一种预防和治疗肝组织损伤及其相关病症的方法与流程

文档序号：12687414阅读：559来源：国知局

本发明涉及纤溶酶原或纤溶酶在预防和/或治疗各种原因导致的肝组织损伤方面的用途，进而为治疗肝组织损伤及其相关病症提供全新的治疗策略。

背景

肝损伤或称肝组织损伤是各种原因导致的肝脏实质病变，是肝组织炎症、肝脏细胞变性、坏死、肝组织纤维化等一系列病理变化的总称。常见的原因有炎症、肝脏淤血、病毒感染、中毒、药物、辐射等。一些疾病也伴发肝脏组织细胞的损伤，例如糖尿病、肝炎、高血压、动脉粥样硬化等。

药物是引起肝组织损害的一个非常常见的原因。引起肝脏组织损害的常用药物包括：抗结核药物：利福平、异烟肼、乙胺丁醇等；抗肿瘤药物：环磷酰胺、甲氨叠呤、5-氟尿嘧啶、卡铂、顺铂等；调降血脂类：他汀类(阿托伐他汀、洛伐他汀)、非诺贝特、氯贝丁酯、烟酸等；类固醇激素：雌激素类药物、口服避孕药、雄性同化激素等；心血管药物：胺碘酮、华法令、钙离子拮抗剂等；抗风湿药物：消炎痛、芬布芬、阿司匹林、吲哚美辛等；抗生素：氯霉素、罗红霉素、酮康唑、青霉素类、磺胺类等；抗过敏药物：异丙嗪(非那根)、氯苯那敏(扑尔敏)、氯雷他定(开瑞坦)等；抗溃疡药物：西咪替丁、雷尼替丁、法莫替丁等；抗真菌的药物例如利巴韦林等等。

酒精是肝脏的巨大威胁，长期或间断性大量饮酒可引起肝组织损伤，饮酒量大、持续饮用时间越长，其后果越严重。酒精会直接毒害肝细胞，影响其结构及功能。

酒精性肝损伤是一种慢性中毒性肝损伤，是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病。初期通常表现为脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化。其主要临床特征是恶心、呕吐、黄疸、可有肝脏肿大和压痛。严重酗酒时可诱发广泛肝细胞坏死，甚至肝功能衰竭。酒精性肝病是我国常见的肝脏疾病之一，严重危害人民健康^[1]。

除了酒精导致的中毒性肝损伤外，其它"亲肝毒物"，例如环境中的化学有毒物质及某些药物也可造成肝损伤。作为人体的重要解毒器官，肝脏，具有肝动脉和肝静脉双重血液供应。化学物质可通过胃肠道门静脉或体循环进入肝脏进行转化，因此肝脏容易受到化学物中的毒性物质损害。大自然和人类工业生产过程中均存在一些对肝脏有毒性的物质，称为"亲肝毒物"，这些毒物在人群中普遍易感，潜伏期短，病变的过程与化学物质的量直接相关，可引起肝脏不同程度的肝细胞坏死、脂肪变性、肝硬化。病理表现包括(1)脂肪变性。四氯化碳、黄磷等可干扰脂蛋白的合成与转运，形成脂肪肝。(2)脂质过氧化反应，这是中毒性肝损伤的特殊表现形式，如四氯化碳在体内代谢产生一种氧化能力很强的中间产物，导致生物膜上的脂质过氧化，破坏膜的磷脂，改变细胞的结构与功能。(3)胆汁郁积反应，主要与肝细胞膜和微绒毛受损，引起胆汁酸排泄障碍有关^[2]。

辐射也可以导致肝脏组织损伤。一般来说，辐射源是天然或人工能源产生的高能电磁波或高能粒子。大剂量射线瞬间照射或低剂量射线长时间照射都可能引起组织损伤，辐射的能量破坏细胞的染色体、酶，使细胞的正常功能发生紊乱。

糖尿病性肝组织损伤是指由糖尿病引起的肝脏组织学和功能变化的病变。已知糖尿病可引起的肝损伤包括：肝酶学异常，其可引起肝细胞内二氧化碳蓄积、酸中毒、氧供减少、氧消耗增加，使肝脏转氨酶活性增加，胆红素代谢紊乱，重者可引起肝细胞坏死；脂肪肝，在引起脂肪肝的所有病因中，糖尿病占第三位，其中21％～78％糖尿病患者伴有脂肪肝；肝炎、硬化和肝癌，其中糖尿病患者中病毒性肝炎的患病率约为正常人的2～4倍，原发性肝癌的发生率约为正常人的4倍。糖尿病性肝病不仅损害数以百万计的患者的生活质量，同时也造成一个巨大的负担成本和医疗保健系统强度所需的护理。

肝脏的病毒感染也是导致肝损伤的一个常见原因，例如乙型病毒性肝炎、丙型病毒肝炎、戊型病毒肝炎等。

肝内血液淤积也可以造成肝脏组织损伤。血液在肝内淤积主要由以下几种因素引起：肝小静脉闭塞病、巴德一基亚利综合征、慢性右心功能不全和缩窄性心包炎。

任何导致下腔静脉血回心受阻的疾病都可导致肝脏淤血，如风湿性心脏瓣膜病，慢性缩窄性心包炎，高血压性心脏病，缺血性心脏病，肺心病，先天性心脏病等。

淤血性肝损伤最初累及小叶中央区，小叶中央静脉淤血，扩张，肝窦扩张程度与肝窦距小叶中央静脉的远近而有所不同，小叶中央肝细胞受压，变形和萎缩，细胞浆内呈颗粒样变，有核固缩，核分裂，细胞坏死，伴有棕色色素沉着，棕色色素位于小叶中央，可能因淤胆所致，邻近中央静脉的肝实质变性坏死最严重，随淤血的加重，坏死组织向门区延伸，严重淤血患者仅在门区有较正常的肝组织，随时间延长，中央静脉周围的网状纤维可塌陷，可见网状纤维组织和细纤维束自中央静脉延伸到另一中央静脉。

对于肝组织损伤的治疗目前主要包括病因的控制和治疗，以及支持治疗。长期以来，科学家们一直在寻找对损伤肝组织有直接的、良好修复效果的药物。本发明对此也进行了深入的研究。实验发现，人体内天然存在的一种蛋白质物质，纤溶酶原对中毒、辐射、化疗药物和糖尿病导致的肝组织损伤有良好的修复作用。纤溶酶原有望成为治疗肝组织损伤及其相关病症的一种新策略。

纤溶酶原(plasminogen，plg)是纤溶酶的非活性前体，是一种单链糖蛋白，由791个氨基酸组成，分子量约为92kDa^[3,^4]。纤溶酶原主要在肝脏合成，大量存在于胞外液中。血浆中纤溶酶原含量约为2μM。因此纤溶酶原是组织和体液中蛋白质水解活性的一个巨大的潜在来源^[5,^6]。纤溶酶原存在两种分子形式：谷氨酸-纤溶酶原(Glu-plasminogen)和赖氨酸-纤溶酶原(Lys-plasminogen)。天然分泌和未裂解形式的纤溶酶原具有一个氨基末端(N-末端)谷氨酸，因此被称为谷氨酸-纤溶酶原。然而，在纤溶酶存在时，谷氨酸-纤溶酶原在Lys76-Lys77处水解成为赖氨酸-纤溶酶原。与谷氨酸-纤溶酶原相比，赖氨酸-纤溶酶原与纤维蛋白具有更高的亲和力，并可以更高的速率被PA激活。这两种形式的纤溶酶原的Arg560-Val561肽键可被uPA或tPA切割，导致二硫键连接的双链蛋白酶纤溶酶的形成^[7]。纤溶酶原的氨基末端部分包含五个同源三环，即所谓的kringle，羧基末端部分包含蛋白酶结构域。一些kringle含有介导纤溶酶原与纤维蛋白及其抑制剂α2-AP特异性相互作用的赖氨酸结合位点。最新发现一个为38kDa的纤维蛋白溶酶原片段，其中包括kringle1-4，是血管生成的有效抑制剂。这个片段被命名为血管抑素，可通过几个蛋白酶水解纤溶酶原产生。

发明简述

一方面，本发明涉及纤溶酶原或纤溶酶在制备预防和/或治疗受试者肝组织损伤及其相关病症的药物、制品、药盒中的用途。本发明还涉及一种制药方法，包括将纤溶酶原与药学可接受载体共同制备成预防和/或治疗受试者肝组织损伤及其相关病症的药物、制品、药盒。

