本发明属于固相多肽合成技术领域，特别是涉及一种RGD环肽的合成方法。
背景技术：
RGD肽是一类含有Arg-Gly-Asp序列的短肽，有直线肽和环肽之分。RGD序列是细胞外基质与整合素结合的通用识别位点，环肽既可使肽的生物稳定性增加，还可使肽的构象数目减少，便于构象研究。涂柳晓等研究发现，RGD环肽用于脂质体修饰能明显提高给药系统的肿瘤靶向性。
大多数内源性线性肽在循环过程中一般只有很短的半衰期，因而减弱了其治疗效果和生物活性，为了获得可以接受的抗肿瘤转移效果，往往需要高剂量的含RGD序列的线性肽，这无疑增加了治疗费用并有可能导致不必要的副作用，因此，增加肽类化合物稳定性、提高肽的生物活性，是许多药物化学家们对含RGD的肽进行改造的目标。大量研究表明，将肽的主体或部分结构改为环形结构，即肽的环化是增加线性肽稳定性的方法之一。
公告号CN 103588863 A公开了一种RGD的环肽制备工艺，通过加入缩合剂脱水缩合的方法形成环肽，工艺流程复杂，采用先切割后环化的方法，产物中往往会残留杂质，导致纯化不彻底。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种RGD环肽的合成方法，该合成方法环化收率高、工艺简单周期短、成本低，具有广泛的市场应用前景。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种RGD环肽的合成方法，包括如下步骤：
(1)、以氯树脂为起始树脂载体，通过固相合成法依次缩合多肽序列中相对应的Fmoc-氨基酸，得到多肽-2-Cl Resin；
(2)、将多肽-2-Cl Resin进行全保护切割反应，切割液进行旋蒸、冻干，得到待环化全保护肽；
(3)、将冻干的待环化全保护肽链样品用DCM溶解，进行液相环化，得到全保护环化肽；
(4)、将环化液旋蒸进行切割、沉降反应，并采用反相高效液相色谱法纯化，冻干得到RGD环肽纯品多肽。
进一步地，步骤(1)中所述氯树脂为2-Cl(Trt)-Cl Resin，取代度为0.8mmol/g。
进一步地，步骤(1)中所述缩合反应中以HOBT/DIC为活化剂和缩合剂，缩合反应时间为40-60min。
进一步地，步骤(1)中所述Fmoc-保护氨基酸的缩合顺序依次为，Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH，缩合反应温度为30℃，缩合反应时间为40-60min。
进一步地，步骤(2)中所述全保护切割反应的切割试剂100ml配方为：80ml DCM+20ml TFE，切割反应时间为30min。
进一步地，步骤(3)中所述液相环化反应中以DIC/HOBT为环化缩合剂，环化温度为30℃，环化反应过夜。
进一步地，步骤(4)中所述环化液的切割、沉降反应中切割试剂的100mmL配方为：95ml TFA+2.5ml H2O+2.5ml TIS，切割反应时间为90min，反应结束后用低温预冷的乙醚试剂进行多肽粗肽的沉降。
进一步地：步骤(4)中所述反相高效液相色谱法中纯化选用C18，10um制备柱，以A相：0.1％TFA/水，B相：0.1％TFA/乙腈为流动相，以B.Cone/％(10→25)，Time.0→45min的梯度程序进行多肽的分离提纯。
本发明具有以下有益效果：
本发明制备的RGD环肽纯品，称量后经分析计算，目标纯品环化肽的纯度为95.3％，其纯品收率为75.2％，与现有技术仅40-60％的收率相比较，产品收率有大幅度地提高，并且产品消旋率低，生物活性高，操作工艺简单。
具体实施方式
本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
S1、称取2-Cl(Trt)-Cl Resin 1g置于多肽合成反应器中，于多肽合成反应器中加入DCM溶液浸没2-Cl树脂，溶胀30min后抽干溶剂；
其中，2-Cl(Trt)-Cl Resin取代度为0.8mmol/g；
需要说明的是，本发明中一些常用缩写具有如下含义：
2-Cl(Trt)-Cl Resin：2-氯三苯甲基氯树脂；
DIC：二异丙基碳二亚胺；
HOBT：1-羟基苯并三唑；
