两性霉素B立方液晶凝胶、立方液晶纳米粒及其制备方法与流程

本发明涉及药物制剂领域，特别是涉及一种两性霉素B立方液晶凝胶、纳米粒及其制备方法。

背景技术：

两性霉素B(amphotericin B，AmB)是多烯类广谱抗真菌抗生素，系链霉菌Streptomyces nodosus培养液中的分离产物，这一种的大环内酯衍生物，分子结构中含一个非极性庚烯和一个极性多元醇，不溶于水、乙醇，易被光、热和酸破坏。两性霉素B的抗菌机理为：选择性地与真菌细胞膜上的麦角固醇结合，在细胞膜上形成膜孔，增加细胞膜的通透性，导致细胞内钾离子、核苷酸、氨基酸等多种小分子物质外漏，破坏正常代谢造成细胞死亡。

临床上两性霉素B主要以注射剂的形式存在。国内外医药工作者先后成功研制出两性霉素B脱氧胆酸盐注射剂、两性霉素B脂质复合体、两性霉素B胶质分散体以及两性霉素B脂质体共计4种注射剂供临床使用。两性霉素B脂质注射液的出现是两性霉素B注射液制剂研究中取得的重大突破，对早期开发两性霉素B脱氧胆酸钠注射液的完善，显著降低两性霉素B的输液反应和肾毒性。但是，仍然存在一定的毒副作用以及价格昂贵等问题，从而限制了两性霉素B脂质注射液在临床推广使用。因此，进一步筛选高效、广谱、低毒的新型药物和合理设计药物剂型解决两性霉素B毒副作用仍然是一项十分迫切的任务

两性霉素B口服给药具有诸多优点：无需在专业医护人员指导下用药，患者可自行方便在家中服用；口服给药避免了长期注射的疼痛性和输液不良反应等问题，改善患者的顺应性和提高患者的生活质量；两性霉素B口服给药研究显示能保持两性霉素B良好的抗真菌活性同时能显著降低药物的毒副作用。然而，两性霉素B口服吸收面临诸多技术难题，研究进展缓慢。两性霉素B口服吸收差的主要原因如下：两性霉素B属于生物药剂学分类下的第四类药物，溶解度小，渗透性差，在口服吸收过程中存在溶解屏障和吸收屏障。此外，两性霉素B对光和热敏感，易降解，口服生物利用度非常低。在早期一系列两性霉素B口服制剂研究失败之后，科研工作者得出两性霉素B不宜制备口服制剂的结论。

立方液晶纳米粒(Cubosomes)是指一定浓度的两亲性脂质材料和表面活性剂分散在水溶液中自组装成含双连续水通道和闭合脂质双分子层的蜂窝状或海绵状结构的纳米粒子。该体系是以立方晶格为结构单元,在立方晶格中有微小细孔通道(5～10nm)，含有两条互不相通的双连续水道，其中一条水道与外部连续相通，而另一条水道则是封闭的，双连续水通道和闭合脂质双分子层在空间上三维延伸，有序堆叠，具有三维、循环排列和最小表面积特点的紧密结构。

技术实现要素：

基于此，本发明提供了一种两性霉素B立方液晶凝胶，用于制备用于口服的两性霉素B立方液晶纳米粒，以克服两性霉素B在口服吸收过程中存在的溶解屏障和吸收屏障，提高两性霉素B的稳定性，以提高其口服生物利用度。

具体技术方案如下：

一种两性霉素B立方液晶凝胶，主要由以下质量份的原料制备而成：

所述两性霉素B与所述胶束材料的质量比为1:0.3-2；

所述液晶材料与所述稳定剂的质量比为9:0.4-1.5；

所述胶束材料选自脱氧胆酸钠、聚氧乙烯、聚乙二醇-壳聚糖共聚物、聚维酮、仿细胞膜磷酸胆碱、聚氨基酸、聚乳酸和聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的至少一种；所述液晶材料为植烷三醇；所述稳定剂为泊洛沙姆407。