在一个实施方案中，所述肝组织损伤及其相关病症为辐射或化学物质引起的肝损伤及其相关病症。在一个实施方案中，辐射或化学物质引起的肝损伤及其相关病症为癌症治疗所使用的放化疗方法和药物。在一个实施方案中，所述辐射是由于意外事件或工作环境等其他事件导致的辐射。在一个实施方案中，所述肝组织损伤及其相关病症为中毒性肝损伤及其相关病症。在一个实施方案中，所述中毒性肝损伤为包括酒精在内的"亲肝毒物"造成的中毒性肝损伤。在一个实施方案中，所述肝组织损伤及其相关病症为糖尿病引起的，是糖尿病的并发症之一。在一个实施方案中，所述肝组织损伤及其相关病症为病毒感染肝脏导致的肝炎所致，例如甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒导致的肝炎。在一个实施方案中，所述肝组织损伤及其相关病症为药物性肝损伤及其相关病症。在一个实施方案中，所述肝组织损伤及其相关病症是肝内血液淤积(肝脏淤血)导致的。在一个实施方案中，所述肝组织损伤及其相关病症为糖尿病性肝损伤及其相关病症、中毒性肝损伤及其相关病症、药物性肝损伤或其相关病症、辐射性肝损伤及其相关病症、病毒感染性肝损伤及其相关病症、淤血性肝损伤及其相关病症。在一个实施方案中，所述肝组织损伤及其相关病症包括肝组织损伤导致的肝功能异常、肝酶学异常、肝区不适和触痛、肝肿大、脾肿大、肝脾肿大、肝炎、脂肪肝、胆管炎、肝硬化、肝坏死和肝癌。

在一个实施方案，所述纤维蛋白溶酶原与序列2、6、8、10或12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纤维蛋白溶酶原活性。在一个实施方案，所述纤维蛋白溶酶原是包含纤溶酶原活性片段、并且仍然具有纤维蛋白溶酶原活性的蛋白质。

在一个实施方案，所述纤溶酶原选自Glu-纤维蛋白溶酶原、Lys-纤维蛋白溶酶原、小纤维蛋白溶酶原、微纤维蛋白溶酶原、δ-纤溶酶原或其任意组合。在一个实施方案，所述纤溶酶原或纤溶酶全身或局部施用，包括表面、静脉内、肌内、皮下、吸入、椎管内、局部注射、关节内注射或直肠施用。在一个实施方案，所述糖尿病性肝损伤的相关病症或中毒性肝损伤的相关病症包括：肝酶学异常、肝区不适和触痛、肝肿大、脾肿大、肝脾肿大、肝炎、脂肪肝、胆管炎、肝硬化、肝坏死和肝癌。在一个实施方案，所述糖尿病性肝损伤及其相关病症是由糖尿病引起的大血管、小血管、微血管病变导致。在一个实施方案，所述纤溶酶原可与一种或多种其它药物联合施用。在一个实施方案，所述其它药物包括：保肝药物、抗糖尿病药物、抗血栓药物、抗凝药物、降血脂药物、抗心脑血管疾病药物、抗感染药物。

在一个实施方案，所述所述受试者为哺乳动物，优选为人。

在一个实施方案中，所述由糖尿病引起的肝损伤是由糖尿病引起的大血管、小血管、微血管病变导致。

在一个实施方案中，所述受试者纤维蛋白溶酶或者纤溶酶原低下。具体地，所述低下是先天的、继发的和/或局部的。

在一个实施方案中，纤维蛋白溶酶原与序列2、6、8、10或12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纤维蛋白溶酶原活性。在一个实施方案中，纤维蛋白溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基础上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1个氨基酸，并且仍然具有纤维蛋白溶酶原活性的蛋白质。在一个实施方案中，纤溶酶原是包含纤溶酶原活性片段、并且仍然具有纤维蛋白溶酶原活性的蛋白质。在一个实施方案中，纤溶酶原选自Glu-纤维蛋白溶酶原、Lys-纤维蛋白溶酶原、小纤维蛋白溶酶原、微纤维蛋白溶酶原、δ-纤溶酶原或其任意组合。在一个实施方案中，纤溶酶原是选自如下的保守取代变体：Glu-纤维蛋白溶酶原、Lys-纤维蛋白溶酶原、小纤维蛋白溶酶原、δ-纤溶酶原或微纤维蛋白溶酶原。在一个实施方案中，纤维蛋白溶酶原为人天然纤维蛋白溶酶原，例如序列2所示的纤溶酶原的直向同系物，例如，来自灵长类动物或啮齿类动物的纤维蛋白溶酶原直向同系物，例如来自大猩猩、恒河猴、鼠、牛、马，狗的纤维蛋白溶酶原直向同系物。最优选，本发明的纤维蛋白溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。

在一个实施方案中，所述纤溶酶原与适当的多肽载体或稳定剂组合施用。在一个实施方案中，所述纤溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤体重计算)或0.0001-2000mg/cm²、0.001-800mg/cm²、0.01-600mg/cm²、0.1-400mg/cm²、1-200mg/cm²、1-100mg/cm²、10-100mg/cm²(以每平方厘米体表面积计算)的剂量施用，优选至少重复一次，优选至少每天施用。在局部施用的情况下，上述剂量还可以根据情况进一步调整。

在一个实施方案中，所述纤溶酶原通过全身或局部给药，优选通过以下途径施用：表面、静脉内、肌内、皮下、吸入、椎管内、局部注射、关节内注射或通过直肠。在一个实施方案中，所述局部给药通过在肝部区域应用含有纤溶酶原的导管来进行。

一方面，本发明涉及一种预防和/或治疗受试者肝组织损伤及其相关病症的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原或纤溶酶。本发明还涉及纤溶酶原或纤溶酶用于预防和/或治疗受试者肝组织损伤及其相关病症的用途。

在一个实施方案中，所述肝组织损伤及其相关病症为辐射或化学物质引起的肝损伤及其相关病症。在一个实施方案中，辐射或化学物质引起的肝损伤及其相关病症为癌症治疗所使用的放化疗方法和药物。在一个实施方案中，所述辐射是由于意外事件导致的辐射。在一个实施方案中，所述肝组织损伤及其相关病症为中毒性肝损伤及其相关病症。在一个实施方案中，所述中毒性肝损伤为包括酒精在内的"亲肝毒物"造成的中毒性肝损伤。在一个实施方案中，所述肝组织损伤及其相关病症为糖尿病引起的，是糖尿病的并发症之一。在一个实施方案中，所述肝组织损伤及其相关病症为病毒感染肝脏导致的肝炎所致，例如甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒导致的肝炎。在一个实施方案中，所述肝组织损伤及其相关病症为药物性肝损伤及其相关病症。在一个实施方案中，所述肝组织损伤及其相关病症是肝内血液淤积(肝脏淤血)导致的。在一个实施方案中，所述肝组织损伤及其相关病症为糖尿病性肝损伤及其相关病症、中毒性肝损伤及其相关病症、药物性肝损伤或其相关病症、辐射性肝损伤及其相关病症、病毒感染性肝损伤及其相关病症、淤血性肝损伤及其相关病症。在一个实施方案中，所述肝组织损伤及其相关病症包括肝组织损伤导致的肝功能异常、肝酶学异常、肝区不适和触痛、肝肿大、脾肿大、肝脾肿大、肝炎、脂肪肝、胆管炎、肝硬化、肝坏死和肝癌。

在一个实施方案，所述纤维蛋白溶酶原与序列2、6、8、10或12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纤维蛋白溶酶原活性。在一个实施方案，所述纤维蛋白溶酶原是包含纤溶酶原活性片段、并且仍然具有纤维蛋白溶酶原活性的蛋白质。在一个实施方案，所述纤溶酶原选自Glu-纤维蛋白溶酶原、Lys-纤维蛋白溶酶原、小纤维蛋白溶酶原、微纤维蛋白溶酶原、δ-纤溶酶原或其任意组合。在一个实施方案，所述纤溶酶原或纤溶酶全身或局部施用，包括表面、静脉内、肌内、皮下、吸入、椎管内、局部注射、关节内注射或直肠施用。在一个实施方案，所述糖尿病性肝损伤的相关病症或中毒性肝损伤的相关病症包括：肝酶学异常、肝区不适和触痛、肝肿大、脾肿大、肝脾肿大、肝炎、脂肪肝、胆管炎、肝硬化、肝坏死和肝癌。在一个实施方案，所述糖尿病性肝损伤及其相关病症是由糖尿病引起的大血管、小血管、微血管病变导致。在一个实施方案，所述纤溶酶原可与一种或多种其它药物联合施用。在一个实施方案，所述其它药物包括：保肝药物、抗糖尿病药物、抗血栓药物、抗凝药物、降血脂药物、抗心脑血管疾病药物、抗感染药物。

