一种从酵母细胞中制备还原型谷胱甘肽的方法与流程

本发明涉及高纯度还原型谷胱甘肽纯化方法以及从酵母细胞中制备高纯度还原型谷胱甘肽的工艺。属于生物工程和药物化合物领域。

背景技术：

还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)作为一种重要的药物试剂，在临床上主要用于化疗、低氧血症、肝脏疾病、有机磷、胺基或硝基化合物中毒的治疗和辅助治疗；同时谷胱甘肽的抗氧化性能又使得它在食品和化妆品加工业中作为添加剂而受到青睐。市场上用于销售的产品主要包括：保肝护肝药谷胱甘肽片(阿拓莫兰)，治疗中毒性肝损伤药物双益健(注射用还原型谷胱甘肽)，谷胱甘肽全身美白乳，谷胱甘肽祛斑精华等医药产品及化妆品。2015年，GSH国内外市场每年以10％的速度递增。日本Kyowa(协和发酵工业株式会社)和Ajinomoto(味之素株式会社)等公司早在20世纪80年代就实现了商业化酵母发酵生产谷胱甘肽的产业化，现已成为全世界谷胱甘肽的主要生产和供应商，同时形成了技术壁垒。国内山东金城医药化工股份有限公司引进日本谷胱甘肽纯化技术，成为国内首家从酵母中生产谷胱甘肽的公司。

谷胱甘肽来源于动物、植物、微生物及化学合成。其中以酵母、小麦胚芽中的含量最为丰富。谷胱甘肽的纯化方法主要包括离子交换法、电渗析法和双水相法等，诸如此类方法多受限于谷胱甘肽的结构不稳定性，导致纯化倍数低、工艺流程繁杂、生产成本高。因此，开发低成本、可工业化的还原型谷胱甘肽纯化工艺，对谷胱甘肽在食药领域相关产品的研制尤为重要。同时为制定《富营养素酵母》国家标准编制提供理论和实践参考。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种从酵母细胞中制备高纯度还原型谷胱甘肽的方法，该方法能够高效、低成本的应用在酵母细胞生产谷胱甘肽的工业化，为食药领域提供高纯度还原型谷胱甘肽原料。同时为制定《富营养素酵母》国家标准编制提供理论和实践参考。

本发明的目的是这样实现的：一种从酵母细胞中制备高纯度还原型谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：

(1)富含还原型谷胱甘肽酵母细胞的制备：以酵母细胞发酵法生产还原型谷胱甘肽，以酵母细胞干重计算，GSH含量为1-5％，富含还原型谷胱甘肽酵母细胞，包括：酵母乳、酵母干粉、酵母抽提物等形式。

(2)酵母细胞热提取：取一定质量的酵母细胞，以5-15倍，优选为10倍体积的去离子水悬浮。调节pH值为2.0，在80-100℃，优选为85-90℃下，搅拌0-30分钟，优选为5-15分钟。完成后迅速置于冰水中冷却至20℃以下，3000-10000rpm/min，优选为7500rpm/min下离心10-30分钟，优选为15分钟。除去沉淀物，留存轻相。

(3)GSH-Cu络合物的制备：利用HPLC技术检测步骤2)轻相中GSH的含量。在10-100rpm/min，优选为50rpm/min搅拌状态下，用NaOH调节轻相pH值为5.0-7.0，优选为6.0。根据轻相中GSH的摩尔质量，按照1:1-1:20，优选为1:2-1:15的配比，添加CuSO₄。维持搅拌15-60分钟，优选为30分钟。3000-10000rpm/min，优选为7500rpm/min下离心20-40分钟，优选为30分钟。留存重相。

(4)洗涤：取一定质量的GSH-Cu络合物，以100-200倍，优选为150倍体积的纯化水悬浮，维持搅拌20-40分钟，优选为30分钟。3000-10000rpm/min，优选为7500rpm/min下离心20-40分钟，优选为30分钟。留存重相。

(5)解络合：取一定质量的GSH-Cu络合物，以2-10倍，优选为4倍体积的纯化水悬浮，维持搅拌。通入H₂S气体维持5分钟。3000-10000rpm/min，优选为7500rpm/min下离心10-30分钟，优选为15分钟。除去沉淀物，留存轻相。通入的H₂S气体包括：纯净H₂S气体，或富含高浓度H₂S成分的工业甲烷废气，或在酸性条件下易产生H₂S的无机和有机盐，如(NH₄)₂S，Na₂S等。

(6)脱色：步骤(5)中轻相用盐酸调节pH值为2.0，按照5‰的比例加入活性炭，维持搅拌反应时间20-60分钟，优选为30分钟。反应完成后，用0.25μm滤膜过滤除去活性炭，留存滤液。