在其中一些实施例中，所述两性霉素B立方液晶凝胶主要由以下质量份的原料制备而成：

在其中一些实施例中，所述胶束材料选自脱氧胆酸钠、聚乳酸和聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的至少一种。

在其中一些实施例中，所述两性霉素B与所述胶束材料的质量比为1:0.6-1.3。

在其中一些实施例中，所述两性霉素B与所述胶束材料的质量比为1:0.7-1.0。

在其中一些实施例中，所述液晶材料与所述稳定剂的质量比为9:0.8-1.2。

在其中一些实施例中，所述两性霉素B立方液晶凝胶，主要由以下质量份的原料制备而成：

所述两性霉素B与所述脱氧胆酸钠的质量比为1:0.7-0.9；

所述植烷三醇与所述泊洛沙姆407的质量比为9:0.8-1.2。

本发明还提供了上述两性霉素B立方液晶凝胶的制备方法。

具体技术方案如下：

一种上述的两性霉素B立方液晶凝胶的制备方法，包括以下步骤：

两性霉素B胶束的制备：将两性霉素B和胶束材料加入到蒸馏水中，滴加浓度为0.08-0.12mol·L^-1的氢氧化钠溶液，直至两性霉素B完全溶解，再用pH6-6.4的磷酸缓冲溶液稀释，再将所得溶液进行冷冻干燥，即得所述两性霉素B胶束；

两性霉素B立方液晶凝胶的制备：将所述两性霉素B胶束溶于权利要求1-6任一项所述的水中，得两性霉素B的水溶液；将稳定剂和液晶材料加热熔融，漩涡混匀，再加入所述两性霉素B的水溶液，漩涡混匀，室温放置，即得所述两性霉素B立方液晶凝胶。

在其中一些实施例中，所述加热熔融的温度为40-70℃。

本发明还提供了上述两性霉素B立方液晶凝胶的应用。

具体技术方案如下：

上述两性霉素B立方液晶凝胶在制备两性霉素B立方液晶纳米粒中的应用。

本发明还提供了一种两性霉素B立方液晶纳米粒。

具体技术方案如下：

一种两性霉素B立方液晶纳米粒，由上述的两性霉素B立方液晶凝胶分散在水中制备而成。

本发明还提供了一种两性霉素B立方液晶纳米粒的制备方法。

具体技术方案如下：

一种上述的两性霉素B立方液晶纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

将两性霉素B立方液晶凝胶加入水中，用超声波细胞粉碎仪进行超声分散，得两性霉素B立方液晶粗分散体系；

将两性霉素B立方液晶粗分散体系进行高压均质，均质压力为300-1800bar，循环次数为3-13次，即得所述两性霉素B立方液晶纳米粒。

在其中一些实施例中，所述均质压力为1100-1300bar，循环次数为8-10次。

在其中一些实施例中，所述超声分散的条件为分散时间为10-15min，功率为150-400w，工作时间为4-6s，间断时间为8-12s。

本发明的两性霉素B立方液晶凝胶、立方液晶纳米粒及其制备方法具有以下优点和有益效果：

本发明的发明人通过大量实验研究发现将两性霉素B与胶束材料制备成两性霉素B胶束后再与特定的液晶材料以及稳定剂以特定比例配合制备的立方液晶凝胶，可用于制备药物包封率高、粒径较小且分布均匀的两性霉素B立方液晶纳米粒。立方液晶纳米粒是一种新型纳米脂质药物载体，其巨大的膜表面积和独特的三维晶格结构对难溶的药物具有良好的增溶效果和缓释性能。因而本发明的两性霉素B立方液晶纳米粒能够克服口服给药过程中的溶解屏障和渗透屏障，显著提高两性霉素B的口服生物利用度。

