本发明涉及一种生物医学领域，尤其是涉及一种具有抗菌促骨结合功能的引导骨再生镁合金膜的制备方法。
背景技术：
钛及钛合金植入已成为人类各种器官疾病或缺损缺失的重要修复方法，它已经广泛应用于牙种植体、颌面赝复体固定桩、助听器/义耳固定装置、人工关节、骨内植入式假肢、心脏支架、人工关节等诸多临床领域。然而骨质疏松、重度牙周炎所导致的牙槽嵴萎缩、肿瘤术后、糖尿病等疾病局限了该项技术的运用。为了解决这一部分患者的需求，骨增量是确实可行的解决方案。临床上多采用人工骨材料以及引导骨再生膜材料进行骨增量，然而利用引导骨再生膜和人工骨材料进行垂直以及水平骨增量存在如下难点：1）修复材料的塑形2）骨再生空间的建立和维持3）血液供应 4）预防术后的感染 5）骨增量骨的骨质。镁合金具有良好的金属机械性能，在人体内可降解，并具备可吸收性，由于其降解期间可有效地综合酸性物质提升pH，因此具有一定的抗菌能力。这使镁合金有望成为最适宜的骨引导再生膜材料。但镁合金材料存在以下问题：1）降解速度过快，且会产生大量氢气，无法在足够长的周期内维持骨再生空间 2）镁合金虽有一定的抗菌能力，然而其抗菌性能仍然较为薄弱，当感染较为严重时，引导骨再生术（Guided bone regeneration, GBR）失败可能性较大 3）其促进骨再生能力较弱。因此对镁合金膜进行改性使其具有抗菌和促骨结合能力可取得良好的成效。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种在镁合金膜表面制备涂层以减缓其降解速度，并在涂层中装载骨形成蛋白-2（Bone morphogenetic protein-2，BMP-2）和纳米银颗粒使其具有抗菌和促进骨结合功能的制备方法。
本发明采用以下技术方案：一种具有抗菌促骨结合功能的引导骨再生镁合金膜的制备方法，其特征是包括镁合金膜，对镁合金膜进行以下步骤的操作：
第一步，将镁合金膜用SiC金相砂纸打磨、清洗、干燥；
第二步，在镁合金膜表面制备钙磷涂层，实现对镁合金膜降解速度的减缓；
第三步，在含有钙磷涂层的镁合金膜表面装载BMP-2，使镁合金膜具有促进骨结合的功能；
第四步，在装载有BMP-2的镁合金膜表面装载纳米银颗粒，使镁合金膜具有抗菌和促进骨结合的功能。
作为一种改进，钙磷涂层的制备通过仿生矿化法实现，所述中第二步中钙磷涂层采用5倍浓度的模拟生理体液以仿生矿化法制备，仿生矿化法制备钙磷涂层包括以下步骤：
[1] 5倍浓度的模拟生理体液的配制：根据所需液体体积，保持离子浓度如下：钠离子733.5mM，镁离子：7.5mM，钙离子12.5mM，氯离子720.0mM，磷酸氢根离子5.0mM，硫酸根离子2.5mM，碳酸氢根离子21.0mM；
[2]镁合金膜的预处理：将镁合金膜用依次用p1000,p1800,p2000的SiC金相砂纸打磨、用丙酮、无水乙醇、去离子水进行清洗、氮气流下干燥；
[3]在镁合金表面制备钙磷涂层：将镁合金浸泡于5倍浓度的模拟生理体液，置于温度调控加热器上，将温度感受器探针浸入溶液内，37℃恒温，磁棒旋转搅拌，250圈/min。当溶液的pH升高至7.8以上时，终止反应，取出样品，用纸吸出多余水分，待用；
作为一种改进，掺有BMP-2的钙磷涂层的制备通过BMP-2与涂层共沉积法制备，所述中第三步中用掺有BMP-2的超饱和钙磷溶液与钙磷涂层通过共沉积法在镁合金膜表面装载BMP-2涂层的步骤包括以下步骤：
[1]超饱和钙磷溶液的配制：根据所需液体体积，保持离子浓度如下：钠离子140.0mM，钙离子4.0mM，氯离子144.0mM，磷酸氢根离子2.0mM，并用Tris液进行缓冲，补充相应的离子；
[2]取少量[1]中配制好的溶液于EP管内，并在溶液中加入BMP-2，混合吹打，直至其全部溶解，然后将该液体全部转移至盛有[1]中配制好的反应装置内，混匀，使其终浓度为0.1mg/ml；
[3] BMP-2携带层的制备：将第二步中制备好钙磷涂层的镁合金膜浸泡于[2]中配制好的超饱和钙磷溶液中，并置于37℃恒温水浴摇床内，摇床频率为60次/min，48小时后终止反应，弃去超饱和钙磷溶液，制备有涂层的样品置于冷冻干燥剂内，冻干过夜待用；
