盐酸石蒜碱在治疗肺纤维化中的应用的制作方法

本发明涉及盐酸石蒜碱(lycorinechloride)的一种新用途，具体涉及盐酸石蒜碱在治疗肺纤维化中的应用。
背景技术：
：肺纤维化的发生与多种因素有关，包括吸烟，空气污染，自身免疫性疾病，病毒，不当的治疗方法等。如：sars病毒可使部分患者发生纤维化，治疗过程中大量抗菌素的使用可加速纤维化的进程，导致严重后遗症。特发性肺纤维化(idiopathicpulmonaryfibrosis,ipf)是肺纤维化疾病中最常见、最严重、也是最难治的一种疾病，这是一种进行性发展、致死性的、病因不明的间质性肺疾病。其特征是肌纤母细胞大量聚集和胶原等细胞外基质(ecm)过度积累而形成的散布在肺间质中并不断扩展的纤维化灶(fibroblastfoci)。在低倍镜下，肺组织表现异质性，即正常组织中夹杂病变区域(包括间质炎症,纤维化和蜂窝样改变)，组织病理呈现普通型间质性肺炎(usualinterstitialpneumonia，uip)特征。纤维化灶处，肺泡和肺间质组织发生异常重构，随着病情的发展，纤维化灶的数量增多，区域连续扩大，患者肺通气功能损害严重，出现进行性呼吸困难，最终将导致死亡。传统临床治疗以糖皮质激素和免疫抑制剂为主，但效果均不理想且有严重副作用；近些年尝试的三药联用(prednisone、azathioprine和nac)也被证实增加死亡危险和住院率。ipf是一种在世界范围内都难以治疗的疾病，预后极差，其平均生存率只有2.8年，约70％～80％的病人在确诊后的5年内死去，死亡程度甚至比很多癌症更高。伴随近年经济建设发展而来对环境的影响，肺纤维化的发病率在包括中国和美国在内的很多国家中处于持续增长状态。由于肺纤维化的发病机制尚未阐明，目前临床缺乏有效的药物和治疗手段延长患者生命或提高其生活质量。因此阐明纤维化的发生发展机制是提高其防治水平的关键，同时也有利于探索新的潜在的药物靶点，对于开发有效抗纤维化治疗方法具有重要的社会意义和医学意义。肺纤维化成因复杂，tgf-β是目前已知最重要的一类促肺纤维化因子，在肺纤维化发病过程中起着重要的中心调控作用。tgf-β1是一个多功能的生长因子，以组织特异，或细胞特异的方式参与调控生命过程。tgf-β1在组织损伤修复过程中起非常重要的作用，通过诱导下游smad或非smad信号途径的活化，从而促进纤维化的发生发展。tgf-β1在调控上皮细胞损伤和凋亡，myofibroblasts增殖、分化和迁移，增加myofibroblasts群规模,促进ecm的合成等肺纤维化的各个过程中显示重要的促进作用。目前已经有实验证明过表达tgf-β1的转基因小鼠可自发形成肺纤维化。很多分子和信号参与调节tgf-β1信号通路，如：ctgf,integrin,erkmapk,通过局部特异性的影响tgf-β1的活化，配体-受体相互作用，以及通路中酪氨酸激酶的活性，调节tgf-β1的功能。tgf-β及其下游信号在ipf的发病机制中的关键作用，使之成为一个有吸引力的治疗目标。然而，由于tgf-β在正常组织稳态中的多效性，使得在治疗中完全抑制tgf-β将会产生严重的副作用。确定和靶向tgf-β信号的组织或疾病特异性的调控机制是近年来肺纤维药物研发重点。例如整合素αvβ6在肺纤维化发病时表达上调，可在肺局部微环境中结合并激活tgf-β前体。低剂量的整合素αvβ6抗体并不影响肺泡炎症细胞数以及巨噬细胞活化标志物，但可显著抑制胶原沉积以及肺纤维化。相关问题的阐述有利于肺纤维化机制深入研究，同时可调节tgf-β1功能的天然药物活性小分子的发现将对肺纤维化乃至多种脏器纤维化药物治疗的开发提供理论基础。尽管近年来在肺纤维化的治疗领域已经取得了诸多进展，但是许多治疗方案仍然无法获得令人满意的疗效。