秦皮素在制备治疗疫病结肠癌的药物中的应用的制作方法

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种中药的用途，即秦皮素具有抗结肠癌作用的用途。

背景技术：

大肠癌(包括结肠癌和直肠癌)，是临床上常见的消化系统恶性肿瘤之一。在我国，近30年来，结直肠癌发病率年均上升3％～4％，结直肠癌发病率和死亡例数分别占到全世界发病和死亡例数的18.6％和20.1％，均居第一位。尽管从二十世纪九十年代中期开始，大肠癌的全球发生率逐年下降，但是自1992年起，大肠癌在50岁以下人群中的发生率却在以每年1.8％的比例升高。因此，大肠癌治疗仍然是全球肿瘤研究的重要方向。

传统肿瘤治疗方案专注于去除肿瘤部位细胞。以往的研究中合成了许多作用明确的化学抗癌药，但是由于化学药品的开发费用昂贵，且毒副作用大，往往制约了药物的进一步应用。中草药、植物药等天然产物中存在着广泛的生物活性物质，其抗肿瘤活性越来越受医药界重视。并且，随着中药药理学、免疫学、细胞生物学、分子生物学等多学科研究方法和技术手段的发展，中药抗肿瘤的分子机制逐渐被揭示。中药能通过诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫功能、逆转癌细胞多重耐药作用等多种机制发挥抗肿瘤作用。

秦皮素(Fraxetin,FR)是一种天然香豆素类化合物，主要来源于木犀科大叶白蜡树、小叶白蜡树的树皮，化学名称为7,8-二羟基-6-甲氧基香豆素，其结构式见图1。已有研究报道，秦皮素具有抗菌、抗氧化和抗骨质疏松等多种生理活性，目前在临床上用于治疗儿童急性菌痢。

赵婧晖等人发现，秦皮素能够通过抑制表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，简称为EGFR)及其下游的AKT信号通路抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖及迁移。EGFR是上皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体，其作用非常广泛，在细胞的生长、增殖和分化等多种生理过程中发挥重要的作用(赵婧晖,谢鲲鹏,隋佳琪,等.秦皮素通过抑制EGFR及其下游AKT信号通路抑制MCF-7细胞增殖及迁移[J].中国生物化学与分子生物学报,2016(1):56-63.)。在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达，EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。秦皮素抑制EGFR产生的影响大而广泛，缺少明确的靶点；其次，由于EGFR在正常细胞中同样也有表达，因此有可能同样对正常细胞产生影响，其作用的选择性不明确。

英国科学家Hickman J A首次提出可以将诱导肿瘤细胞凋亡作为以后肿瘤治疗研究的主要目标和手段，随后诱导肿瘤细胞凋亡成为筛选抗癌药物的新靶点和新热点。(Hickman J A.Apoptosis induced by anticancer drugs[J].Cancer and Metastasis Reviews,1992,11(2):121-139.)

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有抗结肠癌作用的药物，该药物通过诱导肿瘤细胞凋亡进而抑制结肠癌细胞生长，从而达到具有治疗结肠癌的目的。

相对于秦皮素通过抑制EGFR信号通路发挥抗乳腺癌作用，本发明提供的秦皮素抗肿瘤机制更加具体，靶点更加明确。

本发明保护的是秦皮素在制备治疗疫病结肠癌的药物中的应用。

秦皮素(标准品，纯度98％)购于江苏省食品药品检验所，为淡黄色片状结晶。本发明中，将DMSO作为秦皮素的溶剂，配制2mg/mL的溶液，并将其保存于-20℃环境中。根据实验需求，利用RPMI-1640培养基将原溶液稀释到不同浓度(终浓度分别为3.75、7.5、10、15、20、30、40、60、80、120μM)进行实验。