在一个实施方案，所述受试者为哺乳动物，优选为人。

在一个实施方案中，所述由糖尿病引起的肝损伤是由糖尿病引起的大血管、小血管、微血管病变导致。

在一个实施方案中，所述受试者纤维蛋白溶酶或者纤溶酶原低下。具体地，所述低下是先天的、继发的和/或局部的。

在一个实施方案中，纤维蛋白溶酶原与序列2、6、8、10或12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纤维蛋白溶酶原活性。在一个实施方案中，纤维蛋白溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基础上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1个氨基酸，并且仍然具有纤维蛋白溶酶原活性的蛋白质。在一个实施方案中，纤溶酶原是包含纤溶酶原活性片段、并且仍然具有纤维蛋白溶酶原活性的蛋白质。在一个实施方案中，纤溶酶原选自Glu-纤维蛋白溶酶原、Lys-纤维蛋白溶酶原、小纤维蛋白溶酶原、微纤维蛋白溶酶原、δ-纤溶酶原或其任意组合。在一个实施方案中，纤溶酶原是选自如下的保守取代变体：Glu-纤维蛋白溶酶原、Lys-纤维蛋白溶酶原、小纤维蛋白溶酶原、δ-纤溶酶原或微纤维蛋白溶酶原。在一个实施方案中，纤维蛋白溶酶原为人天然纤维蛋白溶酶原，例如序列2所示的纤溶酶原的直向同系物，例如，来自灵长类动物或啮齿类动物的纤维蛋白溶酶原直向同系物，例如来自大猩猩，恒河猴、鼠、牛、马，狗的纤维蛋白溶酶原直向同系物。最优选，本发明的纤维蛋白溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。

一方面，本发明涉及一种预防和/或治疗受试者肝组织损伤及其相关病症的纤溶酶原或纤溶酶、包含所述纤溶酶原或纤溶酶的药物组合物、或包含所述纤溶酶原或纤溶酶的制品或药盒。

在一个实施方案，所述受试者为哺乳动物，优选为人。

在一个实施方案中，所述由糖尿病引起的肝损伤是由糖尿病引起的大血管、小血管、微血管病变导致。

在一个实施方案中，所述受试者纤维蛋白溶酶或者纤溶酶原低下。具体地，所述低下是先天的、继发的和/或局部的。

在一个实施方案中，纤维蛋白溶酶原与序列2、6、8、10或12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纤维蛋白溶酶原活性。在一个实施方案中，纤维蛋白溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基础上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1个氨基酸，并且仍然具有纤维蛋白溶酶原活性的蛋白质。在一个实施方案中，纤溶酶原是包含纤溶酶原活性片段、并且仍然具有纤维蛋白溶酶原活性的蛋白质。在一个实施方案中，纤溶酶原选自Glu-纤维蛋白溶酶原、Lys-纤维蛋白溶酶原、小纤维蛋白溶酶原、微纤维蛋白溶酶原、δ-纤溶酶原或其任意组合。在一个实施方案中，纤溶酶原是选自如下的保守取代变体：Glu-纤维蛋白溶酶原、Lys-纤维蛋白溶酶原、小纤维蛋白溶酶原、δ-纤溶酶原或微纤维蛋白溶酶原。在一个实施方案中，纤维蛋白溶酶原为人天然纤维蛋白溶酶原，例如序列2所示的纤溶酶原的直向同系物，例如，来自灵长类动物或啮齿类动物的纤维蛋白溶酶原直向同系物，例如来自大猩猩，恒河猴、鼠、牛、马，狗的纤维蛋白溶酶原直向同系物。最优选，本发明的纤维蛋白溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。

在一个实施方案中，所述纤溶酶原或纤溶酶被分装在容器中。优选，该制品或药盒还包含其它的药物，分装在该药盒的其它容器中。该药盒还可包含使用说明书，说明所述纤溶酶原可以用于治疗肝组织损伤及其相关病症，具体的，例如糖尿病引起的糖尿病肝损伤及其相关病症、中毒性肝损伤及其相关病症、药物性肝损伤或其相关病症、辐射导致的肝损伤及其相关病症、病毒感染引起的肝损伤及其相关病症、淤血导致的肝损伤及其相关病症，并且可以进一步说明，所述纤溶酶原或纤溶酶可以在其它药物或疗法施用之前，同时，和/或之后施用。

本发明明确涵盖了属于本发明实施方案之间的技术特征的所有组合，并且这些组合后的技术方案在本申请中已经明确公开，就像上述技术方案已经单独且明确公开一样。另外，本发明还明确涵盖各个实施方案及其要素的所有亚组合，并且在本文中公开，就像每一个此类亚组合单独且明确在本文中公开一样。

发明详述

“糖尿病性肝损伤”是指由糖尿病引起的肝脏组织学和功能变化的病变。其主要由糖尿病引起的大血管、小血管、微血管病变导致。已知糖尿病可引起的肝损伤包括：肝酶学异常，其可引起肝细胞内二氧化碳蓄积、酸中毒、氧供减少、氧消耗增加，使肝脏转氨酶活性增加，胆红素代谢紊乱，重者可引起肝细胞坏死；脂肪肝，在引起脂肪肝的所有病因中，糖尿病占第三位，其中21％～78％糖尿病患者伴有脂肪肝；肝炎、硬化和肝癌，其中糖尿病患者中病毒性肝炎的患病率约为正常人的2～4倍，原发性肝癌的发生率约为正常人的4倍。

“化学性肝损伤”或“中毒性肝损伤”是指由化学性肝毒性物质所造成的肝损害。这些化学物质包括酒精、环境中的化学有毒物质及某些药物。大自然和人类工业生产过程中均存在一些对肝脏有毒性的物质，称为"亲肝毒物"，这些毒物在人群中普遍易感，潜伏期短，病变的过程与化学物质的量直接相关，可引起肝脏不同程度的肝细胞坏死、脂肪变性、肝硬化。

“亲肝毒物”是指对肝脏有毒性的物质的总称。酒精是生活中最常见的“亲肝毒物”。除酒精外，环境中的化学有毒物质及某些药物也可造成肝损伤。作为人体的重要解毒器官，肝脏具有肝动脉和肝静脉双重血液供应。化学物质可通过胃肠道门静脉或体循环进入肝脏进行转化，因此肝脏容易受到化学物中的毒性物质损害。大自然和人类工业生产过程中均存在一些对肝脏有毒性的物质，称为"亲肝毒物"。他们进入肝脏，可引起肝脏不同程度的肝细胞坏死、脂肪变性、肝硬化。病理表现包括(1)脂肪变性。四氯化碳、黄磷等可干扰脂蛋白的合成与转运，形成脂肪肝。(2)脂质过氧化反应，这是中毒性肝损伤的特殊表现形式，如四氯化碳在体内代谢产生一种氧化能力很强的中间产物，导致生物膜上的脂质过氧化，破坏膜的磷脂，改变细胞的结构与功能。(3)胆汁郁积反应，主要与肝细胞膜和微绒毛受损，引起胆汁酸排泄障碍有关。

“药物性肝损伤”为药物使用过程中，因药物本身或/及其代谢产物或由于特殊体质对药物的超敏感性或耐受性降低所导致的肝脏损伤称为药物性肝损伤，亦称药物性肝病，临床上可表现为各种急慢性肝病，轻者停药后可自行恢复，重者可能危及生命、需积极治疗、抢救。“药物性肝损伤”可以发生在以往没有肝病史的健康者或原来就有严重疾病的患者身上；可发生在用药超量时，也可发生在正常用量的情况下。

“辐射性肝损伤”是指高能电离辐射包括α、β粒子、γ射线、χ射线和中子射线导致的一种放射性损伤。大剂量射线瞬间照射或低剂量射线长时间照射都可能引起组织损伤，辐射的能量破坏细胞的染色体、酶，使细胞的正常功能发生紊乱。

“病毒感染性肝损伤”为病毒感染导致的肝损伤总称。所述病毒感染常见有甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒导致的感染。

“淤血性肝损伤”为血液在肝内淤积导致的肝脏组织损伤病变。任何导致下腔静脉血回心受阻的疾病都可导致肝脏淤血，如风湿性心脏瓣膜病，慢性缩窄性心包炎，高血压性心脏病，缺血性心脏病，肺心病，先天性心脏病等。

