吴茱萸内酯和升麻素组合物在制备除皱抗皱产品中的应用的制作方法

本发明属于中药及化妆品领域，涉及化合物吴茱萸内酯和升麻素的新用途，具体公开了吴茱萸内酯和升麻素及其组合物促进皮肤胶原蛋白合成及用于除皱抗皱抗衰老的化妆品中的应用。

背景技术：

衰老是生物生命过程中的必然规律，皮肤衰老则是人体衰老过程中最为明显的表现之一，如皮肤干燥、弹性消退、松弛粗糙、皱纹产生以及色斑形成等现象。皮肤的健康与其真皮层中大量致密有序的胶原网状结构密切相关，真皮中胶原蛋白的含量高达80％，其中i型胶原蛋白为主。胶原蛋白会随着年龄的增长而逐渐流失，皮肤的水分减少，弹性变差，真皮结构的改变是皮肤松弛、皱纹产生和衰老的主要原因。胶原蛋白流失的原因之一便是皮肤细胞自身合成的胶原蛋白减少，因此提高皮肤中胶原蛋白的含量，对皮肤抗皱、抗衰老，恢复皮肤弹性具有重要意义。

目前市场上很多抗皱产品里直接添加胶原蛋白，但由于胶原蛋白的分子量比较大，皮肤细胞吸收会受到很大限制，也有添加胶原蛋白短肽的，效果良莠不齐，同时胶原蛋白在外用化妆品的使用过程中还存在变性变质的风险。因此如何有效抗皱、延缓皮肤衰老，仍然具有很大的现实价值。

吴茱萸内酯(evodine)，也叫柠檬苦素，主要存在于芸香科植物的籽或果实中，分子量为470.51，分子式是c26h30o8，结构式如(i)所示。现已发现其具有较强的生理活性，如抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等，但是关于其在皮肤抗皱、抗衰老等方面还没有报道。

升麻素(cimifugin)，属于色原酮类，可以从伞形科植物防风中提取出来，其分子量306.31，分子式为c16h18o6，结构式如(ii)所示。现发现其具有抗肿瘤活性，同时具有抗氧化功能，在皮肤抗皱抗衰老等美容化妆品方面的作用还未报道。

技术实现要素：

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提出了吴茱萸内酯和升麻素及其组合物在激活皮肤真皮层成纤维细胞，并促进其胶原蛋白合成中的应用，所述吴茱萸内酯和升麻素及其组合物能增加皮肤细胞内胶原蛋白的含量，提高皮肤弹性和保水性，淡化皱纹，并减缓皱纹产生和皮肤衰老进程。所述吴茱萸内酯和升麻素活性成分来源于天然中草药。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

本发明提出了一种组合物，所述组合物包含具有除皱抗皱功效的全天然植物单体吴茱萸内酯和升麻素；所述吴茱萸内酯和升麻素占组合物的质量比为0.2～15:1；优选地为，5:27、5:12、5:7、10:9、5:3、5:2、35:9、20:3、15:1。

其中，所述全天然植物单体吴茱萸内酯和升麻素均为粉末状；所述全天然植物单体吴茱萸内酯和升麻素可以溶于水或化妆品基质中。

所述组合物可以作为天然活性成分添加到化妆品基质中，所述化妆品为皮肤外用化妆品。

本发明利用构建的人i型胶原蛋白启动子调控序列的双荧光素报告基因质粒，通过转染到宿主细胞后检测荧光素酶的活性的方法，筛选并验证了在细胞转录水平能明显上调i型胶原蛋白含量的活性物质，首次发现吴茱萸内酯和升麻素及其组合物在促进人皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成方面的作用。本发明首次公开吴茱萸内酯和升麻素组合物在皮肤除皱抗皱、延缓衰老方面的作用。

本发明还提出了所述组合物在激活皮肤真皮层成纤维细胞，促进其胶原蛋白合成，以及制备除皱抗皱、延缓衰老产品中的应用；所述组合物中吴茱萸内酯和升麻素能协同刺激皮肤成纤维细胞中胶原蛋白的合成，可作为除皱抗皱、延缓衰老的有效成分添加于外用化妆品中。