药物颗粒大小，药物与溶出介质的接触面积，以及溶出层与介质之间的药物浓度差是影响难溶性药物溶出速率的关键参数。本发明的两性霉素B立方液晶纳米粒将两性霉素B包载进液晶结构中后，药物由晶体颗粒转变成无定型的分子态，均匀分布于亲脂域中，双连续水通道与脂质双分子层的巨大交界面积显著增加了两性霉素B的溶出表面积。同时两性霉素B在亲脂域中有较大的溶解度，在溶出层和介质之间形成较大的药物浓度差，可进一步增大药物的溶出度，有效克服药物溶解屏障。

立方液晶纳米粒独具的原位生物黏附特性，能吸附在胃肠道表面，增加药物与胃肠道作用时间。此外，立方液晶晶格单元中的脂质双分子层具有类细胞结构，与细胞有很强的亲和性，能够促进胃肠道上皮细胞对药物的内吞摄取，跨越小肠胃肠道黏膜屏障，增加药物吸收。两性霉素B立方液晶纳米粒的生物黏附性和独特的类细胞膜结构能够有效克服两性霉素B口服给药的渗透屏障。

两性霉素B对光和热敏感，易降解，物理化学稳定性差。本发明的两性霉素B立方液晶纳米粒的晶格结构对包载的两性霉素B具有很强的保护作用，将两性霉素B包载在立方液晶纳米粒三维网络晶格结构中，可以有效地解决上述稳定性问题。将两性霉素B包载在液晶晶格结构内部，可以减少药物与外界破坏性因素(比如光、热、酸碱、化学和生物酶等)的接触，避免两性霉素B在溶媒介质或生物体内被降解而失去生物活性，隔离外界破坏性因素对两性霉素B结构的破坏，有效保持两性霉素B结构稳定性以及相应的药理活性，增加两性霉素B的稳定性。

另外，本发明的两性霉素B立方液晶纳米粒，粒径较小，且粒径均一性好，有利于肠上皮细胞内吞并转运到细胞内。

因此，本发明的两性霉素B立方液晶纳米粒能够克服口服给药过程中的溶解屏障和渗透屏障，保护两性霉素B结构和活性，增加两性霉素B的稳定性，有效提高两性霉素B的口服生物利用度。

本发明的两性霉素B立方液晶纳米粒显著提高了两性霉素B的口服相对生物利用度，同时能使两性霉素B缓慢释放，具有24小时缓释的效果，为两性霉素B提供了一种能够缓慢释放、吸收良好、生物利用度高的两性霉素B新型口服制剂，同时纳米粒溶液也有利于口服，能够提高患者的顺应性。

本发明的两性霉素B立方液晶纳米粒的制备方法工艺简单，包封率高，使制备得到的两性霉素B立方液晶纳米粒粒径小且分布均匀，工艺的重复性良好，生产成本较低，有利于工业化生产，具有良好的应用前景，同时有利于推进液晶纳米的工业化发展。