作为一种改进，载有纳米银的钙磷涂层的制备通过浸泡-提拉法实现，所述中第四步中装载纳米银颗粒采用[Ag(NH3)2]OH溶液以浸泡-提拉法制备，提拉-浸泡法制备装载有纳米银颗粒的钙磷涂层包括以下步骤：
[1] [Ag(NH3)2]OH溶液的配制：将2wt%的氨水逐滴滴入2wt%的硝酸银溶液中，同时进行超声震荡，直至溶液由浅棕色变为无色透明溶液；
[2]纳米银携带层的制备：将第三步中制备好的样品浸泡于超饱和钙磷溶液内，并置于37℃恒温水浴摇床内，摇床频率为60次/min，48小时后终止反应，弃去超饱和钙磷溶液，制备有涂层的样品置于冷冻干燥剂内，冻干过夜；将制备好的样品在[1]制备好的溶液中浸泡20S，然后以1mm/s的速度匀速提拉，在37℃下晾干，晾干后将样品置于密闭容器中与2wt%的葡萄糖溶液在70℃下反应2小时，氮气流下干燥；
本发明的有益效果：镁合金膜表面载有纳米银和BMP-2的钙磷涂层涂层的主要特征有以下三点：①涂层的组分和结构呈连续性变化；②材料内部没有明显界面；③材料的性质也相应呈梯度变化。因为上述特征而使该涂层具有以下优点：
（1）通过在镁合金表面修饰钙磷涂层减缓其降解速度，使其能够在足够长的时间内维持骨再生空间；
（2）在钙磷涂层中装载纳米银以及BMP-2，使其在GBR术后可以缓释纳米银以达到良好的抗菌效果；同时，装载的BMP-2可以帮助更好地成骨，从而提升GBR的成功率；
（3）纳米银是一种良好的抗菌剂，有研究表明其可以对多种细菌有良好的杀菌效果，包括真菌以及一些有耐药性的细菌。另外有研究表明纳米银不容易产生耐药性，低浓度的纳米银对人体无害且能够有效地抑制微生物繁殖、生长或致其死亡。因此，载银的抗菌剂已被广泛地应用于纺织、环保、建材以及医学领域；
（4）骨形成蛋白-2（Bone morphogenetic protein-2，BMP-2）是一种由二硫键固定的双链多肽二聚体分子，且已通过美国FDA认证批准其进行临床应用。大量的动物实验和临床试验证实其具有良好的引导骨再生能力。目前BMP-2的应用多是用多聚物携带BMP-2的方式。其主要方式是将BMP-2等生长因子直接吸附于多聚物的表面。然而这种在多聚物表面吸附的骨生长因子仅能形成有限的、二维的蛋白存储空间,当暴露于生理环境时,生长因子会迅速释放,无法实现长期的缓慢的控制释放,以至无法维持诱导成骨的微环境。为了克服这个缺点,许多产品试图大幅度提高骨生长因子剂量,有些产品的用量是级的mg级的。虽然在一定程度上解决了维持诱导成骨微环境的问题,但也带来了许多新的问题大量应用骨形成蛋白造成产品价格昂贵,影响其在临床的推广应用高剂量骨形成蛋白会在短期内形成极高的局部浓度,会造成破骨细胞功能亢进、骨粘连等。其它能够实现骨生长因子缓慢释放的载体,例如微胶囊、微颗粒等,在制备过程中大多需要涉及到有机溶剂等有害物质,而且目前尚无法与多聚物结合，通过仿生矿化法和与涂层共沉积法制备装载有BMP-2的钙磷涂层可以很好地解决以上问题；
（5）本发明设计的这种具有抗菌以及促进成骨作用的可吸收镁合金膜可以很好地解决现有引导骨组织再生膜存在的一些缺陷；
（6）该种新型膜可以解决现有可吸收膜无法较好地建立并维持骨再生空间的缺点，现有不可吸收膜需要二次手术取出的缺点，更为重要的是它可以为解决GBR术后感染以及骨结合失败提供一种有效的解决途径。
附图说明：图1是本发明装载有纳米银和BMP-2的钙磷涂层的镁合金膜的结构图。其中1为镁合金膜，2为装载有纳米银和BMP-2的钙磷涂层，从上至下分别为载纳米银层、钙磷层、载BMP-2层、钙磷层。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
如图1所示，为本发明具有的制备方法的一种具有抗菌促骨结合功能的引导骨再生镁合金膜具体实施例。该实施例包括镁合金膜，对镁合金膜进行以下步骤的操作：
第一步，将镁合金膜用SiC金相砂纸打磨、清洗、干燥；