所述组合物可以采用任何适用于皮肤的剂型，如可以制成具有防皱除皱或增强皮肤弹性的霜剂、乳液、面膜、爽肤水、护肤水、软膏、油剂、凝胶、气雾剂、溶液剂、或涂膜剂等各类使用剂型。上述各种类型的化妆品可以按照化妆品领域的常规方法制备。化妆品添加剂的形式使用。

本发明还提出了吴茱萸内酯在激活皮肤真皮层成纤维细胞，促进其胶原蛋白合成，以及制备除皱抗皱、延缓衰老产品中的应用。其中，所述吴茱萸内酯的浓度为50μg/ml时，效果最好。

本发明还提出了升麻素在激活皮肤真皮层成纤维细胞，促进其胶原蛋白合成，以及制备除皱抗皱、延缓衰老产品中的应用。其中，所述升麻素的浓度为30μg/ml时，效果最好。

其中，所述胶原蛋白由真皮层成纤维细胞合成。

本发明还提出了一种除皱抗皱、延缓皮肤衰老化妆品，如上所述的组合物占所述化妆品的质量百分比范围为0.002％～1.5％；余量为化妆品基质。

优选地为，本发明的除皱抗皱、延缓皮肤衰老化妆品中，如上所述的组合物占所述化妆品的质量百分比范围为0.2％；余量为化妆品基质。

本发明还提出了一种除皱抗皱、延缓皮肤衰老化妆品，吴茱萸内酯和升麻素占所述化妆品的质量百分比分别为：吴茱萸内酯0.001％～0.75％，升麻素0.001％～0.75％；余量为化妆品基质。优选地，所述化妆品，吴茱萸内酯和升麻素占所述化妆品的质量百分比分别为：吴茱萸内酯0.125％，升麻素0.075％；余量为化妆品基质。

其中，所述化妆品基质为6％甘油，5％矿油，4％棕榈酸异丙酯，3.5％辛酸/癸酸甘油三酯，2％硬脂醇聚醚-2，2％硬脂醇聚醚-21，1.5％鲸蜡硬脂醇，1％聚丙烯酸酯-13/聚异丁烯/聚山梨醇酯-20，0.8％甘油硬脂酸酯，0.2％尿囊素，0.2％羟苯甲酯，0.15％双(羟甲基)咪唑烷基脲，0.1％羟苯丙酯，0.05％edta二钠，其余为水。

本发明的有益效果在于，所述吴茱萸内酯和升麻素及其组合物能够显著促进人皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成，吴茱萸内酯和升麻素在组合物中能协同刺激皮肤成纤维细胞中胶原蛋白的合成，可以用于制备除皱抗皱、延缓衰老产品，或作为除皱抗皱、延缓衰老的有效成分添加于外用化妆品中。

附图说明

图1是吴茱萸内酯对人皮肤成纤维细胞活性的影响。

图2是升麻素对人皮肤成纤维细胞活性的影响。

图3是实施例2各组药物对皮肤成纤维细胞luciferase实验结果。

图4是实施例2各组药物对皮肤成纤维细胞luciferase实验结果。

图5是实施例2各组药物对皮肤成纤维细胞luciferase实验结果。

图6是各组药物对人皮肤成纤维细胞i型胶原蛋白转录水平的影响。

图7是各组药物对人皮肤成纤维细胞iii型胶原蛋白转录水平的影响。

图8是各组药物对人皮肤成纤维细胞i型胶原蛋白合成的影响。

图9是各组药物对人皮肤成纤维细胞iii型胶原蛋白合成的影响。

图10是吴茱萸内酯、升麻素不同配比组合物对细胞i型胶原蛋白含量的影响。

图11是吴茱萸内酯、升麻素不同配比组合物对细胞iii型胶原蛋白含量的影响。

图12是各组药物对裸鼠皮肤弹性的影响。

图13是各组药物对裸鼠皮肤含水量的影响。

图14是各组药物对裸鼠皮肤组织中i型胶原蛋白含量的影响。

图15是各组药物对裸鼠皮肤组织中iii型胶原蛋白含量的影响。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1.吴茱萸内酯和升麻素对人皮肤成纤维细胞活性的影响。

