本发明涉及一种苝醌衍生物及代谢菌株，特别涉及一种氯代苝醌及其生物制备方法和用途。
(二)
背景技术：
苝醌(perylenequinone，PQ)是一类分布于自然界生物中的光敏色素。近年来发现，它们具有良好的光敏杀伤肿瘤细胞和抑制艾滋病毒的作用，而且PQ化合物还是新型光电转换材料，作为一种新兴光敏活性农药正在受到科学工作者们的重视。
植物内生菌是一类特境的微生物，其生活在健康植物组织细胞间或组织内，没有引起宿主植物任何明显病害症状，是植物内的正常菌群。大量研究表明，植物内生菌分布广，种类多，具有重要生理和生态作用。植物内生菌具有丰富的化学多样性，能够代谢化学结构独特、活性显著的物质。到目前为止，尚未见从烟曲霉(Aspergillus fumigatusus)的代谢产物发现氯代苝醌的报道。
(三)
技术实现要素：
本发明目的是提供一种氯代苝醌及生物制备方法和应用，该氯代苝醌首次从烟曲霉发现，解决了来源问题，且其制备方法简单、高效，能够用于在制备抗菌剂或抗肿瘤药物。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种式(I)所示来源于烟曲霉(Aspergillus fumigatus)SPS-02的氯代苝醌在制备抗菌剂或抗肿瘤药物中的应用，
进一步，优选所述抗菌剂为白色念珠菌(Candida albicans)抗菌剂或大肠杆菌(Escherichia coli)抗菌剂。氯代苝醌对白色念珠菌(Candida albicans)的有效浓度为1.56μM，氯代苝醌对大肠杆菌(Escherichia coli)的有效浓度为0.78μM。
进一步，优选所述抗肿瘤药物为抗肺癌细胞A549活性的药物。氯代苝醌对抗肺癌细胞A549的IC50值为12.79μM。
本发明还提供一种所述氯代苝醌的制备方法，所述方法为：将烟曲霉(Aspergillus fumigatus)SPS-02经发酵培养获得的发酵液过滤或离心，取滤液或上清液用乙酸乙酯萃取，取有机层浓缩至无液体流出，浓缩物经反相高效液相色谱分离纯化，收集第11分钟的峰，去除溶剂，得到所述氯代苝醌。
进一步，所述分离纯化条件为：液相仪器UV-VIS，检测器为岛津SPD-10AV，高效液相输液泵为岛津LC-10AD；色谱条件：C18色谱柱250×4.6mm，流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长256nm；流动相组成体积比7:3的双蒸水：乙腈。
进一步，所述发酵液按如下方法制备：
(1)斜面培养：将烟曲霉(Aspergillus fumigatus)SPS-02接种至斜面培养基，30℃保湿培养3-5天，获得菌体斜面；所述斜面培养基终浓度组成为：氯化钠70g/L，蔗糖20g/L，马铃薯200g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然；
(2)种子培养：从菌体斜面挑取一接种环菌体接种至高盐Czapek种子培养基，在200rpm、30℃条件下摇床培养3-4天，获得种子液；所述高盐Czapek种子培养基终浓度组成为：蔗糖30g/L，磷酸氢二钾1g/L，硝酸钠2g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠70g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然；
(3)发酵培养：将步骤(2)获得的种子液以体积比1:10的接种量接种至发酵培养基，在200rpm、30℃条件下摇床培养9-10天，获得发酵液，发酵培养基终浓度组成同高盐Czapek种子培养基。
本发明所述烟曲霉(Aspergillus fumigatus)SPS-02，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年1月13日，保藏编号为CCTCC No:M2013014，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，已在专利申请CN103113376A中公开。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
