本发明涉及生物医用材料领域，具体是指一种自组装蛋白质多层膜制备方法。
背景技术：
层层自组装技术是一种有效制备薄膜的方法，可适用于多种材料的组装，操作简单，易于控制。其中聚电解质层层自组装技术是通过将基底在阴阳离子聚电解质溶液中交替浸泡，从而在基底表面制备聚电解质薄膜。自组装过程的结合力主要包括共价键，配位键 ，电荷转移，氢键和静电引力等形式的作用力。层层自组装技术可以实现在玻璃，钛合金，陶瓷,石英，单晶硅片，云母，金，银，氧化铝以及聚合物等底上的组装，并且基底形状不受限制。
随着组织工程的发展 ,组装工程材料表面的生物相容性的改善已成为生物医用材料研究的一个关键问题 。而层层自组装由于具有温和的组装条件,对生物分子和基材的广泛适应性及其能在纳米和亚微米尺度设计的可调性等优点 ,已经越来越多地被应用于组织工程材料的表面改性中。目前，层层自组装技术得到了很大发展，制备自组装膜的聚合物也从聚电解质扩展到蛋白质，DNA，染料分子，纳米颗粒，胶束等等。通过层层自组装技术把蛋白质直接固定在材料表面,使材料的细胞相容性明显提高, 这类研究已成为生物材料研究中的热点 。
采用人为的方式形成材料-蛋白质复合层,改善细胞在材料表面的吸附及生长性能, 是一种简单有效的方法。静电引力作用的自组装物质需带电荷，限制了蛋白膜自组装过程对材料的选择。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种自组装蛋白质多层膜制备方法,本发明利用植物多酚和蛋白质分子间的氢键作用，采用层层自组装的方法，制备多种具有生物活性的多层蛋白膜。
为实现上述目的，本发明的技术方案是包括如下步骤：
（1） 自组装膜的基材预处理
将基材进行表面处理后，浸入到浓度为0.01～100mg/mL的阳离子聚电解质溶液中自组装形成底层；
（2）植物多酚水溶液的配制
在缓冲溶液中，调节pH值1-14，依次加入氯化钠，抗坏血酸和植物多酚，搅拌至完全溶解，配置成浓度为0.01～100mg/mL的植物多酚水溶液；
（3）蛋白质水溶液的配制
在缓冲溶液中，调节pH值1-14，依次加入氯化钠，抗坏血酸和蛋白质，搅拌至完全溶解，配置成浓度为0.01～100mg/mL的蛋白质水溶液；
（4） 自组装多层膜的制备
把经过步骤（1）处理基材浸入到经过步骤（2）制备的植物多酚的水溶液中，平衡吸附后用步骤（2）中缓冲溶液洗去游离的植物多酚，再浸入到经过步骤（3）制备的蛋白质水溶液中，平衡吸附后用步骤（3）中缓冲溶液洗去游离的蛋白质，利用植物多酚与蛋白质通过氢键作用进行层层自组装；
（5）多次循环操作步骤（4），得到自组装蛋白质多层膜。。
进一步设置是阳离子聚电解质为聚乙烯亚胺(PEI)或聚烯丙胺盐酸盐(PAH)。
进一步设置是所述的蛋白质为胰蛋白酶，所述缓冲溶液为1~100mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液或1~100mM醋酸-醋酸钠缓冲液或1~100mMHEPES缓冲溶液的一种。
进一步设置是基材为陶瓷、镍合金、镁合金、钛合金、不锈钢、石英片、玻璃片、金、银、氧化铝中的任一种。
进一步设置是植物多酚为单宁酸、咖啡酸、鸡纳酸、茶多酚、儿茶素，葡萄籽多酚、仙鹤素、地榆素、玫瑰素、老鹳草素、云实素、柯子酸，月见草素、虾子花素、石榴素或山茱萸素中的任一种。
进一步设置是蛋白质为明胶、胶原蛋白、血红蛋白、白蛋白、免疫球蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白、丝素蛋白、溶菌酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、纤溶酶、凝血酶、菠萝酶、木瓜蛋白酶、氨基肽酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶、胰凝乳蛋白酶、霉菌蛋白酶、细菌蛋白酶、植物蛋白酶、弹性蛋白酶、酸性碱性中性蛋白酶、胶原酶、组织蛋白酶、链霉蛋白酶、热溶素、激肽释放酶、无花果蛋白酶、内肽酶、外肽酶、肠激酶、半胱氨酸蛋白酶、钙蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、透明质酸酶、几丁质酶、淀粉酶、脂肪酶、过氧化氢酶或酪氨酸激酶中一种或多种组合。