附图说明

图1为实施例1中两性霉素B立方液晶纳米粒制备流程图；

图2为实施例5中两性霉素B立方液晶纳米粒冷冻透射电镜图；

图3为实施例5中两性霉素B立方液晶纳米粒SAXS谱图；

图4为实施例5中空白立方液晶纳米粒SAXS谱图(A：1200bar，均质9次；B：1800bar，均质9次)；

图5为实施例6中两性霉素B立方液晶纳米粒在模拟肠液中的稳定性实验结果(n＝6)；

图6为实施例8中两性霉素B立方液晶纳米粒的体外释放曲线(n＝6)；

图7为实施例9中两性霉素B口服后的血药浓度(n＝6)。

具体实施方式

以下通过具体实施例以及附图对本发明的两性霉素B立方液晶凝胶、立方液晶纳米粒及其制备方法做进一步详细的说明。

实施例1:两性霉素B立方液晶纳米粒的制备

参见图1，本实施例的两性霉素B立方液晶纳米粒的制备方法包括如下步骤：

两性霉素B脱氧胆酸钠胶束的制备：称取0.5g两性霉素B原料药和0.41g脱氧胆酸钠(质量比为1：0.82)，加入到30mL蒸馏水中，再滴加0.1mol·L^-1氢氧化钠溶液，直至两性霉素B原料药完全溶解，再用pH 6.2的0.01mol·L^-1磷酸缓冲溶液稀释至总体积为100mL。所得溶液放置冷冻干燥机中避光，-50℃冷阱温度，真空度为0.1Mbar条件下冷冻48h，即得黄色两性霉素B脱氧胆酸钠胶束粉末。避光、密闭、4℃冰箱保存。

两性霉素B立方液晶凝胶的制备：按表1所示原料处方称取各原料，将F127和植烷三醇在100mL塑料离心管中，水浴60℃加热熔融，每30min漩涡混悬器混匀30s，1小时后加入两性霉素B脱氧胆酸钠胶束的60℃的水溶液(用2g水溶解表1所示处方量的两性霉素B脱氧胆酸钠胶束，现配现用)，漩涡混悬器混匀1min，室温放置48h，即得两性霉素B立方液晶凝胶。

两性霉素B立方液晶纳米粒的制备：室温下在所得两性霉素B立方液晶凝胶中加入超纯水至总重量为20g，48h后用超声波细胞粉碎仪超声分散5min，所用超声功率为200W，超声工作时间5s，间断时间10s，得两性霉素B立方液晶粗分散体系；再将两性霉素B立方液晶粗分散体系用高压均质机进行高压均质(均质压力为1200bar，均质次数为9次)，即得乳黄色的两性霉素B立方液晶纳米粒。

表1两性霉素B立方液晶凝胶的原料处方

实施例2:两性霉素B立方液晶纳米粒的制备

本实施例的两性霉素B立方液晶纳米粒的制备方法包括如下步骤：

两性霉素B胶束的制备：按表2所示组成，称取两性霉素B原料药和胶束材料，按实施例1的方法制备两性霉素B胶束。

两性霉素B立方液晶凝胶的制备：按实施例1中的处方1-9称取各原料，按实施例1的方法制备。

两性霉素B立方液晶纳米粒的制备：同实施例1

表2两性霉素B胶束的制备原料

对比例1

本对比例的两性霉素B立方液晶纳米粒的原料处方基本与实施例1中的处方1-9相同，区别在于F127的用量为0.4g。其制备方法同实施例1。

对比例2

本对比例的两性霉素B立方液晶纳米粒的原料处方基本与实施例1中的处方1-9相同，区别在于不添加F127。其制备方法同实施例1。

对比例3

本对比例的两性霉素B立方液晶纳米粒的原料处方基本与实施例1中的处方1-9相同，区别在于所用稳定剂为泊洛萨姆188。其制备方法同实施例1。

对比例4

本对比例的两性霉素B立方液晶纳米粒的原料处方基本与实施例1中的处方1-9相同，区别在于所用液晶材料为二油酸甘酸酯(DGMO)。其制备方法同实施例1。

实施例3

对实施例1-2以及其对比例1-4制备的两性霉素B立方液晶纳米粒的粒径以及包封率进行测定。

粒径测定方法如下:立方液晶纳米粒用超纯水稀释100倍后，取1mL样品加入到样品池，25℃平衡1min、分散粘度为0.8872cPa，Zetasizer Nano ZS90测定立方液晶纳米粒的粒径参数，粒径分析仪软件计算立方液晶纳米粒的粒子大小和多分散系数(PDI)。PDI是反映粒子大小分布范围变化的指标，PDI越小表示粒子大小越均匀、集中分布，PDI越大表示粒子大小不均匀、差异显著。