“纤溶酶原”是纤溶酶的酶原形式，根据swiss prot中的序列，按含有信号肽的天然人源纤溶酶原氨基酸序列(序列4)计算由810个氨基酸组成，分子量约为92kD，主要在肝脏中合成并能够在血液中循环的糖蛋白，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全长的纤溶酶原包含七个结构域：位于C末端的丝氨酸蛋白酶结构域、N末端的Pan Apple(PAp)结构域以及5个Kringle结构域(Kringle1-5)。参照swiss prot中的序列，其信号肽包括残基Met1-Gly19，PAp包括残基Glu20-Val98，Kringle1包括残基Cys103-Cys181，Kringle2包括残基Glu184-Cys262，Kringle3包括残基Cys275-Cys352，Kringle4包括残基Cys377-Cys454，Kringle5包括残基Cys481-Cys560。根据NCBI数据，丝氨酸蛋白酶域包括残基Val581-Arg804。

Glu-纤溶酶原是天然全长的纤溶酶原，由791个氨基酸组成(不含有19个氨基酸的信号肽)，编码该序列的cDNA序列如序列1所示，其氨基酸序列如序列2所示。在体内，还存在一种是从Glu-纤溶酶原的第76-77位氨基酸处水解从而形成的Lys-纤溶酶原，如序列6所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列5所示。Δ-纤溶酶原(δ-plasminogen)是全长纤溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5结构的片段，仅含有Kringle1和丝氨酸蛋白酶域^[8,9]，有文献报道了δ-纤溶酶原的氨基酸序列(序列8)^[9]，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列7。小纤溶酶原(Mini-plasminogen)由Kringle5和丝氨酸蛋白酶域组成，有文献报道其包括残基Val443-Asn791(以不含有信号肽的Glu-纤溶酶原序列的Glu残基为起始氨基酸)^[10]，其氨基酸序列如序列10所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而微纤溶酶原(Micro-plasminogen)仅含有丝氨酸蛋白酶结构域，有文献报道其氨基酸序列包括残基Ala543-Asn791(以不含有信号肽的Glu-纤溶酶原序列的Glu残基为起始氨基酸)^[11]，也有专利文献CN102154253A报道其序列包括残基Lys531-Asn791(以不含有信号肽的Glu-纤溶酶原序列的Glu残基为起始氨基酸)，本专利序列参考专利文献CN102154253A，其氨基酸序列如序列12所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列11所示。

本发明的“纤溶酶”与“纤维蛋白溶酶”、“纤维蛋白溶解酶”可互换使用，含义相同；“纤溶酶原”与“纤维蛋白溶酶原”、“纤维蛋白溶解酶原”可互换使用，含义相同。

本领域技术人员可以理解，本发明纤溶酶原的所有技术方案适用于纤溶酶，因此，本发明描述的技术方案涵盖了纤溶酶原和纤溶酶。

在循环过程中，纤溶酶原采用封闭的非活性构象，但当结合至血栓或细胞表面时，在纤溶酶原激活剂(plasminogen activator，PA)的介导下，其转变为呈开放性构象的活性纤溶酶。具有活性的纤溶酶可进一步将纤维蛋白凝块水解为纤维蛋白降解产物和D-二聚体，进而溶解血栓。其中纤溶酶原的PAp结构域包含维持纤溶酶原处于非活性封闭构象的重要决定簇，而KR结构域则能够与存在于受体和底物上的赖氨酸残基结合。已知多种能够作为纤溶酶原激活剂的酶，包括：组织纤溶酶原激活剂(tPA)、尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)、激肽释放酶和凝血因子XII(哈格曼因子)等。

“纤溶酶原活性片段”是指在纤溶酶原蛋白中，能够与底物中的靶序列结合并发挥蛋白水解功能的活性片段。本发明涉及纤溶酶原的技术方案涵盖了用纤溶酶原活性片段代替纤溶酶原的技术方案。本发明所述的纤溶酶原活性片段为包含纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶域的蛋白质，优选，本发明所述的纤溶酶原活性片段包含序列14、与序列14具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列的蛋白质。因此，本发明所述的纤溶酶原包括含有该纤溶酶原活性片段、并且仍然保持该纤溶酶原活性的蛋白。

目前，对于血液中纤维蛋白溶酶原及其活性测定方法包括：对组织纤维蛋白溶酶原激活剂活性的检测(t-PAA)、血浆组织纤维蛋白溶酶原激活剂抗原的检测(t-PAAg)、对血浆组织纤溶酶原活性的检测(plgA)、血浆组织纤溶酶原抗原的检测(plgAg)、血浆组织纤维蛋白溶酶原激活剂抑制物活性的检测、血浆组织纤维蛋白溶酶原激活剂抑制物抗原的检测、血浆纤维蛋白溶酶-抗纤维蛋白溶酶复合物检测(PAP)。其中最常用的检测方法为发色底物法：向受检血浆中加链激酶(SK)和发色底物，受检血浆中的PLG在SK的作用下，转变成PLM，后者作用于发色底物，随后用分光光度计测定，吸光度增加与纤维蛋白溶酶原活性成正比。此外也可采用免疫化学法、凝胶电泳、免疫比浊法、放射免疫扩散法等对血液中的纤维蛋白溶酶原活性进行测定。

“直系同源物或直系同系物(ortholog)”指不同物种之间的同源物，既包括蛋白同源物也包括DNA同源物，也称为直向同源物、垂直同源物。其具体指不同物种中由同一祖先基因进化而来的蛋白或基因。本发明的纤溶酶原包括人的天然纤溶酶原，还包括来源于不同物种的、具有纤溶酶原活性的纤溶酶原直系同源物或直系同系物。

“保守取代变体”是指其中一个给定的氨基酸残基改变但不改变蛋白质或酶的整体构象和功能，这包括但不限于以相似特性(如酸性，碱性，疏水性，等)的氨基酸取代亲本蛋白质中氨基酸序列中的氨基酸。具有类似性质的氨基酸是众所周知的。例如，精氨酸、组氨酸和赖氨酸是亲水性的碱性氨基酸并可以互换。同样，异亮氨酸是疏水氨基酸，则可被亮氨酸，蛋氨酸或缬氨酸替换。因此，相似功能的两个蛋白或氨基酸序列的相似性可能会不同。例如，基于MEGALIGN算法的70％至99％的相似度(同一性)。“保守取代变体”还包括通过BLAST或FASTA算法确定具有60％以上的氨基酸同一性的多肽或酶，若能达75％以上更好，最好能达85％以上，甚至达90％以上为最佳，并且与天然或亲本蛋白质或酶相比具有相同或基本相似的性质或功能。

“分离的”纤溶酶原是指从其天然环境分离和/或回收的纤溶酶原蛋白。在一些实施方案中，所述纤溶酶原会纯化(1)至大于90％、大于95％、或大于98％的纯度(按重量计)，如通过Lowry法所确定的，例如超过99％(按重量计)，(2)至足以通过使用旋转杯序列分析仪获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至同质性，该同质性是通过使用考马斯蓝或银染在还原性或非还原性条件下的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定的。分离的纤溶酶原也包括通过生物工程技术从重组细胞制备，并通过至少一个纯化步骤分离的纤溶酶原。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遗传编码的和非遗传编码的氨基酸，化学或生物化学修饰的或衍生化的氨基酸，和具有经修饰的肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白，具有异源和同源前导序列(具有或没有N端甲硫氨酸残基)的融合物；等等。

关于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式实现，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能决定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较序列全长实现最大对比需要的任何算法。然而，为了本发明的目的，氨基酸序列同一性百分数值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。

在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：

分数X/Y乘100

其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应当领会，在氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等的情况下，A相对于B的％氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。

如本文中使用的，术语“治疗”和“处理”指获得期望的药理和/或生理效果。所述效果可以是完全或部分预防疾病或其症状，和/或部分或完全治愈疾病和/或其症状，并且包括：(a)预防疾病在受试者体内发生，所述受试者可以具有疾病的素因，但是尚未诊断为具有疾病；(b)抑制疾病，即阻滞其形成；和(c)减轻疾病和/或其症状，即引起疾病和/或其症状消退。

术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，指哺乳动物，包括但不限于鼠(大鼠，小鼠)、非人灵长类、人、犬、猫、有蹄动物(例如马、牛、绵羊、猪、山羊)等。

“治疗有效量”或“有效量”指在对哺乳动物或其它受试者施用以治疗疾病时足以实现对疾病的所述预防和/或治疗的纤溶酶原的量。“治疗有效量”会根据所使用的纤溶酶原、要治疗的受试者的疾病和/或其症状的严重程度以及年龄、体重等而变化。