将生长良好的人皮肤成纤维细胞接种于96孔细胞培养板，每孔2.5*10⁴个细胞，体积为100μl，培养过夜后弃原有培养基，分别加入纯dmem稀释的吴茱萸内酯、升麻素100μl，吴茱萸内酯、升麻素的浓度分别为0μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、300μg/ml。24h后加入mts(美国麦迪逊promega)，置于细胞培养箱中30min后，酶标仪检测其在490nm下的吸光值。结果如图1和图2所示，当吴茱萸内酯和升麻素的浓度分别等于或低于150μg/ml时，均不会对细胞活性产生影响。

实施例2.luciferase实验模型筛选药物。

为了评价本发明吴茱萸内酯、升麻素及其组合物的除皱抗皱功效，及其吴茱萸内酯和升麻素的协同作用，利用吴茱萸内酯、升麻素以及两者组合物进行了如下双荧光素酶报告基因试验。其中，吴茱萸内酯和升麻素单体均购自上海诗丹德有限公司。

将人皮肤成纤维细胞接种于24孔板，每孔1.5*10⁵个细胞，体积为500μl，对数生长期内贴壁后转染i型胶原蛋白启动子质粒与内参质粒，24h后将培养基换成500μl分别含有不同浓度(0、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml)吴茱萸内酯、升麻素的dmem培养基，每组3个复孔，给药12h后用化学发光仪检测荧光素酶的活性，实验结果如图3和4所示，表明吴茱萸内酯的最佳浓度为50μg/ml，升麻素为30μg/ml。

同样地，将人皮肤成纤维细胞接种于24孔板，每孔1.5*10⁵个细胞，体积为500μl，贴壁后转染i型胶原蛋白启动子质粒与内参质粒，24h后将培养基换成500μl带有吴茱萸内酯、升麻素以及两者组合物的纯dmem培养基，每组3个复孔，浓度为上述实验中所得最佳浓度吴茱萸内酯50μg/ml，升麻素30μg/ml，组合物中的吴茱萸内酯和升麻素的浓度分别是各自的50％，即吴茱萸内酯25μg/ml、升麻素15μg/ml。12h后用化学发光仪检测荧光素酶的活性，实验结果表明吴茱萸内酯、升麻素以及两者组合物均能明显上调i型胶原蛋白启动子在转录水平的含量，结果如图5所示，与对照组相比，吴茱萸内酯和升麻素均能促进胶原蛋白的合成，两者组合后能协同促进胶原蛋白的合成，差异显著，具有统计学意义，**:p<0.01。

实施例3.药物对人皮肤成纤维细胞ⅰ型胶原蛋白和ⅲ型胶原蛋白转录水平的影响。

在体外培养的人皮肤成纤维细胞以每孔3.5*10⁵个细胞的量接种于12孔板中，每孔1ml培养基。细胞贴壁后换成分别含有吴茱萸内酯50μg/ml、升麻素30μg/ml以及两者组合物(包含25μg/ml吴茱萸内酯以及15μg/ml升麻素)的dmem培养基1ml，，探究吴茱萸内酯、升麻素以及两者组合物对人皮肤成纤维细胞胶原蛋白转录水平的影响，实验结果如图6、图7显示，表明各组药物对人皮肤成纤维细胞ⅰ型胶原蛋白和ⅲ型胶原蛋白mrna水平都明显上升，与对照组比较差异显著，具有统计学意义，*:p<0.05，**:p<0.01。