包封率测定方法：取1mL两性霉素B立方液晶纳米粒溶液用超纯水定溶至5mL，取0.5mL在YM-100的超滤管中，15000r/min离心30min，收集两性霉素B立方液晶纳米粒和下层液体，用甲醇洗涤后，二甲基亚砜定溶至5mL，取0.2mL用甲醇定容至10mL，高效液相色谱测定两性霉素B含量。

包封率公式：EE％＝(W_total－W_free)/W_total×100％。

W_total：两性霉素B投药量；W_free：游离的两性霉素B

高效液相色谱条件：色谱柱：Phenomenex luna C18(250x4.6mm，5μm)，流动相：乙腈：0.01mol pH6.20磷酸缓冲液＝40:60，柱温35℃，检测波长406nm，流速：1.0mL·min-1，进样量：20μL。

测定结果如表3所示：

表3两性霉素B立方液晶纳米粒的粒径以及包封率

两性霉素B的溶出速率非常慢，溶出速率成为限制两性霉素B在磷脂中溶解性的关键。根据Noyes-Whitney溶出方程：dc/dt＝DA(Cs-C)/Vh

dc/dt：溶出速率，D：药物的扩散系数，A：溶出界面面积，Cs：药物饱和溶解度，C：溶液中药物的浓度，V：溶出介质质量，h:扩散层厚度。

可知，通过以下两个方面可增加两性霉素B的溶出速率：1、降低两性霉素B粒径，增加药物溶出表面积A，增加药物溶出速率；2、减小载体粒径，降低药物扩散层厚度h，增加药物溶出速率。本发明制备两性霉素B立方液晶纳米粒的方法中，首先由脱氧胆酸钠增溶两性霉素B形成胶束，粒径从原料药的大颗粒降到纳米级的胶束，增加溶出表面积。其次，通过高压均质减小载体粒径，降低药物扩散层厚度，加速两性霉素B的溶解速率。

此外，不同大小的粒子在肠上皮细胞的摄取不同，导致不同口服吸收效果。粒径小的粒子能被肠上皮细胞吞噬转运到细胞内，而粒径大的粒子不易被细胞吞噬。

由表3结果可知：随着稳定剂的含量增大，两性霉素B立方液晶纳米粒的粒径有一个明显降低的趋势，符合本专利降低纳米粒粒径的要求，结合对比例1-3可以知道，与未加稳定剂的处方相比，稳定剂确实可以显著减小纳米粒粒径，但是过高的稳定剂含量同时也能破坏液晶的稳定结构，反而使得粒径增大，植烷三醇与F127的最优质量比为9：1。此外，稳定剂的种类也有一定的影响，同样条件下，稳定剂为泊洛萨姆188的处方粒径更大，包封率更低。投药量对两性霉素B立方液晶纳米粒的粒径和包封率没有十分明显的影响，不同投药量的包封率均达到了90％左右。另外，固定药物含量，胶束材料为0.41g(药物与胶束质量比1:0.82)时有最大的包封率，胶束材料含量较小时，难以达到临界胶束浓度，因此包封率大大降低；过高含量的胶束材料则会使得制备的胶束相互粘连，甚至会破坏胶束的结构，造成药物包封率降低。而胶束材料的种类也对包封效果有影响，但影响比其用量的影响小，PLGA和PLA也均有较好的效果，取得较高的包封率。不同的液晶材料也会影响纳米粒粒径和包封率，二油酸甘油酯的包封率较低，粒径较大，效果不如植烷三醇。

