一种温敏水凝胶及其制备方法与流程

本发明属于水凝胶技术领域，尤其涉及一种包含表皮干细胞条件培养基的温敏水凝胶及其制备方法。

背景技术：

表皮干细胞(epidermal stem cell,EpSCs)位于皮肤表皮基底层，是人体最大的干细胞库。在没有毛发的部位EpSCs位于真皮乳头顶部相连的基底层；有毛发的皮肤则位于表皮的基底层。EpSCs的表面标志物包括整合素、核蛋白P63和角蛋白等。皮肤EpSCs具有以下优点：取材损伤性小；细胞易于分离；短期内能够大量扩增。在组织工程中用于构建皮肤替代物^[5]，在医疗美容方面，也可用于抗衰老皮肤再生。在皮肤损伤修复中，EpSCs可以主动迁移参与创面修复，也可以通过分泌多种细胞因子促进伤口愈合。目前已发现EpSCs可分泌数十种与创伤修复过程密切相关的生长因子，其中较为重要的有血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、转化生长因子-β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF)和白介素-1/6/8等，可促进角质形成细胞及成纤维细胞增殖，刺激表皮增生，并维持局部免疫微环境；但细胞因子在液态环境中半衰期短，如何稳定并延长其生物学功能成为难点。

潮湿环境可以给烧烫伤的创面提供足够的水分，有利于细胞因子等水溶性物质的释放和发挥作用，使伤口疼痛减轻、炎症扩散消退、渗出物减少、减少创面微生物生长，并能防止神经末梢外露和死亡，减少更换敷料时对伤口表面的损伤；有利于吞噬细胞发挥其吞噬功能，其中水凝胶敷料适用于各种类型的烧伤创面，可以有效缓解疼痛，加速伤口愈合速度。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种温敏水凝胶，其既能延长细胞因子在液态环境中的半衰期，稳定并延长其生物学功能，又可以给烧烫伤的创面提供足够的水分，有利于细胞因子等水溶性物质的释放和发挥作用，进而促进伤口修复。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种温敏水凝胶，所述温敏水凝胶的原料包含细胞因子活性稳定剂、表皮干细胞条件培养基和胶原蛋白交联液。

本发明所述温敏水凝胶很好地满足了两个利于皮肤创面修复的条件：首先，本发明独创性地将细胞因子稳定剂加入到表皮干细胞(epidermal stem cell,EpSCs)条件培养基中，稳定EpSCs分泌的多种细胞因子，延长其半衰期，这些细胞因子对创伤修复起关键作用，它们可通过介导和调控皮肤损伤修复过程中的血管化、纤维化、细胞外基质的分泌和再上皮化等过程，从而促进创面新生血管的形成、肉芽组织的形成、再上皮化及附件的再生，进而促进伤口愈合；再者，温敏水凝胶是指具有温敏特性，可以随着环境温度改变而在液态和固态之间相互转变，即可以在较低温度下制备成液态水凝胶，通过注射或涂抹的方法将其施于病患部位，后由于温度升高(体温)而转换为固态，在原位成胶。因此，本发明所述温敏水凝胶具有操作简单、塑型随意、原位成胶等优点，可以充分的覆盖创面，与创面紧密贴合，防止创面水分蒸发，可以有效地维持伤口处的湿润环境。

优选的，所述温敏水凝胶，所述细胞因子活性稳定剂、表皮干细胞条件培养基和胶原蛋白交联液的体积比为：1:2:1。

优选的，所述细胞因子活性稳定剂由组分A和组分B组成，所述组分A包含壳聚糖、甘露醇、聚乙二醇、透明质酸和海藻酸钠，所述组分B包含β-甘油磷酸钠和人白蛋白。

优选的，所述组分A中，壳聚糖的浓度为1.5～2.5％(W/V)，甘露醇的浓度为0.1～0.5％(W/V)、聚乙二醇的浓度为0.5～1％(W/V)，透明质酸的浓度为0.5～1％(W/V)，海藻酸钠的浓度为3～5％(W/V)。若无特别说明，本文中涉及的溶液中物质的浓度(W/V)的计算公式为：(物质的质量/溶液的体积)×100％，其中物质的质量/溶液的体积的单位为g/m³或mg/L；例如，此处的壳聚糖的浓度是通过(壳聚糖的质量/组分A的体积)×100％得到的。