本发明中，首先利用MTT法检测了秦皮素对人结肠癌HCT116细胞的体外生长抑制活性，并计算得到其对HCT116的IC50值为40μM，确定了秦皮素对人结肠癌细胞具有良好的抑制活性；同时，利用显微镜拍照技术，观察了给药后细胞形态的变化，发现秦皮素在15μM时即对细胞形态产生影响，具体表现为细胞皱缩，边缘不清晰，贴壁细胞数明显减少。为了检测秦皮素对结肠癌细胞的抑制作用是否具有时间以及剂量依赖性，发明人利用不同浓度(20、40、80μM)的秦皮素分别作用不同时间(24、48、72h)，观察细胞的存活率。实验发现，秦皮素对人结肠癌HCT116细胞的抑制作用具有明显的时间和剂量依赖性，即相同时间条件下，秦皮素剂量越高抑制效果越好；相同剂量条件下，秦皮素作用时间越长抑制效果越好。在充分确定了秦皮素对结肠癌细胞的抑制作用后，发明人又对其作用机制进行了研究。具体为，利用流式细胞术检测了不同剂量秦皮素对肿瘤细胞凋亡的影响。流式结果图显示，秦皮素能够诱导肿瘤细胞凋亡，且具有剂量依赖性，即秦皮素剂量越高，凋亡细胞比例越高。由此，确定了秦皮素抑制结肠癌细胞的作用机制，即通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。最后，为了确定秦皮素是否对正常细胞具有毒性，发明人利用小鼠脾淋巴细胞进行实验，加入不同浓度秦皮素(0、3.75、7.5、15、30、60μM)观察小鼠脾细胞的存活率。实验结果显示，秦皮素在60μM范围内，对正常小鼠的脾细胞没有明显毒性，即证明秦皮素对正常哺乳动物细胞的毒性很小。由此说明，秦皮素的作用具有选择性，在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞的毒性极小。

本发明公开秦皮素主要应用于医药生物领域，具体为秦皮素具有明显的抑制人结肠癌细胞生长的作用，可用来作为/制备抗结肠癌药物。

本发明中发现，秦皮素主要通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥其抗结肠癌的作用。细胞凋亡在多种正常生理过程中可起到调节作用，若此功能出现异常或缺失则可导致一系列病理情况发生。肿瘤细胞的特征之一就是缺乏这种程序性的死亡过程。

结肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，发病率占胃肠道肿瘤的第3位，死亡率仅次于肺癌和肝癌，占我国恶性肿瘤第三位。目前常用的治疗手段为放疗和化疗，其中五氟尿嘧啶为最主要的化疗药物。近几年，免疫治疗也作为一种治疗手段进入人们视野，其中诱导肿瘤细胞凋亡作为一种免疫治疗手段备受关注。本发明中提供的秦皮素即通过诱导肿瘤细胞凋亡从而发挥其抗结肠癌的作用。

针对赵婧晖等人的研究，即秦皮素通过抑制EGFR及其下游的AKT信号通路来发挥抗乳腺癌的作用，鉴于EGFR作用的广泛性，该研究中所述秦皮素的作用靶标并不明确且并未探讨秦皮素对于正常细胞的作用。因此，相对于秦皮素通过抑制EGFR信号通路发挥抗乳腺癌作用，本发明提供的秦皮素抗肿瘤机制更加具体，靶点更加明确，即通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用，且该发明提供了秦皮素在发挥诱导肿瘤细胞凋亡作用的同时，对正常哺乳动物细胞的毒性极小。

有益效果：所述秦皮素抗人结肠癌HCT116细胞的效果明显，其量效关系显著；在低剂量15μM时即对肿瘤细胞形态产生影响；对人结肠癌HCT116细胞的抑制作用具有明显的时间和剂量依赖关系，可以通过加大剂量和延长作用时间更好地抑制肿瘤细胞生长；诱导人结肠癌HCT116细胞凋亡作用明显，在40μM时，凋亡细胞比例达到20％；在60μM以内，对原代小鼠脾细胞没有明显毒性，即本发明的秦皮素对哺乳动物细胞的毒性极小，在杀伤肿瘤细胞时，对正常细胞的杀伤不明显，说明其作用具有选择性。

附图说明

图1是秦皮素的化学结构式

图2是秦皮素对人结肠癌HCT116细胞的体外生长抑制作用

图3是秦皮素对人结肠癌HCT116细胞形态的影响

图4是秦皮素对人结肠癌HCT116细胞抑制作用的量效和时效关系

图5是秦皮素对人结肠癌HCT116细胞凋亡的影响

图6是秦皮素对原代小鼠脾细胞的毒性

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明。

实施例1：秦皮素对人结肠癌HCT116细胞的体外生长抑制作用

胰酶消化对数生长期的人结肠癌HCT116细胞(上述细胞使用含有10％FBS的RPMI-1640培养基培养)，用培养基调整细胞浓度为5×10⁴个/mL的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔加入细胞悬液100μL，每组设6个复孔。置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中继续培养24h。待细胞贴壁后，实验组加入用培养基稀释的不同浓度的秦皮素10μL/孔(终浓度分别为7.5、15、30、60、120μM)。实验设置含RPMI-1640全培养基对照和未给予药物作用的空白对照。37℃、5％CO₂培养48h后，每孔加入5mg/mL的MTT 15μL，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中继续培养4h。离心，小心吸去上清，每孔加入150μL DMSO，轻轻振荡使甲臜完全溶解，在490nm波长处用酶标仪测吸光值并计算细胞存活率。