本发明纤溶酶原的制备

纤溶酶原可以从自然界分离并纯化用于进一步的治疗用途，也可以通过标准的化学肽合成技术来合成。当通过化学合成多肽时，可以经液相或固相进行合成。固相多肽合成(SPPS)(其中将序列的C末端氨基酸附接于不溶性支持物，接着序贯添加序列中剩余的氨基酸)是适合纤溶酶原化学合成的方法。各种形式的SPPS，诸如Fmoc和Boc可用于合成纤溶酶原。用于固相合成的技术描述于Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis；第3-284页于The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.第2卷：Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.,Merrifield,等J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2156(1963)；Stewart等,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984)；和Ganesan A.2006Mini Rev.Med Chem.6:3-10和Camarero JA等2005Protein Pept Lett.12:723-8中。简言之，用其上构建有肽链的功能性单元处理小的不溶性多孔珠。在偶联/去保护的重复循环后，将附接的固相游离N末端胺与单个受N保护的氨基酸单元偶联。然后，将此单元去保护，露出可以与别的氨基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上，之后将其切掉。

可以使用标准重组方法来生产本发明的纤溶酶原。例如，将编码纤溶酶原的核酸插入表达载体中，使其与表达载体中的调控序列可操作连接。表达调控序列包括但不限于启动子(例如天然关联的或异源的启动子)、信号序列、增强子元件、和转录终止序列。表达调控可以是载体中的真核启动子系统，所述载体能够转化或转染真核宿主细胞(例如COS或CHO细胞)。一旦将载体掺入合适的宿主中，在适合于核苷酸序列的高水平表达及纤溶酶原的收集和纯化的条件下维持宿主。

合适的表达载体通常在宿主生物体中作为附加体或作为宿主染色体DNA的整合部分复制。通常，表达载体含有选择标志物(例如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性)以有助于对外源用期望的DNA序列转化的那些细胞进行检测。

大肠杆菌(Escherichia coli)是可以用于克隆主题抗体编码多核苷酸的原核宿主细胞的例子。适合于使用的其它微生物宿主包括杆菌，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和其他肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，诸如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、和各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，也可以生成表达载体，其通常会含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。另外，会存在许多公知的启动子，诸如乳糖启动子系统，色氨酸(trp)启动子系统，β-内酰胺酶启动子系统，或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常会控制表达，任选在操纵基因序列的情况中，并且具有核糖体结合位点序列等，以启动并完成转录和翻译。

其他微生物，诸如酵母也可用于表达。酵母(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))和毕赤酵母(Pichia)是合适的酵母宿主细胞的例子，其中合适的载体根据需要具有表达控制序列(例如启动子)、复制起点、终止序列等。典型的启动子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。诱导型酵母启动于特别包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C、和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。

在微生物外，哺乳动物细胞(例如在体外细胞培养物中培养的哺乳动物细胞)也可以用于表达并生成本发明的纤溶酶原(例如编码主题抗-Tau抗体的多核苷酸)。参见Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、和经转化的B细胞或杂交瘤。用于这些细胞的表达载体可以包含表达控制序列，如复制起点，启动子和增强子(Queen等,Immunol.Rev.89:49(1986))，以及必需的加工信息位点，诸如核糖体结合位点，RNA剪接位点，多聚腺苷酸化位点，和转录终止子序列。合适的表达控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等衍生的启动子。参见Co等,J.Immunol.148:1149(1992)。

一旦合成(化学或重组方式)，可以依照本领域的标准规程，包括硫酸铵沉淀，亲和柱，柱层析，高效液相层析(HPLC)，凝胶电泳等来纯化本发明所述的纤溶酶原。该纤溶酶原是基本上纯的，例如至少约80％至85％纯的，至少约85％至90％纯的，至少约90％至95％纯的，或98％至99％纯的或更纯的，例如不含污染物，所述污染物如细胞碎片，除主题抗体以外的大分子，等等。

药物配制剂

可以通过将具有所需纯度的纤溶酶原与可选的药用载体、赋形剂、或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences,16版，Osol,A.ed.(1980))混合形成冻干制剂或水溶液制备治疗配制剂。可接受的载体、赋形剂、稳定剂在所用剂量及浓度下对受者无毒性，并包括缓冲剂例如磷酸盐，柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；氯化苄烷铵(benzalkonium chloride)，苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量多肽(少于约10个残基)；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成盐反离子如钠；金属复合物(例如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。优选冻干的抗-VEGF抗体配制剂在WO 97/04801中描述，其包含在本文中作为参考。

本发明的配制剂也可含有需治疗的具体病症所需的一种以上的活性化合物，优选活性互补并且相互之间没有副作用的那些。例如，抗高血压的药物、抗心律失常的药物、治疗糖尿病的药物等。

本发明的纤溶酶原可包裹在通过诸如凝聚技术或界面聚合而制备的微胶囊中，例如，可置入在胶质药物传送系统(例如，脂质体，白蛋白微球，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)中或置入粗滴乳状液中的羟甲基纤维素或凝胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中。这些技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。

用于体内给药的本发明的纤溶酶原必需是无菌的。这可以通过在冷冻干燥和重新配制之前或之后通过除菌滤膜过滤而轻易实现。

本发明的纤溶酶原可制备缓释制剂。缓释制剂的适当实例包括具有一定形状且含有糖蛋白的固体疏水聚合物半通透基质，例如膜或微胶囊。缓释基质实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)；Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982))或聚(乙烯醇)、聚交酯(美国专利3773919,EP 58,481)、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22:547(1983))，不可降解的乙烯-乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出处同上)，或可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯组成的可注射的微球体)，以及聚D-(-)-3-羟丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能持续释放分子100天以上，而一些水凝胶释放蛋白的时间却较短。可以根据相关机理来设计使蛋白稳定的合理策略。例如，如果发现凝聚的机理是通过硫代二硫键互换而形成分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制湿度、采用合适的添加剂、和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。

给药和剂量

可以通过不同方式，例如通过静脉内、腹膜内、皮下、颅内、鞘内、动脉内(例如经由颈动脉)、肌内、鼻内、表面或皮内施用或脊髓或脑投递来实现本发明药物组合物的施用。气溶胶制剂如鼻喷雾制剂包含活性剂的纯化的水性或其它溶液及防腐剂和等渗剂。将此类制剂调节至与鼻粘膜相容的pH和等渗状态。

用于胃肠外施用的制备物包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳剂。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯，如油酸乙酯。水性载体包括水、醇性/水性溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物包含氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、或固定油。静脉内媒介物包含液体和营养补充物、电解质补充物，等等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，诸如例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、和惰性气体，等等。

医务人员会基于各种临床因素确定剂量方案。如医学领域中公知的，任一患者的剂量取决于多种因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、要施用的具体化合物、性别、施用次数和路径、总体健康、和同时施用的其它药物。本发明包含纤溶酶原的药物组合物的剂量范围可以例如为每天约0.0001至2000mg/kg，或约0.001至500mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，10mg/kg，50mg/kg等等)受试者体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或50mg/kg体重或在1-50mg/kg的范围，或至少1mg/kg。高于或低于此例示性范围的剂量也涵盖在内，特别是考虑到上述的因素。上述范围中的中间剂量也包含在本发明的范围内。受试者可以每天、隔天、每周或根据通过经验分析确定的任何其它日程表施用此类剂量。例示性的剂量日程表包括连续几天1-10mg/kg。在本发明的药物施用过程中需要实时评估、定期评估糖尿病肝病及其相关病症的治疗效果和安全性。

治疗效力和治疗安全性

本发明的一个实施方案涉及使用纤溶酶原治疗受试者后，对治疗效力和治疗安全性的判断。其中对所述治疗效力的判断方法包括但不限于：1)对受试者肝功能的检查，例如对患者体内酶学水平如血清门冬氨酸氨基转移酶(ALT)、谷丙转氨酶(AST)、总胆红素、直接胆红素、间接胆红素、白蛋白、球蛋白、胆碱酯酶、碱性磷酸酶、转肽酶等水平是否处于正常值范围进行检查，使用本发明中的纤溶酶原对受试者进行治疗后，预期上述肝功能指标将恢复至正常值或得到改善，例如，谷丙转氨酶(ALT)：0～40μ/L、谷草转氨酶(AST)：0～40μ/L、谷氨酰转移酶(GGT)：小于40单位、总胆红素：3.4～20.5μmol/L；2)对受试者凝血酶原时间(PT)和活动度(PTA)进行检查：PT是反映肝脏凝血因子合成功能的重要指标，PTA是PT测定值的常用表示方法，对判断肝病进展和预后有较大价值，其中PTA进行性降至40％以下为肝衰竭的重要诊断标准之一，<20％者提示肝功能不良，使用本发明中的纤溶酶原及其变体对受试者进行治疗后，患者体内PTA的下降预期将得到明显改善；3)影像学检查：包括腹部肝胆脾彩超、CT或核磁，以了解肝损伤恢复程度；4)肿瘤标志物检查，如甲胎蛋白AFP、CA199、AFU等；5)肝组织活检，以判断纤维化及其他损伤的恢复程度。此外，本发明还涉及使用纤溶酶原及其变体对受试者进行治疗过程中和治疗后，所述该治疗方案安全性的判断，包括但不限于对受试者的血清半衰期、治疗半衰期、半数中毒量(TD50)、半数致死量(LD50)进行统计，或对在治疗过程中或治疗后发生的各种不良事件如致敏反应进行观察。