优选的，所述组分B中，所述人白蛋白的浓度为0.5～1％(W/V)，所述β-甘油磷酸钠的浓度为40～60％(W/V)。

优选的，所述组分A中的壳聚糖的浓度为2％(W/V)，甘露醇的浓度为0.25％(W/V)，聚乙二醇的浓度为1％(W/V)，透明质酸的浓度为0.5％(W/V)，海藻酸钠的浓度为4％(W/V)。

优选的，所述透明质酸的分子量为120-140万。透明质酸，又称玻尿酸(HA)，广泛存在于人皮肤、关节液及眼玻璃体中，可减少手术并发症并促进伤口愈合用，可形成透气薄膜。

优选的，所述细胞因子活性稳定剂通过在冰浴条件下将所述组分A与组分B按体积比4～7：1的比例充分混合制得。

优选的，所述细胞因子活性稳定剂通过在冰浴条件下将所述组分A与组分B按体积比5：1的比例充分混合制得。

优选的，所述组分A的制备方法为：(1)向0.1mol/L的盐酸溶液中加入壳聚糖粉末，得到壳聚糖溶液，其中所述壳聚糖的浓度为1.5～2.5％(W/V)；(2)向步骤(1)所得的壳聚糖溶液中加入甘露醇、聚乙二醇、透明质酸和海藻酸钠，其中所述甘露醇的终浓度为0.1～0.5％(W/V)、聚乙二醇的终浓度为0.5～1％(W/V)、透明质酸的终浓度为0.1～0.5％(W/V)、海藻酸钠的终浓度为3～5％(W/V)；(3)使用1M的NaOH水溶液调整pH值为6～6.5，高压蒸汽灭菌，即为所述组分A。

优选的，所述组分B的制备方法为：将β-甘油磷酸钠粉末溶于三蒸水中，其中所述β-甘油磷酸钠的终浓度为40～60％(W/V)，然后加入人白蛋白，所述人白蛋白的终浓度为0.5～1％(W/V)，最后经0.22μm滤网过滤除菌，即为所述组分B。

优选的，所述组分B中人白蛋白的浓度为0.75％(W/V)。

优选的，所述表皮干细胞条件培养基的制备方法为：首先分离皮肤样本表皮部分，利用0.25％胰蛋白酶溶液消化表皮，然后加入表皮干细胞培养基培养，则第3～5代的表皮干细胞培养基即为表皮干细胞条件培养基。

优选的，所述表皮干细胞培养基为：采用K-SFM培养基作为基础培养基，其中加入人表皮生长因子，使其终浓度为5-20ng/ml；加入成纤维细胞生长因子和类胰岛素生长因子-1，使其终浓度均为1.5-5ng/ml；加入牛垂体提取物，使其终浓度为20-40μg/ml；加入CaCl₂，使其终浓度为0.01～0.1mM；加入氢化可的松，使其终浓度为0.2～1μg/mL；加入青霉素和链霉素，使其终浓度均为50～150U/ml。

优选的，所述表皮干细胞条件培养基的制备方法具体为：

a.清洗及表皮分离：将新鲜手术取下的正常人皮片用含有100U/mL青霉素和链霉素的生理盐水冲洗8～10次，剪成约5mm×5mm的皮片，去除皮下脂肪组织后将分离表皮和真皮，得到表皮组织后，再次剪成1mm×1mm的碎片；

b.表皮的胰酶消化及培养：将表皮组织加入0.25％胰蛋白酶-PBS溶液消化15～-30min，加入EpSCs原代培养基终止消化，吹打后100μm滤网过滤；滤液经1000r/min离心10min，细胞沉淀加入EpSCs原代培养基制成2～4×10⁵个/ml的单细胞悬液，接种于预包被IV型胶原的培养皿中，37℃静置10min；吸弃未贴壁细胞，用PBS轻柔漂洗培养皿一次，再次加入EpSCs原代培养基，置37℃，5％CO₂和100％湿度的黑暗环境培养；3日后更换为EpSCs继代培养基，继续培养，每3～4天更换新鲜EpSCs继代培养基一次，

c.表皮干细胞条件培养基的制备：待贴壁细胞生长融合率达到80～90％时，用0.25％胰蛋白酶-0.1％EDTA/PBS溶液消化，按照1：4的比例传代，传到第3-5代可用于检测或制备条件培养基：待表皮干细胞贴壁生长融合率达到70～80％时，全量换液为新鲜的EpSCs继代培养基，24～36h后收集培养基，3000r/min离心30min去除细胞碎片，0.22μm滤膜过滤除菌后备用。