在世界范围，尤其是中国，肺纤维化的治疗仍然是临床上亟待解决的课题之一。因此，本领域非常需要多种药物来治疗肺纤维化。目前，本领域中用于抑制tgf-β，从而抑制肺纤维化的治疗选择非常有限。石蒜碱是存在于石蒜科植物石蒜的鳞茎内的生物碱。随着近年来对石蒜属生物碱药用的不断研究，发现了许多新的治疗作用。这些生物碱，如盐酸石蒜碱，不仅具有抗炎、抗菌、抗癌作用，还具有抑制胆碱酯酶和兴奋神经肌肉作用，在医学上被用于心血管疾病及老年痴呆症的治疗。截至目前，尚无盐酸石蒜碱能够抑制tgf-β信号通路以及减缓肺纤维化的相关报道。技术实现要素：本发明公开的盐酸石蒜碱在制备治疗肺纤维化的组合物的用途。本发明公开的盐酸石蒜碱在制备治疗肺纤维化的组合物的用途，盐酸石蒜碱的用量为10mg/kg。本发明公开的盐酸石蒜碱减缓博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化，为治疗、缓解或改善纤维化肺疾病或症状提供巨大的应用前景。本发明公开的盐酸石蒜碱在制备治疗肺纤维化的组合物的用途，制备药物、保健品、或功能性食品的应用。本发明公开的盐酸石蒜碱在制备治疗肺纤维化的组合物的用途，赋形剂或载体为制药或食品领域中常用的赋形剂或载体，如稀释剂，崩解剂，润滑剂。本发明公开的盐酸石蒜碱在制备治疗肺纤维化的组合物的用途，通过口服或注射形式使用。附图说明图1:盐酸石蒜碱抑制tgf-β1诱导的肌纤维母细胞分化图2：盐酸石蒜碱减轻博莱霉素所诱导的羟脯氨酸合成具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室指南(纽约，冷泉港实验室出版社，newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。实施例1盐酸石蒜碱抑制tgf-β1诱导的肌成纤维母细胞分化本实例所用细胞为小鼠肺成纤维细胞系mlg，从americantypeculturecollection(atcc)获得。mlg成纤维细胞长满后，0.1％血清处理24小时后，加入5ng/mltgf-β1蛋白和终浓度为5μmol/l盐酸石蒜碱或相同体积dmso对照。处理12小时收集rna进行实时荧光定量pcr检测α-sma；处理24小时后收集细胞利用westernblotting检测α-sma蛋白的表达。实时荧光定量pcr是指从细胞中利用trizol(invitrogen)制备总rna，利用thermoscriptrt-pcr试剂盒(invitrogen)合成cdna，使用sybrgreen试剂盒(roche)检测α-sma的表达。基因相对表达利用2-δ(δct)方法进行计算，β-actin作为内参。各基因引物列于表二。westernblotting检测是指细胞用ripa裂解液裂解获得细胞总蛋白。利用bca系统(pierce)测定蛋白浓度。细胞蛋白中加入samplebuffer，100度变性，利用sds-page胶分离蛋白。将蛋白湿转到pvdf膜(roche)上，牛奶封闭后，一抗4度孵育过夜，含0.1％的tbs溶液洗后，hrp酶标二抗室温孵育2小时。利用ecl系统(pierce)检测蛋白表达量。用于westernblotting的一抗：α-sma和β-actin(sigma)。我们发现在tgf-β1处理小鼠肺成纤维细胞这一体外模型下，盐酸石蒜碱能够明显抑制tgf-β1所诱导的α-smamrna和蛋白的表达(表三，图1)，表明盐酸石蒜碱能抑制tgf-β1诱导的肌成纤维母细胞分化。图1为盐酸石蒜碱抑制tgf-β1诱导的肌纤维母细胞分化。小鼠成纤维细胞mlg长满后，0.1％血清处理24小时后，加入5ng/mltgf-β1蛋白和终浓度为5μmol/l盐酸石蒜碱或相同体积dmso对照，之后检测肌纤维母细胞中a-sma(a)mrna和(b)蛋白的水平。