实施例4.药物对人皮肤成纤维细胞i型胶原蛋白和iii型胶原蛋白含量的影响。

通过细胞elisa实验，检测经过药物处理后，分泌到培养液中的胶原蛋白的含量，从而检验药物对人皮肤成纤维细胞合成胶原蛋白的影响，实验分为三组，12孔板中以每孔3.5*10⁵个细胞的量接种，贴壁后分别换成1ml含有吴茱萸内酯50μg/ml、升麻素30μg/ml以及两者组合物(包含25μg/ml的吴茱萸内酯以及15μg/ml升麻素)的dmem培养基。图8是吴茱萸内酯、升麻素以及两者组合物对人皮肤成纤维细胞合成i型胶原蛋白的影响，其中，与对照组比较，*:p<0.05，**:p<0.01，***:p<0.001。从图8可以看出，与对照组相比，加入了50μg/ml吴茱萸内酯、30μg/ml升麻素的实验组，细胞培养液中的i型胶原蛋白含量显著提高；加入两者组合物的实验组，细胞培养液中的i型胶原蛋白含量极显著提高(p<0.001)。图9是吴茱萸内酯、升麻素以及两者组合物对人皮肤成纤维细胞合成iii型胶原蛋白的影响，其中，与对照组相比，加入了50μg/ml吴茱萸内酯、30μg/ml升麻素的实验组，iii型胶原蛋白的含量显著提高(*:p<0.05)；加入两者组合物的实验组，细胞培养液中的iii型胶原蛋白含量提高明显，具有更显著的统计学意义(**:p<0.01)。

实施例5.吴茱萸内酯、升麻素不同配比组合物对细胞i型胶原蛋白和iii型胶原蛋白含量的影响。

通过细胞elisa实验，实验过程基本同实施例3，其中对照组药物浓度为0，将吴茱萸内酯50μg/ml浓度和升麻素30μg/ml浓度分别看做百分百，药物组合物质量配比分别为1:9(即5μg/ml吴茱萸内酯和27μg/ml升麻素，标记为组合物1)、2:8(即10μg/ml吴茱萸内酯和24μg/ml升麻素，标记为组合物2)、3:7(即15μg/ml吴茱萸内酯和21μg/ml升麻素，标记为组合物3)、4:6(即20μg/ml吴茱萸内酯和18μg/ml升麻素，标记为组合物4)、5:5(即25μg/ml吴茱萸内酯和15μg/ml升麻素，标记为组合物5)、6:4(即30μg/ml吴茱萸内酯和12μg/ml升麻素，标记为组合物6)、7:3(即35μg/ml吴茱萸内酯和9μg/ml升麻素，标记为组合物7)、8:2(即40μg/ml吴茱萸内酯和6μg/ml升麻素，标记为组合物8)、9:1(即45μg/ml吴茱萸内酯和3μg/ml升麻素，标记为组合物9)。图10是吴茱萸内酯和升麻素不同比例组合物对人皮肤成纤维细胞合成i型胶原蛋白的影响，与对照组比较各组细胞培养液中的i型胶原蛋白表达提高，差异具有统计学意义，其中组合物5的p值小于0.05，其余组合物的p值小于0.01，其中组合物5，质量配比5:5(即25μg/ml吴茱萸内酯和15μg/ml升麻素)的效果最为明显。图11吴茱萸内酯和升麻素不同比例组合物对人皮肤成纤维细胞合成iii型胶原蛋白的影响，结果类似于对i型胶原蛋白的影响，当吴茱萸内酯和升麻素比例为5:5(即25μg/ml吴茱萸内酯和15μg/ml升麻素)时iii型胶原蛋白含量最多。

实施例6.各组药物对裸鼠皮肤弹性和含水量的影响。

为了评价本发明除皱抗皱功效，将吴茱萸内酯和升麻素及其组合物制成如下膏霜，同时按相同方法制得空白对照样品。

本实施例的具有除皱抗皱功效的植物单体组合物，按质量百分数计算，根据以下组份配制。药物添加浓度为细胞使用浓度的50倍。

本实施例将质量百分比为0.25％吴茱萸内酯、0.15％升麻素、含质量百分比为0.075％吴茱萸内酯和0.105％升麻素的组合物i(质量配比3:7，计算方法参照实施例5)、含质量百分比为0.125％吴茱萸内酯和0.075％升麻素的组合物ii(质量配比5:5，计算方法参照实施例5)、含质量百分比为0.2％吴茱萸内酯和0.03％升麻素的组合物iii(质量配比8:2，计算方法参照实施例5)制成化妆品膏剂，基础配方成分比例为(质量百分比)：0.05％edta二钠，0.2％尿囊素，6％甘油，5％矿油，0.8％甘油硬脂酸酯，4％棕榈酸异丙酯，3.5％辛酸/癸酸甘油三酯，2％硬脂醇聚醚-2，2％硬脂醇聚醚-21，0.2％羟苯甲酯，0.1％羟苯丙酯，1.5％鲸蜡硬脂醇，1％聚丙烯酸酯-13/聚异丁烯/聚山梨醇酯-20，0.15％双(羟甲基)咪唑烷基脲，其余为水(以上质量百分比均为占所化妆品膏剂总质量的百分比)。