制品或药盒

本发明的一个实施方案涉及一种制品或药盒，其包含可用于治疗由糖尿病引起的肝损伤及其相关病症的的本发明纤溶酶原。所述制品优选包括一个容器，标签或包装插页。适当的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。所述容器含有组合物，所述组合物可有效治疗本发明的疾病或病症并具有无菌入口(例如所述容器可为静脉内溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射针穿透的塞子的)。所述组合物中至少一种活性剂为纤溶酶原/纤溶酶。所述容器上或所附的标签说明所述组合物用于治疗本发明所述由糖尿病引起的肝损伤及其相关病症。所述制品可进一步包含含有可药用缓冲液的第二容器，诸如磷酸盐缓冲的盐水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可进一步包含从商业和使用者角度来看所需的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤物、针和注射器。此外，所述制品包含带有使用说明的包装插页，包括例如指示所述组合物的使用者将纤溶酶原组合物以及治疗伴随的疾病的其它药物给药患者。

附图简述

图1显示24-25周龄的糖尿病小鼠在给予纤溶酶原后体重的变化。

图2显示24-25周龄的糖尿病小鼠在连续15天给药纤溶酶原后肝脏HE染色观察结果。

图3显示24-25周龄的糖尿病小鼠在连续15天给予纤溶酶原后肝脏纤维蛋白免疫染色镜检观察结果。

图4显示24-25周龄的糖尿病小鼠在连续31天给予纤溶酶原后体重变化。

图5显示24-25周龄的糖尿病小鼠在连续31天给予纤溶酶原后肝脏HE染色观察结果。

图6显示24-25周龄的糖尿病小鼠在连续31天给予纤溶酶原后肝脏纤维蛋白免疫染色观察结果。

图7显示24-25周龄的糖尿病小鼠在连续31天给予纤溶酶原后肝F4/80免疫染色观察结果。

图8显示24-25周糖尿病小鼠给予PBS或纤溶酶原31天后血清谷丙转氨酶(ALT)检测结果。

图9显示给予纤溶酶原的第0、2、7天四氯化碳致急性肝损伤小鼠肝脏HE染色观察结果。

图10显示plg^-/-四氯化碳致急性肝损伤小鼠给予纤溶酶原18、24、48小时后肝脏HE染色观察结果。

图11显示plg^-/-四氯化碳致急性肝损伤小鼠给予纤溶酶原18、24、48小时后肝脏纤维蛋白免疫染色观察结果。

图12显示5.0Gy X射线辐射的小鼠纤溶酶原10天后肝脏F4/80免疫染色观察结果。

图13显示10mg/Kg顺铂化疗损伤模型小鼠纤溶酶原7天后肝脏纤维蛋白免疫染色观察结果。

图14显示plg^-/-四氯化碳致急性肝损伤小鼠给予纤溶酶原18、24、48小时及7天后肝脏HE染色观察结果。

实施例

实施例1纤溶酶原对神经损伤后期糖尿病小鼠体重的影响

24-25周龄db/db雄鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组，每各5只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药15天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。在给纤溶酶原第0、4、7、11、16天分别称体重。结果显示给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组在第0、4、7、11、16天体重(图1)无显著差异，说明纤溶酶原对动物体重影响不大。

实施例2纤溶酶原对糖尿病肝损伤晚期肝脏组织损伤的保护作用

HE染色结果显示，给溶媒PBS对照组，肝细胞呈重度脂肪变，脂质沉积，细胞核被挤至边缘，细胞轻度水样变性，肝索紊乱；给纤溶酶原组较之于给溶媒对照组，肝细胞脂肪变性减轻，呈轻度脂肪变，以中度水样变性为主。说明纤溶酶原能促进糖尿病肝损伤的修复。

实施例3纤溶酶原减少糖尿病小鼠肝组织纤维蛋白水平

24-25周龄db/db雄鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组，每各5只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药15天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。在第16天处死小鼠并取肝脏组织在10％中性福尔马林固定液中固定24-48小时。固定后的肝脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为5μm，切片脱蜡复水后水洗1次。以3％双氧水孵育15分钟，水洗2次，每次5分钟。10％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭1小时；时间到后，弃除羊血清液，用PAP笔圈出组织。兔抗小鼠纤维蛋白(原)抗体(Abcam)4℃孵育过夜，TBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，TBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟，然后TBS洗1次。梯度脱水透明并封片，切片在显微镜下200倍下观察。

纤维蛋白原是纤维蛋白的前体，在组织存在损伤的情况下，作为机体对损伤的一种应激反应，纤维蛋白原水解成纤维蛋白^[12-14]。因此可将纤维蛋白原水平作为损伤程度的一个标志。

研究发现，给纤溶酶原组(图3B)与给溶媒PBS对照组(图3A)相比，给纤溶酶原组的小鼠其肝脏组织纤维蛋白的水平降低，说明纤溶酶原具有抑制纤维蛋白水平沉积的功能，损伤得到一定程度的修复。

实施例4纤溶酶原对糖尿病小鼠体重的影响

24-25周龄db/db雄鼠20只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组，每组各10只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药31天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。在第0，4，7，11，16，21，26，31天分别称体重。

结果显示，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组在第0，4，7，11，16，21，26，31天体重无显著差异(图4)，说明纤溶酶原对动物体重影响不大。

实施例5纤溶酶原对糖尿病肝损伤晚期肝脏组织损伤的保护作用

24-25周龄db/db雄鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组，每各5只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药31天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。在第32天处死小鼠并取肝脏组织在10％中性福尔马林固定液中固定24-48小时固定后的肝组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为5μm，切片脱蜡复水并用苏木素和伊红染色(HE染色)，1％盐酸酒精分化，氨水返蓝，并酒精梯度脱水封片。

HE染色结果显示，给溶媒PBS对照组(图5A)肝脏呈重度脂肪变性，脂质沉积，融合成大的脂肪空泡，细胞核被挤至边缘(↗)，肝索紊乱，肝窦变窄，且在肝索处有数量不等的炎性灶(↑)；给纤溶酶原组(图5B)肝脏轻度脂肪变性，损伤以轻度水样变性为主，胞浆溶解(◥)，主要分布在汇管区与中央静脉中间的区域，汇管区及中央静脉周围受累较轻，同时可见肝索处轻度炎细胞浸润。说明给纤溶酶原后肝脏的损伤得到明显修复。

实施例6纤溶酶原减少糖尿病小鼠肝组织纤维蛋白水平

24-25周龄db/db雄鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组，每组各5只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药31天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。在第32天处死小鼠并取肝脏组织在10％中性福尔马林固定液中固定24小时。固定后的肝脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为5μm，切片脱蜡复水后水洗1次。以3％双氧水孵育15分钟，水洗2次，每次5分钟。10％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭1小时；时间到后，弃除羊血清液，用PAP笔圈出组织。兔抗小鼠纤维蛋白(原)抗体(Abcam)4℃孵育过夜，TBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，TBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在显微镜下200倍下观察。

研究发现，给纤溶酶原组(图6B)与给溶媒PBS对照组(图6A)相比，给纤溶酶原组的小鼠其肝脏组织纤维蛋白的水平明显降低，说明注射纤溶酶原能够显著降低糖尿病小鼠的纤维蛋白沉积，反映出纤溶酶原对糖尿病小鼠的机体损伤有显著修复功能。

实施例7纤溶酶原减轻糖尿病小鼠肝脏组织的炎症

24-25周龄db/db雄鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组，每组各5只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药31天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。给纤溶酶原31天后处死小鼠并取肝脏组织在10％中性福尔马林固定液中固定24小时。固定后的肝脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为5μm，切片脱蜡复水后水洗1次。以3％双氧水孵育15分钟，水洗2次，每次5分钟。10％正常羊血清封闭1小时，时间到后甩去血清，用PAP笔圈出组织。针对F4/80的兔多克隆抗体(Abcam)4℃孵育过夜，TBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，TBS洗2次。按DAB试剂盒(Vector laboratories，Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟，梯度脱水透明并封片，切片在显微镜下400倍下观察。

