L)在温度为30℃下交联反应0.5h。

5)交联后利用去离子水除去交联剂，按照上述冻干程序重新冻干。

6)冻干后利用6、12、24、96孔板大小的工具剪裁出相应的尺寸的柱状的三维支架。

实施例2

为了方便描述，将实施例2所制备的三维支架记为B。

具体制备方法如下：

1)配制胶原-壳聚糖的乙酸溶液，其中，胶原的浓度为0.1g/L，壳聚糖的浓度为25g/L；

具体的，先配制浓度为0.1M/L的乙酸的水溶液，并进行无菌过滤；再将壳聚糖与所述乙酸的水溶液以一定的比例进行混合，并在搅拌下在60℃下加热，使得所述壳聚糖溶解于所述乙酸的水溶液中，获得壳聚糖的乙酸溶液；

而后，再将胶原蛋白溶液、水以一定的比例加入所述壳聚糖的乙酸溶液中，混合搅拌均匀，获得胶原-壳聚糖的乙酸溶液。

2)将所获得的胶原-壳聚糖的乙酸溶液通过离心脱泡后注入96孔板的60个中心孔中至一定的厚度，在36个环绕孔中注入水，将该96孔板置于冻干机中按照表1所示冻干程序进行冻干，获得冻干产品。

3)将孔径大小为100-1000nm的纳米纤维膜裁剪成与所述中心孔的直径大小一致的圆形，并将其贴合在所述冻干产品的表面。

4)将3)所获得的产品利用磷酸氢二钠(浓度为0.1mol/L)中和未反应的乙酸溶液至pH值为7。

5)将4)利用京尼平(0.1mol/L)在温度为40℃下交联反应2h。

6)交联后利用去离子水除去交联剂，按照上述冻干程序重新冻干，获得与所述孔板的尺寸和规格相适应的三维支架。

实施例3

为了方便描述，将实施例3所制备的三维支架记为C。

具体制备方法如下：

1)配制胶原-壳聚糖的乙酸溶液，其中，胶原的浓度为5g/L，壳聚糖的浓度为10g/L；

具体的，先配制浓度为0.1M/L的乙酸的水溶液，并进行无菌过滤；再将壳聚糖与所述乙酸的水溶液以一定的比例进行混合，并在搅拌下在50℃下加热，使得所述壳聚糖溶解于所述乙酸的水溶液中，获得壳聚糖的乙酸溶液；

而后，再将胶原蛋白溶液、水以一定的比例加入所述壳聚糖的乙酸溶液中，混合搅拌均匀，获得胶原-壳聚糖的乙酸溶液。

2)通过静电纺丝技术制备孔径为100-1000nm的纳米纤维膜。

3)将孔径为100-1000nm的纳米纤维膜裁剪成与96孔板的孔的直径大小一致的圆形，并将其分别置于96孔板的60个中心孔中。

4)将所获得的胶原-壳聚糖的乙酸溶液通过离心液脱泡后注入96孔板的60个中心孔中至一定的厚度，在36个环绕孔中注入水，将该96孔板置于冻干机中按照表1所示冻干程序进行冻干，获得冻干产品。

5)将冻干产品利用磷酸氢二钠(浓度为0.1mol/L)中和未反应的乙酸溶液至pH值为7。

6)将5)所获得的产品利用六偏磷酸钠(0.1mol/L)在温度为50℃下交联反应3h。

7)交联后利用去离子水除去交联剂，按照上述冻干程序重新冻干，获得与所述孔板的尺寸和规格相适应的三维支架。

实验例

将获得的三维支架A放置于灌注式反应器的培养室中用于细胞培养，将所获得的三维支架B连同细胞培养孔板一起用于细胞培养，将所获得的三维支架C转移至8孔的细胞培养孔板中用于细胞培养。其中，在三维支架A中接种软骨细胞，在三维支架B中接种成骨细胞，在三维支架C中接种软骨细胞，并分别为三种细胞提供营养液进行培养，将这三个实验分别记为实验例1、实验例2和实验例3。

检测方法

分别对培养1天、3天和5天后的实验例1-3取样，采用细胞染色法对细胞增殖情况进行检测，采用扫描电镜法对细胞的生长状态进行观察。

其中，细胞染色法是常用的细胞死活鉴定方法，根据活细胞和死细胞在生理机能和性质上的差异进行染色，使得活细胞和死细胞呈现出不同的颜色，从而能够对细胞的死亡率和存活率进行定性研究。

本发明实施例采用钙黄绿素乙酰甲酯(Calcein AM)和双嵌入剂乙锭均二聚物(Ethidium homodimer，EthD)对细胞进行染色，其中，Calcein AM进入细胞与活细胞中的酶反应形成Calcein荧光分子，并保留在细胞内部出现绿色荧光，用此检测活细胞，而EthD-1不能透过活细胞膜，只能进入死细胞和细胞内的基因片段结合后出现红色荧光，用于检测死细胞。

实验结论：

参见图1，其中，1-a、1-b、1-c分别为实验例1中细胞分别培养1天、3天和5天的细胞死活染色后的电子显微照片，2-a、2-b、2-c分别为实验例2中细胞分别培养1天、3天和5天的细胞死活染色后的电子显微照片，3-a、3-b、3-c分别为实验例3中细胞分别培养1天、3天和5天的细胞死活染色后的电子显微照片；从图1中照片可知，随着细胞在所述三维支架上的培养，时间越长携带绿色荧光的细胞越多，细胞呈现不断增殖的趋势，且无红色荧光出现，说明细胞存活率较高。

参见图2，为实验例1中细胞附着在所述三维支架上在不同放大倍数下的扫描电镜图，其中，a为放大2000倍，b为放大5000倍，c为放大2000倍。从图2中照片可知，三维支架对细胞起到支撑作用，细胞镶嵌在所述三维支架中，细胞在所述三维支架上培养的生长状态接近于体内三维培养。

综上所述，该多孔支架材料有利于细胞的粘附、生长，为细胞生长提供支撑，将其作为支架应用于细胞培养，能够模拟体内的三维培养环境，将胶原-壳聚糖多孔支架材料与纳米纤维膜相结合所获得的三维支架具有良好的稳定性，能够为细胞提供接近于体内的生长环境，与二维培养方式相比，细胞的分化更接近于体内分化，使得细胞的基因表达、信号转导和形态学均能够获得有效研究，进一步地，通过对所述三维支架在冻干步骤后进行裁剪成型，或者采用冻干成型，将三维支架模型化，能够实现批量化生产，从而实现细胞的大规模体外培养。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。