(1)本发明提供一种利用烟曲霉SPS-02产氯代苝醌的方法；
(2)本发明的氯代苝醌(I)对大肠杆菌(Escherichia coli)和白色念珠菌(Candida albicans)有很强的抑制作用，可作为新型抗生素，有望应用于制备治疗大肠杆菌或白色念珠菌引起的相关疾病的药物；
(3)本发明还涉及所述氯代苝醌(I)对人体肺癌肿瘤细胞A549有显著的抑制作用，有望应用于制备治疗人体肺癌的药物。
(4)本发明的氯代苝醌(I)来源于烟曲霉SPS-02液体发酵生产，操作工艺简单，周期短，成本低，来源有保证；
(5)本发明利用生物法合成，对环境无污染。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：烟曲霉SPS-02发酵培养液的制备
(1)斜面培养：将烟曲霉SPS-02接种至斜面培养基，30℃培养箱保湿培养3-5天，获得菌体斜面；斜面培养基终浓度组成为：氯化钠70g/L，蔗糖20g/L，马铃薯200g/L，溶剂为蒸馏水，自然pH值。
(2)种子培养：从菌体斜面挑取一接种环菌体接种至高盐Czapek种子培养基，在200rpm、30℃条件下摇床培养3-4天，获得种子液；高盐Czapek种子培养基终浓度组成为：蔗糖30g/L，磷酸氢二钾1g/L，硝酸钠2g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠70g/L，溶剂为蒸馏水，自然pH值。
(3)发酵培养：将步骤(2)获得的种子液以体积比1:10的接种量接种至发酵培养基，在200rpm、30℃条件下摇床培养9-10天，获得发酵培养液，发酵培养基终浓度组成同高盐Czapek种子培养基。
实施例2：氯代苝醌的提取与分离、鉴定
1、氯代苝醌的提取与分离
将实施例1所得发酵液经离心后，取上清液用乙酸乙酯(体积比1:1)常温萃取3次，低温真空浓缩至无液体流出，得到棕色粗浸膏F；粗浸膏F经反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离，收集第11分钟的峰，低温真空去除流动相得到化合物I。液相仪器：UV-VIS，检测器：岛津SPD-10AV；高效液相输液泵：岛津LC-10AD；色谱条件：C18色谱柱250×4.6mm，流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长256nm；流动相组成双蒸水(A)：乙腈(B)＝7:3(体积比)。
2、氯代苝醌(I)的结构鉴定
将获得的目的化合物I进行质谱(Agilent 6210LC/TOF，负源)和核磁共振(Bruker Avance III Unity Plus 500MHz，in DMSO-d)谱测定。
(1)质谱数据为：HRESI-MS m/z 385.0459[M-H]-；确定分子式C20H15O6Cl；1H和13C NMR数据见表1。
表1：化合物(I)的1H谱和13C谱数据(500MHz，CD3SOCD3)
注：s-单峰，d-双峰，t-三重峰。
综上所述，目标产物为氯代苝醌，结构式为式(I)所示：
其中1,2,3a,4,5,6,6a,6b,7,8,9,9a,9b,10,11,12,12a,12b,12c为碳原子序号，该化合物系统命名为8-chloro-3,6a,7,9,10-pentahydroxy-9,8,7,6a-tetrahydroperylen-4(6aH)-one，即8-氯-3,6a,7,9,10-五羟基-9,8,7,6a-四氢苝醌-4(6aH)酮。
实施例3：氯代苝醌抑菌活性评价
氯代苝醌活性评价采用浓度梯度稀释法，每次测定重复6次，测试致病菌包括白色念珠菌(Canidia albicans ATCC10231)和大肠杆菌菌株(Escherichia coli ATCC25922)。
具体方法如下：
1.测试菌液制备：
致病菌白色念珠菌经平板活化培养后，转接至含有PDB培养液的三角瓶中，在200rpm、30±1℃条件下震荡培养48h，通过加入无菌PDB培养液调整OD570至0.2。PDB培养液组成为：土豆200g/L，蔗糖20g/L，溶剂为蒸馏水，自然pH值。