(7)浓缩：步骤(6)中滤液，通过减压浓缩，得到含有500-1000g/L谷胱甘肽浓度的谷胱甘肽溶液，优选浓度为800g/L。

(8)重结晶：维持搅拌，在步骤(7)中含谷胱甘肽溶液中，加入等量体积的50-80％(v/v)浓度的乙醇水溶液，优选70％的乙醇水溶液，在-4-20℃，优选为4℃，添加谷胱甘肽结晶作为晶种。晶种的添加量为20-200mg/L，优选为50mg/L。继续搅拌30分钟后，停止搅拌，维持温度6-20小时，优选为12小时。得结晶浆液，过滤得高纯度还原型谷胱甘肽物质，还原型谷胱甘肽纯度>98％。

本发明将制备出来的还原型谷胱甘肽用于医药试剂、食品和化妆品添加剂。

附图说明

图1是GSH-金属络合物的筛选结果。

图2是酵母细胞90℃下热水(pH 2.0)浸提15分钟后水相HPLC图谱。

图3是酵母浸提液经Cu²⁺络合后轻相HPLC图谱。

图4是GSH-Cu络合物水洗后轻相HPLC图谱。

图5是络合物解络合后轻相HPLC图谱。

图6是络合物解络合后轻相经冻干后所得成分¹H NMR图谱(400MHz,D₂O)。

图7是络合物解络合后轻相经冻干后所得成分¹³C NMR图谱(400MHz,D₂O)。

图8是重结晶后所得成分¹H NMR图谱(400MHz,D₂O)。

图9是重结晶后所得成分¹³C NMR图谱(400MHz,D₂O)。

图10是还原型GSH粗产品与重结晶产品外观，其中，左上角是纯度>98％的重结晶产品，右方是纯度>90％的粗产品。

具体实施方式

实施例1

(1)酵母细胞中GSH的提取

称取酵母乳100.0g，加纯水900mL，用盐酸调节pH值为2.0，90℃水浴浸提15min，再搅拌5min，迅速至于冰浴中冷却至室温。以7500r/min离心15min，留存上清液。

(2)GSH-Cu络合物的制备

上述步骤中的酵母提取液400mL，用NaOH调节pH值为6.0，按GSH与CuSO₄·5H₂O摩尔质量比为1:15加入CuSO₄·5H₂O进行络合，维持搅拌，以7500r/min离心30min，得沉淀约500mg。

(3)洗涤

将上述步骤中的沉淀水洗3次，以150倍体积的纯化水悬浮，维持搅拌30分钟后，7500rpm/min下离心30分钟。留存重相。

(4)解络合

将上述步骤中水洗后的沉淀，加入2L水悬浮，通入H₂S气体，维持搅拌5分钟，7500rpm/min下离心15分钟。除去沉淀物，留存轻相。利用分光光度计检测OD600值为0.022。利用HPLC技术对水相进行定性、定量分析，还原型谷胱甘肽纯度为90.5％。

(5)脱色

将上述步骤中轻相用盐酸调节pH值为2.0，按照5‰的比例加入活性炭，维持搅拌反应时间30分钟。反应完成后，用0.25μm滤膜过滤除去活性炭，留存滤液。利用分光光度计检测OD600值为0.002，脱色效果显著。还原型谷胱甘肽绝对含量未发生显著变化，还原型谷胱甘肽纯度为89.4％。

(6)浓缩

将上述步骤中的水相通过减压浓缩，得到浓度为800g/L的谷胱甘肽溶液。

(7)重结晶

维持搅拌，在上述步骤中含谷胱甘肽溶液中，加入等量体积的70％(v/v)浓度的乙醇水溶液，在4℃，添加谷胱甘肽结晶作为晶种。晶种的添加量为50mg/L。继续搅拌30分钟后，停止搅拌，维持温度12小时。得结晶浆液，过滤得高纯度还原型谷胱甘肽物质。还原型谷胱甘肽纯度为98.5％。

图1是GSH-金属络合物的筛选结果。图中显示Cu²⁺与GSH形成白色络合物沉淀，而KMnO₄对GSH发生了氧化作用，生成褐色氧化产物。

图4是GSH-Cu络合物水洗后轻相HPLC图谱。图中显示经过2次洗涤后绝大部分水溶性杂质被洗脱掉，且洗脱液中未检出还原型GSH。

图5是络合物解络合后轻相HPLC图谱(还原型谷胱甘肽纯度>90％，低峰线是还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽标准品混合样)。