结果见图2，图2表明，在120μM浓度范围内秦皮素对人结肠癌HCT116细胞有明显的抑制作用，且量效关系明显，即药物浓度越高，抑制效果越好。根据图2数据计算得到秦皮素对HCT116细胞的IC50值为40μM，该数值较低，说明秦皮素对人结肠癌HCT116的抑制作用明显。

实施例2：秦皮素对人结肠癌HCT116细胞体外形态学变化影响

取对数生长期的HCT116细胞，用含有10％FBS的RPMI-1640培养基调整细胞浓度为5×10⁴个/mL，均匀铺至96孔培养板中，每孔加入细胞悬液100μL，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养24h。待细胞贴壁后，加入用培养基稀释的不同浓度秦皮素10μL/孔(终浓度分别为0、3.75、7.5、15、30、60、120μM)，培养液调零，37℃、5％CO₂培养箱继续培养48h。培养结束后，置于倒置显微镜下观察细胞形态变化，并拍照。

按照上述方法，结果如附图3所示，秦皮素在15μM之后即对细胞形态产生明显的变化。具体表现为：细胞皱缩，边缘不清晰，贴壁细胞数明显减少。

实施例3：秦皮素对人结肠癌HCT116细胞体外生长抑制的时间和剂量依赖关系

取对数生长期的人结肠癌HCT116细胞，用含有10％FBS的RPMI-1640培养基调整细胞浓度为5×10⁴个/mL，于96孔培养板中加入细胞悬液100μL，并加入用培养基稀释的不同浓度的秦皮素10μL/孔(终浓度分别为0、10、20、40μM)，培养液调零，37℃、5％CO₂培养不同时间(24h、48h、72h)，培养结束后，每孔加入5mg/mL的MTT 15μL，继续培养4h。离心，小心吸去上清，每孔加入150μL DMSO，轻轻振荡以使甲臜完全溶解，在490nm波长处用酶标仪测吸光值，计算细胞活率。

结果如图4所示，表明秦皮素对人结肠癌HCT116细胞的抑制作用具有明显的时间和剂量依赖关系。随着时间增加，相同剂量下秦皮素对HCT116细胞的抑制作用加强。在相同时间下，随着剂量增加，秦皮素对HCT116细胞的杀伤作用明显增强。

实施例4：秦皮素对人结肠癌HCT116细胞凋亡的影响

取对数生长期的HCT116细胞，用含有10％FBS的RPMI-1640培养基调整细胞浓度为5×10⁴个/mL，均匀铺至6孔培养板中，每孔加入细胞悬液2mL，并加入用培养基稀释的不同浓度的秦皮素20μL/孔(终浓度分别为0、10、20、40μM)，培养液调零，37℃、5％CO₂培养48h。培养结束后，小心吸去上清，用不含EDTA的胰酶消化，300g，4℃离心5min收集细胞。用预冷的PBS洗涤细胞两次，每次均在300g，4℃离心5min。收集5×10⁵细胞。加入100μL 1×Binding Buffer重悬细胞。加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI staining solution，轻轻混匀，避光，室温反应10min。加入400μL 1×Binding Buffer，混匀，用流式细胞仪进行检测并计算凋亡细胞比例。

结果如图5所示，图5表明秦皮素体外对人结肠癌HCT116细胞杀伤作主要是通过诱导其凋亡。流式细胞仪检测结果表明，秦皮素在10μM之后，诱导HCT116细胞凋亡作用明显，且具有明显的剂量依赖关系，即药物浓度越高，凋亡细胞越多。

实施例5：秦皮素对原代小鼠脾细胞的影响

取ICR雄性小鼠一只，颈部脱臼处死，无菌制备脾淋巴细胞悬液，用含有10％FBS的RPMI-1640培养液重悬，置细胞瓶中培养过夜，于24h后，取上层悬浮细胞，离心后调整细胞浓度为5×10⁶个/mL，接种于96孔培养板中，每孔100μL细胞悬液，然后加入各浓度梯度药物(终浓度分别为0、3.75、7.5、15、30、60μM)，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中继续培养。48h后每孔加入5mg/mL的MTT 15μL，继续培养4h。离心弃上清，每孔加入150μL DMSO，酶标仪490nm处测吸光值。

结果见图6，图6表明低浓度(60μM以内)秦皮素对原代小鼠脾细胞无明显毒性，即低浓度秦皮素对哺乳动物细胞的杀伤很小。