F4/80巨噬细胞标志物，可以表示炎症反应的程度和阶段。结果显示，给纤溶酶原组(图7B)与给溶媒PBS对照组(图7A)相比，给纤溶酶原组小鼠的F4/80阳性水平明显降低，说明给纤溶酶原后肝脏组织炎症程度减轻。图7C为F4/80免疫组化阳性表达数定量分析结果，给纤溶酶原组F4/80表达量显著减少，且具有统计学差异，说明注射纤溶酶原能够显著促进糖尿病小鼠肝脏炎症的修复。

实施例8纤溶酶原促进糖尿病小鼠肝脏损的修复

25-28周龄db/db雄鼠9只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组3只，给纤溶酶原组6只。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药31天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。给纤溶酶原31天后摘眼球采全血，待血清析出后4℃3500r/min离心10分钟，取上清液进行检测。本实验使用谷丙转氨酶检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号C009-2)，运用赖氏比色法(Reitman-Frankel)检测血清中谷丙转氨酶(ALT)的含量。

谷丙转氨酶是肝脏健康状态的一个重要指标^[15,16]，谷丙转氨酶的正常参考值区间为9～50U/L。检测结果显示，给溶媒PBS对照组血清中ALT的含量显著高于正常生理指标，而给纤溶酶原组已经恢复到体内的正常水平，并且给纤溶酶原组要显著低于给溶媒PBS对照组，且具有统计学差异(图8)。说明在糖尿病晚期模型小鼠中，注射纤溶酶原能有效地修复肝损伤。

实施例9纤溶酶原对急性肝中毒肝脏的保护作用

7-8周龄plg^+/+小鼠18只，雌雄不限，随机分为两组，分别为给溶媒PBS对照组和纤溶酶原给药组，每组9只。两组小鼠按0.5mL/kg体重经腹腔注射给予四氯化碳，连续给予两天，建立急性肝损伤模型^[17,18]。四氯化碳使用前需用玉米油稀释，前者与后者的体积比1:7。造模当天为第0天，第1天开始给纤溶酶原或PBS。给纤溶酶原组小鼠按每天1mg/0.1mL/只/天给予纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS，连续给药7天。在第0，2，7天分别取两组小鼠各3只处死，解剖观察记录肝脏情况，然后肝脏组织在10％中性福尔马林固定液中固定24-48小时。固定后的肝脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为5μm，切片脱蜡复水并用苏木素和伊红染色(HE染色)，1％盐酸酒精分化，氨水返蓝，并酒精梯度脱水封片，在显微镜下200倍下观察。

HE染色结果显示，给溶媒PBS对照组(图9A-C)和给纤溶酶原组(图9D-F)小鼠的肝脏第0天主要以中央静脉周围碎片状坏死为主，坏死区域胞核碎裂，胞浆淡染，其他未坏死区也发生了中度水样变性，细胞水肿；第2天中央静脉扩张，肝细胞结构紊乱，少量炎性细胞浸润，两组并无明显差异。但在第7天时，给溶媒PBS对照组仍可见少量的肝细胞变性，细胞轻度水肿，肝索紊乱，肝血窦变窄，且在汇管区周围轻度炎细胞浸润，而给纤溶酶原组的肝脏基本恢复正常胞浆红染，肝索规则，肝窦清晰。说明纤溶酶原能够促进肝损伤的修复。

实施例10纤溶酶原对急性肝中毒肝脏的保护作用

7-11周龄plg^-/-雄性小鼠18只，随机分为两组，分别为给溶媒PBS对照组和纤溶酶原给药组，每组9只。两组小鼠按0.5mL/kg体重经腹腔注射给予四氯化碳，单次处理，建立急性肝损伤模型^[17,^18]。四氯化碳使用前需用玉米油稀释，前者与后者的体积比1:7。造模给完成后半小时内给予纤溶酶原或溶媒PBS。给纤溶酶原组小鼠按每天1mg/0.1mL/只/天给予纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS，连续给药2天。在给药后第18，24，48小时分别取两组小鼠各3只处死，解剖观察记录肝脏情况，然后肝脏组织在10％中性福尔马林固定液中固定24-48小时。固定后的肝脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为5μm，切片脱蜡复水并用苏木素和伊红染色(HE染色)，1％盐酸酒精分化，氨水返蓝，并酒精梯度脱水封片，在显微镜下200倍下观察。

结果显示，给溶媒PBS对照组(图10A-C)在18h、24h、48h均呈现不同程度的坏死，18h、24h以片状坏死为主，48h时已经发生了桥接坏死，核碎裂，胞浆淡染，而且损伤不断加剧，主要分布在中央静脉周围，坏死区中度炎细胞浸润(↓)，汇管区周围坏死较轻，以轻度水样变性为主，伴以轻度的炎细胞浸润，轻度胆管增生(◥)；给纤溶酶原组(图10D-F)在18h、24h、48h较之于对照组，均未出现明显的坏死，损伤以轻度水样变性为主，分布在汇管区周围，而中央静脉周围肝细胞未受累，而24h时比之18h有好转，水样变性减轻，中央静脉周围肝细胞轻度脂肪变性，胞浆淡染，均伴以轻度炎细胞浸润。说明纤溶酶原能够促进plg^-/-急性肝损伤模型小鼠肝脏损伤的修复。

实施例11纤溶酶原减轻急性肝损伤模型小鼠肝脏组织纤维蛋白沉积

7-11周龄plg^-/-雄性小鼠18只，随机分为两组，分别为给溶媒PBS对照组和纤溶酶原给药组，每组9只。两组小鼠按0.5mL/kg体重经腹腔注射四氯化碳，单次处理，建立急性肝损伤模型^[17,18]。四氯化碳使用前需用玉米油稀释，前者与后者的体积比1:7。造模给完成后半小时内给予纤溶酶原或溶媒PBS。给纤溶酶原组小鼠按每天1mg/0.1mL/只/天给予纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS，连续给药2天。在给药后第18，24，48小时分别取两组小鼠各3只处死，解剖观察记录肝脏情况，然后肝脏组织在10％中性福尔马林固定液中固定24-48小时。固定后的肝脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为5μm，切片脱蜡复水后水洗1次。以3％双氧水孵育15分钟，水洗2次，每次5分钟。10％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭1小时；时间到后，弃除羊血清液，用PAP笔圈出组织。兔抗小鼠纤维蛋白(原)抗体(Abcam)4℃孵育过夜，TBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，TBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在显微镜下200倍下观察。

结果显示，第18、24、48小时三个时间点给纤溶酶原组(图11D-F)纤维蛋白的阳性着色都显著浅于给溶媒PBS对照组(图11A-C)，并且随着时间的延长纤维蛋白的着色也有逐渐变浅的趋势。说明注射纤溶酶原能够减少纤维蛋白的沉积，促进肝损伤的修复。

实施例12纤溶酶原促进5.0GyX射线辐射小鼠肝脏炎症的修复

本实验使用6-8周龄健康的雄性C57小鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组，每组各5只。分组完成后，建立放射损伤模型，采用直线加速器6MV X射线按5.0Gy对小鼠全身单次均匀照射，吸收剂量率2.0Gy/min，吸收剂量为5.0Gy(照射2.5分钟)。建立模型后，3个小时内给予纤溶酶原。实验开始当天为第0天称量体重并分组，第1天开始辐射处理并给予纤溶酶原或溶媒PBS，给药期为10天给药完成后对动物进行停药观察11天，整个实验期为21天。给纤溶酶原组按1mg/0.1mL/只/天经尾静脉注射给药，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。在第21天处死解剖小鼠并取肝脏在10％中性福尔马林固定液中固定24-48小时。固定后的肝脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为5μm，切片脱蜡复水后水洗1次。Tris-EDTA修复30分钟，室温冷却20分钟后水轻柔冲洗。以3％双氧水孵育15分钟，用PAP笔圈出组织。10％的正常羊血清(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭1小时；时间到后，弃除羊血清液。兔抗小鼠F4/80抗体(Abcam)4℃孵育过夜，TBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，TBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在显微镜下200倍下观察。

F4/80免疫组化结果显示，5.0Gy X射线照射造模后给溶媒PBS对照组(图12A)的小鼠巨噬细胞标志物的表达量高于给纤溶酶原组(图12B)，说明给纤溶酶原后，动物肝脏组织的炎症显著减轻。