优选的，所述步骤b中的EpSCs原代培养基的制备方法为：向K-SFM培养基中加入人表皮生长因子(EGF)，使其终浓度为10ng/ml；加入成纤维细胞生长因子(FGF)和类胰岛素生长因子-1(IGF-1)，使其终浓度均为2ng/ml；加入牛垂体提取物(BPE)，使其终浓度为30μg/ml；加入CaCl₂，使其终浓度为0.05mM；加入氢化可的松，使其终浓度为0.5μg/mL；加入青-链霉素，使其终浓度均为100U/ml。

优选的，所述步骤b和步骤c中的EpSCs继代培养基的制备方法为：向K-SFM培养基中加入人表皮生长因子(EGF)，使其终浓度为2ng/ml；加入牛垂体提取物(BPE)，使其终浓度为20μg/ml；加入CaCl₂，使其终浓度为0.05mM；加入氢化可的松，使其终浓度为0.5μg/mL；加入青-链霉素，使其终浓度均为100U/ml。

优选的，所述步骤b中预包被IV型胶原的培养皿采用如下方法制备：IV型胶原溶于0.1％的醋酸溶液至终浓度为100mg/L，滤过除菌，4℃保存备用；将配制好的IV型胶原溶液2ml铺于25cm²培养瓶中，6孔板每孔使用30ul包被。将包被好的培养板置4℃过夜，弃上清，使用无菌PBS漂洗3次，去除多余胶原，4℃干燥箱烘干，紫外线照射过夜，得到预包被IV型胶原的培养皿。

优选的，所述胶原蛋白交联液包含胶原蛋白和水，其中胶原蛋白的浓度为0.5～2mg/mL。

优选的，所述胶原蛋白为人脐带胶原蛋白。人脐带胶原蛋白(CO)是脐带结缔组织的主要成分，具有来源广泛、细胞亲和力高、胶联度可控及可降解性等优点。

优选的，所述胶原蛋白的浓度为1mg/mL。

优选的，所述胶原蛋白交联液的制备方法为：在冰水浴中，将胶原蛋白粉末溶于三蒸水中配制胶原蛋白交联液，所述胶原蛋白终浓度为0.5～2mg/mL，pH值为7.0～7.2，经0.22μm滤网过滤除菌，即得所述胶原蛋白交联液。

另外，本发明提供一种所述温敏水凝胶的制备方法，所述方法包括以下步骤：将所述细胞因子活性稳定剂、表皮干细胞条件培养基和胶原蛋白交联液在冰浴搅拌条件下混合，即得所述温敏水凝胶。

具体地，所述温敏水凝胶的制备方法包括以下步骤：

a.清洗及表皮分离：将新鲜手术取下的正常人皮片用含有100U/mL青霉素和链霉素的生理盐水冲洗8～10次，剪成约5mm×5mm的皮片，去除皮下脂肪组织后将分离表皮和真皮，得到表皮组织后，再次剪成1mm×1mm的碎片。

b.表皮的胰酶消化及培养：将表皮组织加入0.25％胰蛋白酶-PBS溶液消化15～30min，加入EpSCs原代培养基终止消化，吹打后100μm滤网过滤。滤液经1000r/min离心10min，细胞沉淀加入EpSCs原代培养基制成2～4×10⁵个/ml的单细胞悬液，接种于预包被IV型胶原的培养皿中，37℃静置10min；吸弃未贴壁细胞，用PBS轻柔漂洗培养皿一次，再次加入EpSCs原代培养基，置37℃，5％CO₂和100％湿度的黑暗环境培养；3日后更换为EpSCs继代培养基，继续培养，每3～4天更换新鲜EpSCs继代培养基一次。

c.表皮干细胞条件培养基的制备：待贴壁细胞生长融合率达到80～90％时，用0.25％胰蛋白酶-0.1％EDTA/PBS溶液消化，按照1：4的比例传代，传到第3-5代可用于检测或制备条件培养基：待表皮干细胞贴壁生长融合率达到70～80％时，全量换液为新鲜的EpSCs继代培养基，24～36h后收集培养基，3000r/min离心30min去除细胞碎片，0.22μm滤膜过滤除菌后备用；