实施例4:均质压力和均质次数对两性霉素B立方液晶纳米粒粒径的影响

按实施例1的处方1-9制备两性霉素B立方液晶纳米粒，制备方法同实施例1，区别高压均质的条件不同，具体见表4。

测定本实施例制备的两性霉素B立方液晶纳米粒的粒径，测定方法同实施例1，测定结果见表4。

Zetasizer Nano ZS90测定的平均粒径结果(表4)显示两性霉素B立方液晶纳米粒的平均粒径不是随着高压均质的压力增大而减小，而是随着高压均质压力增加基本保持不变。但是PDI显示随着高压均质的压力增大而减小，从超声分散制备立方液晶纳米粒的PDI 0.250降低到1200bar高压均质9次条件下制备的两性霉素B立方液晶纳米粒的PDI 0.107。PDI是反映粒子大小分布范围变化的指标，PDI越小表示粒子大小越均匀、集中分布，PDI越大表示粒子大小不均匀、差异显著。Zetasizer Nano ZS90测定的Intensity图显示高压均质增加到1200bar 9次时，两性霉素B立方液晶纳米粒未见微米大小粒子，全部粒子大小分布在纳米范围内。Zetasizer Nano ZS90测定的Intensity图提示两性霉素B立方液晶纳米粒的粒径随着高压均质的压力增大而减小，当高压均质达到一定范围后，增加高压均质压力也不能降低两性霉素B立方液晶纳米粒的粒子大小。平均粒径是粒子大小的一个平均值，反映粒子部分信息，而PDI、Intensity参数能全面反映立方液晶纳米粒的粒径大小和分布，因此确定均质压力1200bar均质9次为最佳的均质条件。

表4制备工艺对两性霉素B立方液晶纳米粒的粒径的影响(n＝3)

实施例5:两性霉素B立方液晶纳米粒液晶结构的表征(Cryo-TEM、SAXS)

采用冷冻透射电镜(Cryo-TEM)和X射线小角散射观察实施例1处方1-9中制备的两性霉素B立方液晶纳米粒的形态和粒子大小。

冷冻透射电镜。将4μL实施例1中处方1-9的两性霉素B立方液晶纳米粒溶液滴加到铜网上，滤纸吸取液体大约3s，直至立方晶纳米粒完全吸附固定在铜网上形成薄膜，用磷钨酸负染后，迅速放到液态乙烷中速冻，速冻后的铜网放置在冷阱，-172℃下透射电镜观察立方液晶纳米形态，CCD拍摄照片。

结果见图2，两性霉素B立方液晶纳米粒冷冻电镜图显示平均粒径在250nm左右，与Zetasizer Nano ZS90测得粒子大小基本一致；大量有序的立方液晶纳米粒，呈现圆整的形状，图中右上角3个亮点代表立方液晶内部空隙通道，显示纳米粒子具有典型的立方液晶结构。

X射线小角散射。将空白的立方液晶纳米粒与实施例1处方1-9中的两性霉素B立方液晶纳米粒溶液填充到直径1mm的石英毛细管中，射线照射60min。采用Anton Paar小角X-散射仪，散射光源为Cu，X射线波长为0.1542nm，散射角测量范围为q＝0.05～6nm-¹。

结果见图3和4，图3显示1200bar均质9次后的两性霉素B立方液晶纳米粒在出现谱线峰，对应于密勒指数h k l＝110,111和200，显示60mg的两性霉素B制备的两性霉素B立方液晶纳米粒仍具有Pn3m立方液晶结构。两性霉素B立方液晶纳米粒的X-小角衍射在出现衍射峰的峰宽明显大于图4中的空白立方液晶纳米粒的X-小角衍射在出现衍射峰的峰宽，且两性霉素B立方液晶纳米粒的X-小角衍射在的衍射峰消失，显示两性霉素B参与影响立方液晶的形成。

实施例6:两性霉素B立方液晶纳米粒的肠液稳定性实验

考察两性霉素B立方液晶纳米粒在肠液中的稳定性。

人工模拟肠液的配制:取磷酸二氢钾6.8g，加水500～800mL使之溶解，用1mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至7.5，另取胰酶10g加水适量使溶解。将两液混合后，加蒸馏水定溶至1000mL，即得人工肠液，备用。