第二步，在镁合金膜表面制备钙磷涂层，配制5倍浓度模拟生理体液，并取10ml，通过仿生矿化法，在镁合金膜表面制备钙磷涂层，实现对镁合金膜降解速度的减缓；
第三步，在含有钙磷涂层的镁合金膜表面装载BMP-2，使镁合金膜具有促进骨结合的功能；
第四步，在装载有BMP-2的镁合金膜表面装载纳米银颗粒，使镁合金膜具有抗菌和促进骨结合的功能；
近年来仿生矿化己经成为增加多聚物骨引导性最常用的方法之一。但是,仿生矿化法也有缺点。同生物体内骨组织矿化一样,仿生矿化必须依靠活性基团作为晶核才能启动钙磷沉积。而多聚物表面恰恰缺乏这些活性基团。学者们通过水解及碱处理等方法对多聚物表面进行修饰,添加活性基团,以提高多聚物表面诱导仿生矿化的能力。但是,这些表面修饰方法的适用性非常有限,无法满足在各种多聚物表面制备涂层的需要,而且多聚物的生物相容性也可能在表面修饰过程中发生改变。因此,仿生矿化法依然受到多聚物表面物理、化学性质等限制诱导矿化因素的影响而无法广泛使用。寻找一种不依赖多聚物表面性质,能够广泛应用于多种多聚物的仿生矿化涂层的制备方法具有重大的应用价值和意义。两段式仿生钙磷涂层能够在镁合金表面制备涂层并作为生物活性因子的载体,实现因子的控制释放；
作为一种改进的具体实施方式，作为一种改进，钙磷涂层的制备通过仿生矿化法实现，所述中第二步中钙磷涂层采用5倍浓度的模拟生理体液以仿生矿化法制备，仿生矿化法制备钙磷涂层包括以下步骤：
[1] 5倍浓度的模拟生理体液的配制：根据所需液体体积，保持离子浓度如下：钠离子733.5mM，镁离子：7.5mM，钙离子12.5mM，氯离子720.0mM，磷酸氢根离子5.0mM，硫酸根离子2.5mM，碳酸氢根离子21.0mM；
[2]镁合金膜的预处理：将镁合金膜用依次用p1000,p1800,p2000的SiC金相砂纸打磨、用丙酮、无水乙醇、去离子水进行清洗、氮气流下干燥；
[3]在镁合金表面制备钙磷涂层：将镁合金浸泡于5倍浓度的模拟生理体液，置于温度调控加热器上，将温度感受器探针浸入溶液内，37℃恒温，磁棒旋转搅拌，250圈/min。当溶液的pH升高至7.8以上时，终止反应，取出样品，用纸吸出多余水分，待用；
作为一种改进，掺有BMP-2的钙磷涂层的制备通过BMP-2与涂层共沉积法制备，所述中第三步中用掺有BMP-2的超饱和钙磷溶液与钙磷涂层通过共沉积法在镁合金膜表面装载BMP-2涂层的步骤包括以下步骤：
[1]超饱和钙磷溶液的配制：根据所需液体体积，保持离子浓度如下：钠离子140.0mM，钙离子4.0mM，氯离子144.0mM，磷酸氢根离子2.0mM，并用Tris液进行缓冲，补充相应的离子；
[2]取少量[1]中配制好的溶液于EP管内，并在溶液中加入BMP-2，混合吹打，直至其全部溶解，然后将该液体全部转移至盛有[1]中配制好的反应装置内，混匀，使其终浓度为0.1mg/ml；
[3] BMP-2携带层的制备：将第二步中制备好钙磷涂层的镁合金膜浸泡于[2]中配制好的超饱和钙磷溶液中，并置于37℃恒温水浴摇床内，摇床频率为60次/min，48小时后终止反应，弃去超饱和钙磷溶液，制备有涂层的样品置于冷冻干燥剂内，冻干过夜待用；
作为一种改进，载有纳米银的钙磷涂层的制备通过浸泡-提拉法实现，所述中第四步中装载纳米银颗粒采用[Ag(NH3)2]OH溶液以浸泡-提拉法制备，提拉-浸泡法制备装载有纳米银颗粒的钙磷涂层包括以下步骤：
[1] [Ag(NH3)2]OH溶液的配制：将2wt%的氨水逐滴滴入2wt%的硝酸银溶液中，同时进行超声震荡，直至溶液由浅棕色变为无色透明溶液；
[2]纳米银携带层的制备：将第三步中制备好的样品浸泡于超饱和钙磷溶液内，并置于37℃恒温水浴摇床内，摇床频率为60次/min，48小时后终止反应，弃去超饱和钙磷溶液，制备有涂层的样品置于冷冻干燥剂内，冻干过夜；将制备好的样品在[1]制备好的溶液中浸泡20S，然后以1mm/s的速度匀速提拉，在37℃下晾干，晾干后将样品置于密闭容器中与2wt%的葡萄糖溶液在70℃下反应2小时，氮气流下干燥。