d.细胞因子活性稳定剂的配制：将壳聚糖粉末溶解在0.1mol/L的盐酸溶液中，制成1.5～2.5％(W/V)的壳聚糖溶液，加入甘露醇粉末使其终浓度为0.1～0.5％，加入聚乙二醇粉末使其终浓度为0.5～1％，加入120-140万分子量的大分子透明质酸使其终浓度为0.5～1％(W/V)，加入海藻酸钠使其终浓度为3～5％(W/V)，最后使用1M的NaOH水溶液调整pH值为6～6.5，高压蒸汽灭菌备用为A液；将β-甘油磷酸钠粉末溶于三蒸水中配成50％(W/V)溶液，再加入人白蛋白溶液使其终浓度为0.5～1％(W/V)，经0.22μm滤网过滤除菌为B液；在冰浴条件下将制备的A液和B液按体积比5：1比例充分混合后得到细胞因子活性稳定剂，

e.胶原蛋白交联液的配制：在冰水浴中，将脐带胶原蛋白粉末溶于三蒸水中配成制备0.5～2mg/mL的脐带胶原蛋白蛋白溶液，调整pH值至7.0～7.2，经0.22μm滤网过滤除菌。

f.在冰浴搅拌条件下，将细胞因子活性稳定剂、表皮干细胞条件培养基与胶原蛋白交联液以1:2:1的体积比混合，制成表皮干细胞条件培养基温敏水凝胶，此水凝胶在37℃温箱放置20分钟即可形成固态的凝胶状。

上述所有操作均在无菌条件下进行。

本发明的有益效果在于：本发明所述温敏水凝胶在37℃放置20分钟即可形成固态的凝胶状，可被机体吸收，消除了揭除敷料时造成的疼痛；可以非特异性免疫反应增强肌体的免疫功能、促进成纤维细胞增殖、利于新生皮肤表观和功能恢复，使伤口得到高质量愈合。另外，本发明所述制备方法具有快速、高效、方法简便、所得温敏水凝胶中细胞因子活性保持好，修复作用强、组织相容性好，具备了应用到临床上的基本条件。

附图说明

图1是本发明实施例1中表皮干细胞形态、表型检测及特征蛋白检测图，其中A为表皮干细胞形态图，B为表皮干细胞和角质形成细胞中CK19和Intergrin-β1蛋白的表达情况，C为角质化细胞中α6-intergrin和CD71蛋白的表达情况，D为表皮干细胞中α6-intergrin和CD71蛋白的表达情况；

图2是本发明实施例2中所制备的温敏水凝胶在25℃与37℃条件下的状态图，其中A为温敏水凝胶在25℃下呈现液态，B为温敏水凝胶在37℃下呈现固态；

图3是本发明实施例3中温敏水凝胶对细胞因子活性保持效果的柱形图；

图4是本发明实施例4中温敏水凝胶对小鼠皮肤烫伤实验治疗愈合效果示意图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例及附图对本发明作进一步说明。

实施例1表皮干细胞EpSCs的分离与培养

实验方法：

1)、将新鲜手术取下的正常人皮片用含有100U/mL青霉素和链霉素的生理盐水冲洗10次，剪成约5mm×5mm的皮片，去除皮下脂肪组织后将分离表皮和真皮，得到表皮组织后，再次剪成1mm×1mm的碎片；

2)、在表皮碎片中加入0.25％胰蛋白酶-PBS溶液消化30min，加入EpSCs原代培养基终止消化，吹打后100μm滤网过滤；滤液经1000r/min离心10min，细胞沉淀加入EpSCs原代培养基(K-SFM培养基，含10ng/ml的EGF、2ng/ml的FGF和IGF-1、30μg/ml的BPE、0.05mM的CaCl₂、0.5μg/mL的氢化可的松，100U/ml的青-链霉素)制成3×10⁵/ml的单细胞悬液，接种于预包被IV型胶原的培养皿中，37℃静置10min；吸弃未贴壁细胞，用PBS轻柔漂洗培养皿一次，再次加入EpSCs原代培养基，置37℃，5％CO2和100％湿度的黑暗环境培养；3日后更换为EpSCs继代培养基(K-SFM培养基，含2ng/ml EGF、20μg/ml BPE、0.05mMCaCl2、0.5μg/mL氢化可的松，100U/ml青-链霉素)，继续培养，每3～4天更换新鲜EpSCs继代培养基一次；