Fmoc：芴甲氧羰基；
Boc：叔丁氧羰基；
otBu：氧叔丁基；
DIEA：N，N-二异丙基乙胺；
DMF：N，N-二甲基甲酰胺；
DCM：二氯甲烷；
TFA：三氟乙酸；
TFE：三氟乙醇；
TIS：三异丙基硅烷；
S2、称取192mg的保护氨基酸Fmoc-Gly-OH和140mg HOBT加入10mL离心管中，加入5mL DCM溶液溶解，于该离心管中用滴管滴入适量催化剂DIEA溶液，活化20s；
S3、将S2中配制的溶液5mL与S1中溶胀后的2-Cl(Trt)-Cl Resin混合后加入至多肽合成反应器中反应60min，反应结束后抽干溶剂；
S4、配制脱保护溶液，所述脱保护溶液为甲醇与DIEA的混合溶液，其中，甲醇与DIEA溶液的体积比1:1，将5mL脱保护溶液加入至S3的多肽合成反应器中封掉树脂上的反应活性位点，将多肽合成反应器置于20-30r/min的摇床上摇动30min，反应结束后抽干脱保护溶液；
S5、于S4的多肽合成反应器中加入DMF溶液洗涤树脂，所述DMF溶液加入体积为多肽合成反应器体积的1/3-1/2，将多肽反应器置于脱色摇床上摇动60s，抽干DMF溶液；
重复S5步骤2-4次；
S6、于S5的多肽合成反应器中加入20％哌啶/DMF脱保护溶液脱除氨基保护基FMOC，其中，所述20％哌啶/DMF脱保护溶液体积为多肽合成反应器体积的1/3-1/2；
将多肽合成反应器置于30r/min的脱色摇床上摇动反应20min，反应结束后，抽干溶剂；
S7、称取281mg保护氨基酸Fmoc-Arg(pbf)-OH和135mg HOBT加入10mL离心管中，加入5mL DCM溶液溶解，于该离心管中用滴管滴入适量催化剂DIEA溶液，活化20s后得到保护氨基酸溶液；
S8、将S7中制备的保护氨基酸溶液加入至S6中多肽合成反应器中与树脂反应，将多肽合成反应器30℃的恒温震荡器中反应40-60min，反应结束后用DMF溶液洗涤树脂；
将洗涤后的树脂用S6中的方法脱除氨基保护基FMOC，之后用DMF溶液洗涤；
S9、依照上述步骤于树脂上依次接上Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH氨基酸，得到多肽-2-Cl树脂；
所述多肽-2-Cl树脂为：
Asp(otBu)-D-Phe-Lys(Boc)-Arg(pbf)-Gly-2-Cl Resin；
需要说明的是，所述保护氨基酸Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Phe-OH和Fmoc-Asp(otBu)-OH的分子量分别为297.3、648.77、468.6、387.4和411.5；
S10、配制全保护切割试剂，所述全保护切割试剂为DCM与TFE的混合溶液，其中DCM溶液与TFE溶液的体积比为4:1，将多肽-2-Cl树脂加入至全保护切割试剂中切割30min，反应结束后旋转蒸发全保护切割试剂，将树脂冷冻干燥，得到待环化全保护肽；
所述待环化全保护肽为：
Asp(otBu)-D-Phe-Lys(Boc)-Arg(pbf)-Gly；
S11、将S10中得到的待环化全保护肽溶解于适量DMF溶液中，于溶液中加入DIC和HOBT，于30℃水浴中环化反应过夜，得到全保护环化肽，旋转蒸发环化液；
其中，所述DIC和HOBT的加入量均为裸肽质量的的三倍；
所述全保护环化肽为：
S12、配制切割试剂，所述切割试剂为TFA、TIS和H2O的混合溶液，其中TFA、TIS和H2O的体积比为38:1:1；
将S11中制备的全保护环化肽加入至所述切割试剂中，切割反应90min；
反应结束后用低温预冷的乙醚试剂进行多肽粗肽的沉降，真空冷冻干燥得到粗品环肽；
S13、将S12中制备的粗品环肽经反相高效液相色谱法纯化得到RGD环肽，其中，纯化条件为，色谱柱为C18，10μm制备柱，流动相为A(0.1％TFA/水)/B(0.1％TFA/乙腈)，梯度程序为
收集目标多肽溶液，冷冻干燥后称重，计算RGD环肽纯品收率为74.8％，纯度为99.2％；
所述RGD环肽纯品为：
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。