致病菌大肠杆菌经平板活化培养后，转接至含有LB培养液的三角瓶中，在200rpm、30±1℃条件下震荡培养24h，通过加入LB无菌培养液调整OD570至0.2。LB培养液组成为：酵母提取物5g/L、胰蛋白陈10g/L、NaCl 10g/L、溶剂为蒸馏水，pH7.4。
2.测试样品制备：将氯代苝醌(I)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，采用二倍稀释法配制10个浓度的溶液，分别为100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20μM，阳性对照为两性霉素B和阿莫西林，采用二倍稀释法配制10个浓度的溶液，两性霉素B的浓度梯度为100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20μM，阿莫西林的浓度梯度为150、75、37.5、18.75、9.38、4.69、2.34、1.17μM。
3.药敏试验：在无菌96孔板中分别加入指示菌生长所需培养液(即PDB培养液和LB培养液)，并分别接种两株指示菌(即白色念珠菌和大肠杆菌)，菌液浓度OD570值为0.2，然后分别加入步骤2制备的测试样品溶液，每孔加入100μL，两性霉素B与阿莫西林作为阳性对照替代测试样品溶液，细菌在37±1℃下培养24h，真菌在28±1℃下培养48h，酶标仪检测570nm波长下OD值，每组实验做6组平行，数据取平均值，抑制指示菌生长最低浓度就是化合物的最小抑菌浓度即MIC值。结果如表2所示。
表2：氯代苝醌(I)和阳性对照的抗菌MIC值(μM)
抑菌活性评价结果表明，氯代苝醌(I)具有比阳性对照药物(两性霉素B和阿莫西林)更强的抑菌能力，抑制人源致病菌白色念珠菌和大肠杆菌的MIC值分别为1.56、0.78μM。
实施例4：氯代苝醌(I)体外细胞毒活性评价
氯代苝醌(I)细胞毒活性评价采用浓度梯度稀释法，每次测定重复5次，测试细胞系为肺癌细胞株A549细胞。
具体方法如下：
1.细胞系制备：①实验组：取对数生长期的肺癌细胞株A549细胞(细胞培养瓶A-7-1)，用PBS清洗两次，以0.25％胰酶消化，计数，调整细胞密度为1×104个/mL，接种于96孔培养板内，每孔加180μL。②对照组：接种步骤同实验组。③空白组：每孔加180μL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液。在37℃恒温培养箱内培养24h使细胞贴壁。
2.测试样品制备：精密称取氯代苝醌(I)0.0013g，加入1mL DMSO充分溶解，用0.22μm的滤膜过滤，配成3.36μM的母液。取母液用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液梯度稀释，浓度从低到高依次为:12.5、25.0、37.5、50.0、75.0、100.0、150.0μM。对照为5-F-尿嘧啶，DMSO配置成与样品浓度一致。
3.药敏试验：①实验组：每孔加入20μL氯代苝醌(I)梯度液(每个梯度液分别做四个平行孔)，使其终浓度分别为：1.25、2.50、3.75、5.00、7.50、10.00、15.00μM。②空白组：每孔加入20μL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液。③阳性对照组：每孔加入20μL5-F-尿嘧啶梯度液，使其终浓度分别为：1.25、2.50、5.00、7.50、10.00、15.00μM。37℃恒温培养箱内培养48h。48h后，取出96孔板，每孔分别加入20μL MTT试剂，继续培养4h后，每孔吸取100μL上清液，加入100μL DMSO，在摇床上避光震荡10min，在酶标仪上于570nm波长下测量OD值。每组实验做5次平行，数据取平均值，经计算得出样品和对照(5-F-尿嘧啶)的IC50值。结果如表3所示。
表3：氯代苝醌(I)A549细胞毒活性
细胞毒活性研究结果表明，氯代苝醌(I)具有与对照药物(5-F-尿嘧啶)相似的体外抑制人体肺癌肿瘤细胞A549的能力，IC50值为12.79μM。