表二引物序列基因前引物后引物α-smagctggtgatgatgctcccagcccattccaaccattactccβ-actinaggccaaccgtgaaaagatgagagcatagccctcgtagatgg表三盐酸石蒜碱抑制tgf-β1诱导的α-smamrna表达实施例2盐酸石蒜碱减缓博莱霉素诱导的肺纤维化肺纤维化动物模型制备是指雄性c57bl/6j(周龄8-10周)野生型小鼠，以7.5％水合氯醛按0.6ml/100g腹腔(i.p.)注射麻醉小鼠，气管内注射博莱霉素2.5u/kg。具体方案如下：称量体重并记录后将小鼠固定于操作台，颈部用70％酒精消毒，利用手术刀在小鼠颈部垂直划开大约1cm长，利用显微镊分离组织暴露气管，将注射器经气管软骨环间隙朝向心端刺入气管，然后按2.5u/kg的计量缓慢注入与其体重相适应体积的博莱霉素生理盐水溶液，立即将动物直立并左右旋转，使药液在肺内均匀分布。盐酸石蒜碱治疗是指在博莱霉素处理第7-14天时，通过腹腔注射10mg/kg盐酸石蒜碱，以相应溶剂羧甲基纤维素钠(cmc-na)作为对照；博莱霉素处理14天后，检测肺纤维化及胶原含量。羟脯氨酸含量测定是指小鼠在博莱霉素注射14天处死小鼠，取右肺，剔除支气管，放于5ml安瓿瓶，烘干，酸水解，调整其ph到6.5-8.0，过滤残渣，pbs调整其总体积为10ml，取50μl样品，加入350μl去离子水，加入200μl氯胺t(chloraminet)溶液室温孵育20分钟；加入200μl高氯酸(perchloricacid)室温孵育5分钟；加入200μl对二甲氨基苯甲醛(p-dmab)65℃孵育20分钟。取200μl至96孔板中测定样品557nm的吸光值，利用标准品读数绘制标准曲线，进而利用标准曲线所得公式求得所测样品羟脯氨酸浓度cs。按以下公式换算为全部右肺所含羟脯氨酸的量w：w＝cs×8(所测样品稀释倍数)×10(样品总体积)。博莱霉素(2.5u/kg)处理c57bl/6j小鼠诱导肺纤维化发生，处理后第7-14天经腹腔注射盐酸石蒜碱或相对应的溶剂cmc-na，小鼠在博莱霉素处理14天后取肺组织观察纤维化程度(图2a)。对小鼠肺组织切片进行h&e染色，发现注射盐酸石蒜碱的小鼠肺纤维化程度低于注射cmc-na的小鼠(图2b)。与注射cmc-na的小鼠相比，注射盐酸石蒜碱的小鼠肺组织中羟脯氨酸的含量明显降低(表四，图2c)，这说明盐酸石蒜碱确实能够减轻博莱霉素所诱导的胶原含量。图2为盐酸石蒜碱减轻博莱霉素所诱导的小鼠肺纤维化。(图2a)盐酸石蒜碱处理小鼠的图示。2.5u/kg博莱霉素处理c57bl/6j小鼠后，第7-14天经腹腔注射10mg/kg盐酸石蒜碱或相对应的溶剂羧甲基纤维素钠(cmc-na)，博莱霉素处理14天后取样检测；(图2b)h&e染色验证新橙皮苷抑制博莱霉素诱导的进行性肺组织纤维化。标尺：100μm；(图2c)羟脯氨酸检测验证盐酸石蒜碱抑制博莱霉素诱导的肺组织中胶原合成。*,p<0.05，即统计学上具有显著性差异。表四盐酸石蒜碱抑制博莱霉素诱导的羟脯氨酸(微克/右肺)实施例3盐酸石蒜碱的制剂盐酸石蒜碱片剂盐酸石蒜碱5mg,淀粉92g,硬脂酸镁3g制备工艺：取盐酸石蒜碱过100目筛，加淀粉、硬脂酸镁混合均匀，制成颗粒，干燥，压片，即得。盐酸石蒜碱胶囊盐酸石蒜碱5mg,预胶化淀粉92g,硬脂酸镁3g制备工艺：取盐酸石蒜碱过100目筛，加预胶化淀粉、硬脂酸镁混合均匀，制成颗粒，干燥，装胶囊，即得。盐酸石蒜碱注射液盐酸石蒜碱43mg，注射用氯化钠7mg制备工艺：取盐酸石蒜碱过100目筛，加1.9ml注射用水溶解，加入注射用氯化钠至等渗，调节ph值至8.0，滤过，冷藏24小时，加注射用水至规定量，滤过，灌封，灭菌，即得。当前第1页12