原料均为市售产品，吴茱萸内酯和升麻素单体均购自上海诗丹德有限公司。

本实施方式配制的膏霜涂布均匀、手感细腻、易吸收，并进行裸鼠皮肤弹性及含水量测试、裸鼠皮肤组织胶原蛋白免疫组化实验。

选用6周龄的雌性balb/c裸鼠20只(购自上海斯莱克动物有限公司，spf级)喂养于无菌鼠笼内，饲喂无菌的标准饲料和生理盐水，定期更换鼠笼。实验前适应性预饲养3天，对裸鼠的所有操作均在超净工作台上进行。实验分为五组，每组4只裸鼠，第一组为吴茱萸内酯组，第二组为升麻素组，第三组为吴茱萸内酯和升麻素组合物i组，第四组吴茱萸内酯和升麻素组合物ii组，第五组吴茱萸内酯和升麻素组合物iii组，在裸鼠背部皮肤的右半边涂抹膏霜空白样品，左半边的背部皮肤只涂抹含有药物的各组膏霜。每天早晚各涂一次，持续6周。6周后用皮肤弹性水分测试仪(cutometermpa580，德国)分别测量裸鼠背部左右两侧皮肤的弹性和含水量，实验结果如图12所示，各组药物均对裸鼠皮肤弹性有明显的增加，与自身对照组比较，差异显著。实验结果表明吴茱萸内酯和升麻素组合物对小鼠皮肤的弹性作用更明显，显著更差异，均具有统计学意义，*:p<0.05。

各药物处理实验组与对照组比较，小鼠皮肤的含水量也有明显的提高，见图13，各组药物对裸鼠皮肤含水量也有明显的影响，与自身对照组比较，差异具有显著性统计学差异，组合物ii的p值小于0.001，其余组p值小于0.01。

实施例7.各组药物对裸鼠皮肤中胶原蛋白含量的影响。

在经过6周的动物皮肤给药处理后，提取每组裸鼠背部左右皮肤组织匀浆，用elisa方法检测各组小鼠皮肤组织中i、iii型胶原蛋白的含量。结果见图14，图15。吴茱萸内酯组、升麻素组、组合物i组、组合物ii组及组合物iii组(各实验组与实施例6中相同)与自身对照相比，都极显著地提高i、iii型胶原蛋白的含量，具有统计学意义，***:p<0.001。

实施例8.各药物组对人体皮肤的实验效果。

为了评价本发明除皱抗皱功效，将吴茱萸内酯、升麻素及其组合物膏霜进行人体皮肤试验。选择30名各年龄段志愿者，男女各半，平均分成三组，每组各5名男士、5名女士。志愿者每天早晚清洁手臂后，将空白膏霜以及组合物膏霜分别涂于左右前臂内侧指定位置，并避免水洗，6周后用皮肤弹性水分测试仪(cutometermpa580，德国)来检测皮肤弹性及含水量。结果发现，a组为涂抹吴茱萸内酯组、b组为涂抹升麻素组、c组为涂抹吴茱萸内酯和升麻素的组合物膏霜组，三组中男士及女士均没有出现皮肤过敏症状，与对照组比较，涂抹吴茱萸内酯、升麻素和两者组合物膏霜后皮肤弹性以及含水量均明显增加，如(表1)所示，差异显著，具有统计学意义，其中，只涂抹吴茱萸内酯、升麻素组的p<0.05；涂抹吴茱萸内酯和升麻素的组合物的膏霜组p<0.01。

表1药物对人体皮肤弹性和水分的影响

注：与对照组比较，*:p<0.05，**:p<0.01。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。