3)、将步骤2)所得细胞用倒置显微镜观察照相，使用流式细胞术检测EpSCs表面标志物α6-intergrin和CD71的表达情况；使用western-blot检测，检测角质形成细胞及表皮干细胞中CK19、intergrin-β1的蛋白水平。

实验结果：镜检结果如图1A所示，可见细胞为扁平多角形，形成小克隆呈铺路石样成片生长，符合EpSC的形态生长特点；western-blot检测结果如图1B所示，显示表皮干细胞中CK19和Intergrin-β1蛋白表达均高于角质形成细胞(keratinocyte)；流式细胞术检测结果如图1C和图1D所示，证明表皮干细胞高表达EpSC标志物α6-intergrin，低表达角质化细胞标志物CD71。

实施例2温敏水凝胶的制备

(1)、表皮干细胞条件培养基的制备：取培养第4代生长良好的EpSC贴壁细胞，待其融合率达到70～80％时，全量换液为新鲜的EpSCs继代培养基，24～36h后收集培养基，3000r/min离心30min去除细胞碎片，0.22μm滤膜过滤除菌后备用，为EpSC条件培养基；

(2)、细胞因子活性稳定剂的制备：将壳聚糖粉末溶解在0.1mol/L的盐酸溶液中，制成2％(W/V)的壳聚糖溶液，再加入甘露醇粉末使其终浓度为0.25％，再加入聚乙二醇粉末使其终浓度为1％，再加入120-140万分子量的大分子透明质酸使其终浓度为0.5％(W/V)，再加入海藻酸钠使其终浓度为4％(W/V)，最后使用1M的NaOH水溶液调整pH值为6.15，高压蒸汽灭菌备用为A液；将β-甘油磷酸钠粉末溶于三蒸水中配成50％(W/W)溶液，再加入40％的人白蛋白溶液使其终浓度为0.75％(W/V)，经0.22μm滤网过滤除菌为B液；在冰浴条件下将制备的A液和B液按体积比5：1比例充分混合后得到细胞因子活性稳定剂；

(3)、胶原蛋白交联液的制备：在冰水浴中，将脐带胶原蛋白粉末溶于三蒸水中配成制备1mg/mL的脐带胶原蛋白蛋白溶液，调整pH值至7.2，经0.22μm滤网过滤除菌；

(4)、在冰浴搅拌条件下，将表皮干细胞条件培养基、细胞因子活性稳定剂、胶原蛋白交联液以1:2:1的体积比混合，即得温敏水凝胶。

本发明所述温敏水凝胶在37℃温箱放置20分钟即可形成固态的凝胶状，其结果如图2所示，温敏水凝胶在25℃下呈现液态(图2A)，在37℃下呈现固态(图2B)。

实施例3温敏水凝胶对细胞因子活性保持效果

(1)、将实施例2所得温敏水凝胶置于4℃环境中，分别于第0、7、14、21天取一份，挤压得浸出液，采用ELISA法检测VEGF、EGF、IGF-1的含量；

(2)、将实施例2步骤(1)中得到的EpSC条件培养基稀释一倍，置于4℃环境中，分别于第0、7、14、21天取一份，采用ELISA法检测VEGF、EGF、IGF-1的含量；

检测结果如图3所示，可见与条件培养基相比，本发明所述温敏水凝胶能在21天期间内，更好地保持细胞因子VEGF、EGF、IGF-1的浓度。

实施例4温敏水凝胶对小鼠皮肤烫伤实验治疗愈合效果

实验方法：首先构建小鼠深II度皮肤烫伤模型，每只老鼠烫伤腹部左右两侧(如图4)，将采用本发明实施例2所述方法制备的温敏水凝胶每天均匀地涂于老鼠烫伤表面的右侧部分作为实验组，以表皮干细胞条件培养基涂于老鼠烫伤表面的左侧部分作为对照组，每天涂抹一次，连续7天；然后分别于烫伤后7、14、21、28天检测两组伤口愈合情况，同时做第14天皮肤组织的Ki-67染色观察创面及创缘组织学变化。

实验结果：结果发现，如图4A所示，实验组创口愈合时间明显短于对照组，且伤口恢复更为整洁，瘢痕增生较少；切片显示较对照组相比，实验组创面表皮层和真皮层组织结构完整，损伤更少，棕色阳性信号的旺盛增殖细胞排列较对照组更加有序，如图4B。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质。