准确量取0.5mL实施例1处方1-9制备的两性霉素B立方液晶纳米粒溶液，用人工模拟肠液定容至50mL，避光放置于恒温震荡器中，37℃水浴，振摇速度100r/min。分别在30min、60min、120min、240min取0.5ml样品，甲醇稀释定溶至5ml，0.22μm滤膜过滤，高效液相色谱测定两性霉素B含量，方法同实施例3。

两性霉素B脱氧胆酸钠模拟肠液实验对照组：取两性霉素B脱氧胆酸钠用蒸馏水定溶至2mg·mL^-1。取稀释液0.5mL，人工模拟肠液定溶至50mL，其余步骤同上。

结果见图5。两性霉素B立方液晶纳米粒和两性霉素B脱氧胆酸钠中的两性霉素B含量在模拟人工肠液中温浴0.5小时后分别降到81.83±2.51％和78.56±8.96％，两组数据没有统计学差异(P>0.05)；但随着作用时间增加到1小时，两性霉素B立方液晶纳米粒与两性霉素B脱氧胆酸钠中的两性霉素B分别是82.40±3.92％和69.30±6.70％(P<0.05)，两性霉素B立方液晶纳米粒中的两性霉素B的稳定性明显高于对照组两性霉素B脱氧胆酸钠；当作用时间增加到3小时，两性霉素B稳定性差异更为显著。以上结果说明本发明的两性霉素B立方液晶纳米粒在人工肠液中具有保护两性霉素B的作用，避免两性霉素B的降解。

实施例7:两性霉素B立方液晶纳米粒的稳定性

考察实施例1处方1-9以及对比例1、2和3中所制备的两性霉素B立方液晶纳米粒的稳定性。在室温下放置1个月，分别在15天、30天取样，测定两性霉素B立方液晶纳米粒的粒径和包封率。方法分别同实施例3。

结果见表5。两性霉素B立方液晶纳米粒在室温下放置30天，外观乳黄均匀溶液，未见聚集、絮凝，显示良好的物理稳定性。结果显示第15天两性霉素B立方晶纳米粒的粒径和包封率基本没有变化，第30天两性霉素B立方液晶纳米粒的粒径有轻微增加，同时包封率有下降趋势。未加稳定剂的对比例2制备的两性霉素B立方液晶纳米粒在30天内出现了较为严重的聚集现象，由于纳米粒不稳定，因此包封率也出现明显的下降。稳定剂含量过高的对比例1由于立方液晶结构的破坏，也出现聚集和包封率下降的情况。对比例3中采用了泊洛萨姆188作为稳定剂，同样可观察到稳定性的下降。实施例1-9和对比例制备的两性霉素B立方液晶纳米粒的稳定性结果与实施例3中的粒径和包封率的结果一致。

表5两性霉素B立方液晶纳米粒的粒径分布与包封率(n＝3)

实施例8:载两性霉素B立方液晶纳米粒的体外释放行为

采用透析袋法考察载药立方液晶纳米粒的体外释放。取实施例1处方1-9中的两性霉素B立方液晶纳米粒1mL和0.25％十二烷基硫酸钠溶液1mL共同置于透析袋内(SMI公司,截留相对分子质量3500Da)，密封后将其放置于15mL释放介质的50mL塑料离心管中。两性霉素B不溶于水，采用0.25％十二烷基硫酸钠溶出介质满足两性霉素B体外释放实验的漏槽条件。然后置于37℃、100rpm的恒温震荡器中，分别于1、2、4、8、12、24、48、72、96h取样，塑料离心管中的释放介质全部取出，并同时加入同体积的新鲜释放介质。取不同时间点1mL的释放介质用甲醇定溶至5mL，高效液相色谱法测定释放介质中的两性霉素B含量，条件同实施例3，绘制释放曲线。