进一步设置是所述的还原剂为抗坏血酸，浓度为1~100mM。
进一步设置是所述的氯化钠浓度为0~1mol/L。
本发明采用植物多酚和蛋白质的分子间强氢键作用作为沉积过程的推动力。该自组装膜的主体部分没有使用聚阳离子，可以有效减少传统自组装膜中多层聚阳离子对细胞所产生的伤害。该多层膜主要由植物多酚和蛋白质构成，生物相容性好，可以显著促进人体细胞的黏附、生长与增殖。将该自组装多层膜装饰在人体植入材料表面，能显著提高植入材料的生物相容性，应用前景十分广阔。
本发明的创新机理是：
因为氢键层层自组装没有电荷的限制，所以可以通过氢键作用对多种蛋白质进行组装，极大丰富了蛋白质膜的种类。植物多酚分子中具有大量酚羟基和多种蛋白质分子中的酰胺键 可以形成稳定的氢键作用。自组装多层膜中蛋白质提供细胞识别位点，可以显著地促进细胞的粘附和生长。在生理环境条件下 ,该层层组装的蛋白质多层膜具有良好的稳定性和生物相容性，且方法简单易行，条件温和，符合环保要求。本发明的蛋白膜可用于植入材料和器件的生物界面构建，提高医用植入体的生物活性。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍。
附图说明
图1 本发明实施例1（单宁酸和溶菌酶）的QCM测试图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
本实施例包括如下步骤：
（1） 自组装膜的基材预处理
将玻璃进行表面处理后，浸入到浓度为0.01mg/mL的聚乙烯亚胺溶液中自组装形成底层；
（2）植物多酚水溶液的配制
配置10mM的HEPES缓冲液10ml，pH=8，依次加入抗坏血酸至1mM和单宁酸（TA）至0.01mg/ml，搅拌至完全溶解，配置成浓度0.01mg/mL的单宁酸水溶液；
（3）蛋白质水溶液的配制
配置10mM的HEPES缓冲液10ml，调节pH至8，，依次加入1mM至抗坏血酸和溶菌酶至0.01mg/ml，搅拌至完全溶解，配置成浓度为0.01mg/mL的溶菌酶水溶液；
（4） 自组装多层膜的制备
把经过步骤（1）处理基材浸入到经过步骤（2）制备的单宁酸的水溶液中，平衡吸附后用步骤（2）中缓冲溶液洗去游离的植物多酚，再浸入到经过步骤（3）制备的蛋白质水溶液中，平衡吸附后用步骤（3）中缓冲溶液洗去游离的蛋白质，利用单宁酸与溶菌酶通过氢键作用进行层层自组装，如此循环4次，得到自组装蛋白质多层膜。
如图1可知，单宁酸和溶菌酶可以进行连续组装，形成蛋白质多层膜。
实施例2
本实施例包括如下步骤：
（1） 自组装膜的基材预处理
将玻璃进行表面处理后，浸入到浓度为1mg/mL的聚乙烯亚胺溶液中自组装形成底层；
（2）植物多酚水溶液的配制
配置50mM的HEPES缓冲液，pH=8，依次加入氯化钠至0.15mol/l，抗坏血酸至50mM和单宁酸（TA）至1mg/mL，搅拌至完全溶解，配置成浓度1mg/mL的单宁酸水溶液；
（3）蛋白质水溶液的配制
配置50mM的HEPES缓冲液，pH=8，依次加入氯化钠至0.15mol/l，抗坏血酸至50mM和溶菌酶至1mg/mL，搅拌至完全溶解，配置成浓度为1mg/mL的溶菌酶水溶液；
（4） 自组装多层膜的制备
把经过步骤（1）处理基材浸入到经过步骤（2）制备的单宁酸的水溶液中，平衡吸附后用步骤（2）中缓冲溶液洗去游离的单宁酸，再浸入到经过步骤（3）制备的蛋白质水溶液中，平衡吸附后用步骤（3）中缓冲溶液洗去游离的蛋白质，利用单宁酸与溶菌酶通过氢键作用进行层层自组装，如此循环4次，得到自组装蛋白质多层膜。
实施例3
本实施例包括如下步骤：
（1） 自组装膜的基材预处理
将玻璃进行表面处理后，浸入到浓度为100mg/mL的聚乙烯亚胺溶液中自组装形成底层；
（2）单宁酸水溶液的配制
配置100mM的HEPES缓冲液，pH=8，依次加入氯化钠至1mol/l，抗坏血酸至100mM和单宁酸（TA）至100mg/ml，搅拌至完全溶解，配置成浓度100mg/mL的单宁酸水溶液；
（3）溶菌酶水溶液的配制
配置100mM的HEPES缓冲液，pH=8，依次加入氯化钠至1mol/l，抗坏血酸至100mM和溶菌酶至100mg/ml，搅拌至完全溶解，配置成浓度为100mg/mL的溶菌酶水溶液；