实施例13纤溶酶原使顺铂化疗损伤模型小鼠肝脏组织纤维蛋白的沉积减少

8-9周龄健康的雄性C57小鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组，每组各5只。分组完成后，建立化疗损伤模型，按10mg/Kg体重单次腹腔注射顺铂。建立模型后，给纤溶酶原组按1mg/只/天经尾静脉注射给予纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS。实验开始当天为第0天称量体重并分组，第1天开始腹腔注射顺铂造模，造模后3小时内给予纤溶酶原或溶媒PBS，给药期为7天。第8天处死小鼠，取肝脏在10％中性福尔马林固定液中固定24-48小时。固定后的肝脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为5μm，切片脱蜡复水后水洗1次。柠檬酸修复30分钟，室温冷却10分钟后水轻柔冲洗。以3％双氧水孵育15分钟，用PAP笔圈出组织。10％的正常羊血清(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭1小时；时间到后，弃除羊血清液。兔抗小鼠纤维蛋白抗体(Abcam)4℃孵育过夜，TBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，TBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在显微镜下200倍下观察。

结果显示，给溶媒PBS对照组(图13A)肝脏组织中纤维蛋白阳性着色明显深于纤溶酶原给药组(图13B)。说明纤溶酶原能够使损伤的肝脏组织中沉积的纤维蛋白显著减少，表明纤溶酶原能够促进化疗药顺铂所致的肝脏损伤的修复。

实施例14纤溶酶原对急性肝中毒肝脏的保护作用

7-11周龄plg-/-雄性小鼠6只，随机分为两组，分别为给溶媒PBS对照组和纤溶酶原给药组，每组3只。两组小鼠按0.5mL/kg体重经腹腔注射给予四氯化碳，单次处理，建立急性肝损伤模型^[17,18]。四氯化碳使用前需用玉米油稀释，前者与后者的体积比1:7。造模给完成后半小时内给予纤溶酶原或溶媒PBS。给纤溶酶原组小鼠按每天1mg/0.1mL/只/天给予纤溶酶原，给溶媒PBS对照组给予相同体积的PBS，连续给药7天。在第8天处死小鼠，解剖观察记录肝脏情况，然后肝脏组织在10％中性福尔马林固定液中固定24-48小时。固定后的肝脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为5μm，切片脱蜡复水并用苏木素和伊红染色(HE染色)，1％盐酸酒精分化，氨水返蓝，并酒精梯度脱水封片，在显微镜下200倍下观察。

结果显示，给溶媒PBS对照组(图14A)，肝脏中央静脉扩张，内皮细胞坏死，中央静脉的周围肝细胞均发生大面积灶状坏死，核碎裂深染，其他未发生坏死的区域有轻度的水样变性，细胞水肿，胞浆透亮，伴以坏死区轻度炎细胞浸润；给纤溶酶原组(图14B)，肝脏未发生明显的坏死，损伤以轻度的水样变性为主，有少量肝细胞胞浆嗜酸性增强，红染。给纤溶酶原组损伤明显轻于给溶媒PBS对照组，说明纤溶酶原能够促进plg-/-急性肝损伤模型小鼠肝脏损伤的修复。

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序列表

<110> 深圳瑞健生命科学研究院有限公司

<120> 一种预防和治疗肝组织损伤及其相关病症的方法

<130> PCK02773

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2376

<212> DNA

<213> 不含有信号肽的天然纤溶酶原(Glu-PLG，Glu-纤维蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 1

gagcctctgg atgactatgt gaatacccag ggggcttcac tgttcagtgt cactaagaag 60

cagctgggag caggaagtat agaagaatgt gcagcaaaat gtgaggagga cgaagaattc 120

acctgcaggg cattccaata tcacagtaaa gagcaacaat gtgtgataat ggctgaaaac 180

aggaagtcct ccataatcat taggatgaga gatgtagttt tatttgaaaa gaaagtgtat 240

ctctcagagt gcaagactgg gaatggaaag aactacagag ggacgatgtc caaaacaaaa 300

aatggcatca cctgtcaaaa atggagttcc acttctcccc acagacctag attctcacct 360

gctacacacc cctcagaggg actggaggag aactactgca ggaatccaga caacgatccg 420

caggggccct ggtgctatac tactgatcca gaaaagagat atgactactg cgacattctt 480

gagtgtgaag aggaatgtat gcattgcagt ggagaaaact atgacggcaa aatttccaag 540

accatgtctg gactggaatg ccaggcctgg gactctcaga gcccacacgc tcatggatac 600

attccttcca aatttccaaa caagaacctg aagaagaatt actgtcgtaa ccccgatagg 660

gagctgcggc cttggtgttt caccaccgac cccaacaagc gctgggaact ttgtgacatc 720

ccccgctgca caacacctcc accatcttct ggtcccacct accagtgtct gaagggaaca 780

ggtgaaaact atcgcgggaa tgtggctgtt accgtgtccg ggcacacctg tcagcactgg 840

agtgcacaga cccctcacac acataacagg acaccagaaa acttcccctg caaaaatttg 900

gatgaaaact actgccgcaa tcctgacgga aaaagggccc catggtgcca tacaaccaac 960

agccaagtgc ggtgggagta ctgtaagata ccgtcctgtg actcctcccc agtatccacg 1020

gaacaattgg ctcccacagc accacctgag ctaacccctg tggtccagga ctgctaccat 1080

ggtgatggac agagctaccg aggcacatcc tccaccacca ccacaggaaa gaagtgtcag 1140

tcttggtcat ctatgacacc acaccggcac cagaagaccc cagaaaacta cccaaatgct 1200

ggcctgacaa tgaactactg caggaatcca gatgccgata aaggcccctg gtgttttacc 1260

acagacccca gcgtcaggtg ggagtactgc aacctgaaaa aatgctcagg aacagaagcg 1320

agtgttgtag cacctccgcc tgttgtcctg cttccagatg tagagactcc ttccgaagaa 1380

gactgtatgt ttgggaatgg gaaaggatac cgaggcaaga gggcgaccac tgttactggg 1440

acgccatgcc aggactgggc tgcccaggag ccccatagac acagcatttt cactccagag 1500

acaaatccac gggcgggtct ggaaaaaaat tactgccgta accctgatgg tgatgtaggt 1560

ggtccctggt gctacacgac aaatccaaga aaactttacg actactgtga tgtccctcag 1620

tgtgcggccc cttcatttga ttgtgggaag cctcaagtgg agccgaagaa atgtcctgga 1680

agggttgtag gggggtgtgt ggcccaccca cattcctggc cctggcaagt cagtcttaga 1740

acaaggtttg gaatgcactt ctgtggaggc accttgatat ccccagagtg ggtgttgact 1800

gctgcccact gcttggagaa gtccccaagg ccttcatcct acaaggtcat cctgggtgca 1860

caccaagaag tgaatctcga accgcatgtt caggaaatag aagtgtctag gctgttcttg 1920

gagcccacac gaaaagatat tgccttgcta aagctaagca gtcctgccgt catcactgac 1980

aaagtaatcc cagcttgtct gccatcccca aattatgtgg tcgctgaccg gaccgaatgt 2040

ttcatcactg gctggggaga aacccaaggt acttttggag ctggccttct caaggaagcc 2100

cagctccctg tgattgagaa taaagtgtgc aatcgctatg agtttctgaa tggaagagtc 2160

caatccaccg aactctgtgc tgggcatttg gccggaggca ctgacagttg ccagggtgac 2220

agtggaggtc ctctggtttg cttcgagaag gacaaataca ttttacaagg agtcacttct 2280

tggggtcttg gctgtgcacg ccccaataag cctggtgtct atgttcgtgt ttcaaggttt 2340

gttacttgga ttgagggagt gatgagaaat aattaa 2376

<210> 2

<211> 791

<212> PRT

<213> 不含有信号肽的天然纤溶酶原(Glu-PLG，Glu-纤维蛋白溶酶原)氨基酸序列

<400> 2

Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser Leu Phe Ser

1 5 10 15

Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu Cys Ala Ala

20 25 30

Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe Gln Tyr His

35 40 45

Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg Lys Ser Ser

50 55 60

Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys Lys Val Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met

85 90 95

Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser

100 105 110

Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu

115 120 125

Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp

130 135 140

Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu

145 150 155 160

Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr Asp Gly

165 170 175

Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala Trp Asp Ser

180 185 190

Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro Asn Lys

195 200 205

Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu Leu Arg Pro

210 215 220

Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu Cys Asp Ile

225 230 235 240

Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr Tyr Gln Cys

245 250 255

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<212> DNA

<213> 含有信号肽的天然纤溶酶原（来源于swiss prot）的核酸序列

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<213> 含有信号肽的天然纤溶酶原（来源于swiss prot）的氨基酸序列

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Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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325 330 335

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Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His

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Thr Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys

245 250 255

Asp Ser Ser Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro

260 265 270

Glu Leu Thr Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser

275 280 285

Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser

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Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr

305 310 315 320

Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp

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Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr

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Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn

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