两性霉素B脱氧胆酸钠体外释放实验对照组：取两性霉素B脱氧胆酸钠用蒸馏水定溶至2mg·mL^-1。取两性霉素B脱氧胆酸钠的稀释液1mL和0.25％十二烷基硫酸钠溶液1mL共同置于透析袋内，其余步骤同上。

结果见图6。结果显示两性霉素B立方液晶纳米粒的体外释放比较慢，1小时为2.64±0.61％，96h仅为12.37±3.87％，而对照组两性霉素B脱氧胆酸钠在1小时的体外释放为12.80±2.16％，96h体外释放达61.64±3.60％。两性霉素B立方液晶纳米粒体外释放显著低于两性霉素B脱氧胆酸钠对照组，显示药物没有从纳米粒中释放，而是与载体一起穿越胃肠道的屏障，被摄取吸收，避免了其在胃肠道中释放，遭遇降解或析出晶体沉淀。

实施例9:两性霉素B立方液晶纳米粒的药代动力学研究

考察实施例1处方1-9制备的两性霉素B立方液晶纳米粒的药代动力学特点。取SD雄性大鼠，给药前禁食12h，自由饮水。24只大鼠随机分成4组：第一组以10mg/kg剂量的实施例1处方1-9的两性霉素B立方液晶纳米粒给予大鼠灌胃作为实验组1；第二组以20mg/kg剂量的实施例1处方1-9的两性霉素B立方液晶纳米粒给予大鼠灌胃作为实验组2；第三组以10mg/kg剂量的对比例4的两性霉素B立方液晶纳米粒给予大鼠灌胃作为对照组1；第四组以10mg/kg剂量的两性霉素B脱氧胆酸钠给予大鼠灌胃作为对照组2。给药后1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、120h眼眶取血约0.5mL，全血置于涂有肝素的干燥离心管中，8000rpm离心l0min分离血浆，-20℃保存至分析测定。准确吸取血浆0.1mL于1.5mL离心管中，加入甲醇100μl，旋涡混合30s，加入乙腈100μl，旋涡混合30s后，4℃冰箱放置5min充分沉淀蛋白,16000pm离心10min,取上清液200μl，25μl进样测定。HPLC测定两性霉素B的含量。

HPLC条件如下：色谱柱：Phenomenex luna C18(250x4.6mm，5μm)，流动相：乙腈：0.01mol/L pH6.2磷酸缓冲液40:60，柱温35℃，检测波长406nm，流速：1.0mL·min-1，进样量：25μl。血药浓度数据采用PKSolver V2.1药代动力学软件包(中国药科大学)进行处理。根据血药浓度，计算出两性霉素B口服后的血浆药物峰浓度C_max、达峰时间T_max、消除半衰期t_1/2、药时曲线下面积AUC_0-120等动力学参数。

药动学参数见表6。血药浓度曲线见图7。结果表明，SD大鼠体内血药浓度结果显示两性霉素B立方液晶纳米粒口服给药后与同剂量的两性霉素B脱氧胆酸钠对照组相比，口服生物利用度提高了285％。血药中两性霉素B的达峰时间由两性霉素B脱氧胆酸钠对照组口服给药后的6.3h提高到两性霉素B立方液晶纳米粒口服给药后的26h。两性霉素B血药检测时间由两性霉素B脱氧胆酸钠对照组口服给药后的2天延长到两性霉素B立方液晶纳米粒口服给药后的5天，显示两性霉素B立方液晶纳米粒能够粘附在胃肠壁起到一定缓释作用。两性霉素B立方液晶纳米粒口服剂量由10mg/kg增加到20mg/kg，血药浓度增加不明显。采用二油酸甘油酯作为液晶材料与统计量的植烷三醇液晶纳米粒相比，其药时曲线下面积相对较低，达峰时间也提前。

表6两性霉素B口服后的药代动力学参数(n＝6)

C_max：血浆药物峰浓度，T_max：达峰时间，t_1/2：消除半衰期，AUC_0-120：药时曲线下面积。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。