（4） 自组装多层膜的制备
把经过步骤（1）处理基材浸入到经过步骤（2）制备的单宁酸的水溶液中，平衡吸附后用步骤（2）中缓冲溶液洗去游离的植物多酚，再浸入到经过步骤（3）制备的溶菌酶水溶液中，平衡吸附后用步骤（3）中缓冲溶液洗去游离的溶菌酶，利用单宁酸与溶菌酶通过氢键作用进行层层自组装，如此循环4次，得到自组装蛋白质多层膜。
实施例4
本实施例包括如下步骤：
（1） 自组装膜的基材预处理
将玻璃进行表面处理后，浸入到浓度为0.01mg/mL的聚乙烯亚胺溶液中自组装形成底层；
（2）植物多酚水溶液的配制
配置10mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液，pH=8，依次加入抗坏血酸至1mM和单宁酸（TA）至0.01mg/ml，搅拌至完全溶解，配置成浓度0.01mg/mL的单宁酸水溶液；
（3）蛋白质水溶液的配制
配置10mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液， pH=8，，依次加入抗坏血酸至1mM和溶菌酶至0.01mg/ml，搅拌至完全溶解，配置成浓度为0.01mg/mL的溶菌酶水溶液；
（4） 自组装多层膜的制备
把经过步骤（1）处理基材浸入到经过步骤（2）制备的单宁酸的水溶液中，平衡吸附后用步骤（2）中缓冲溶液洗去游离的植物多酚，再浸入到经过步骤（3）制备的蛋白质水溶液中，平衡吸附后用步骤（3）中缓冲溶液洗去游离的蛋白质，利用单宁酸与溶菌酶通过氢键作用进行层层自组装，如此循环4次，得到自组装蛋白质多层膜。
如图1可知，单宁酸和溶菌酶可以进行连续组装，形成蛋白质多层膜。
实施例5
本实施例包括如下步骤：
（1） 自组装膜的基材预处理
将玻璃进行表面处理后，浸入到浓度为1mg/mL的聚乙烯亚胺溶液中自组装形成底层；
（2）植物多酚水溶液的配制
配置50mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液，pH=11，依次加入氯化钠至0.15mol/l，抗坏血酸至50mM和单宁酸（TA）至1mg/mL，搅拌至完全溶解，配置成浓度1mg/mL的单宁酸水溶液；
（3）蛋白质水溶液的配制
配置50mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液，pH=11，依次加入氯化钠至0.15mol/l，抗坏血酸至50mM和溶菌酶至1mg/mL，搅拌至完全溶解，配置成浓度为1mg/mL的溶菌酶水溶液；
（4） 自组装多层膜的制备
把经过步骤（1）处理基材浸入到经过步骤（2）制备的单宁酸的水溶液中，平衡吸附后用步骤（2）中缓冲溶液洗去游离的单宁酸，再浸入到经过步骤（3）制备的蛋白质水溶液中，平衡吸附后用步骤（3）中缓冲溶液洗去游离的蛋白质，利用单宁酸与溶菌酶通过氢键作用进行层层自组装，如此循环50次，得到自组装蛋白质多层膜。
实施例6
本实施例包括如下步骤：
（1） 自组装膜的基材预处理
将玻璃进行表面处理后，浸入到浓度为100mg/mL的聚乙烯亚胺溶液中自组装形成底层；
（2）单宁酸水溶液的配制
配置100mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液，pH=14，依次加入氯化钠至1mol/l，抗坏血酸至100mM和单宁酸（TA）至100mg/ml，搅拌至完全溶解，配置成浓度100mg/mL的单宁酸水溶液；
（3）溶菌酶水溶液的配制
配置100mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液，pH=14，依次加入氯化钠至1mol/l，抗坏血酸至100mM和溶菌酶至100mg/ml，搅拌至完全溶解，配置成浓度为100mg/mL的溶菌酶水溶液；
（4） 自组装多层膜的制备
把经过步骤（1）处理基材浸入到经过步骤（2）制备的单宁酸的水溶液中，平衡吸附后用步骤（2）中缓冲溶液洗去游离的植物多酚，再浸入到经过步骤（3）制备的溶菌酶水溶液中，平衡吸附后用步骤（3）中缓冲溶液洗去游离的溶菌酶，利用单宁酸与溶菌酶通过氢键作用进行层层自组装，如此循环100次，得到自组装蛋白质多层膜。
其他实施例
其制备步骤参见上述实施例，该实施例的参数为，参见下表：