PDK1抑制剂、含有该抑制剂的组合物及用途的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体而言，涉及一种pdk1抑制剂、含有该抑制剂的组合物及用途。

背景技术：

1920年中世纪大萧条时期，农夫们发现大量牛羊死于异常出血。兽医与农夫们共同寻找原因，最终锁定了一种被当做饲料的植物即草木犀。威斯康星农业大学的卡尔·林克和他的学生们用了6年的时间将这种植物提纯，最终找到了使得血液不能正常凝固的物质—香豆素。

1941年，威斯康星校友研究基金会支持了通过氧化香豆素合成具有拮抗维生素k作用的双香豆素这项研究。几乎在同时期，林克将香豆素及其衍生物用作灭鼠剂，同时具有前瞻思维的纽约医院/康奈尔医疗中心的医生欧文莱特将其用于治疗血栓，但由于医生们依然畏惧给予病人灭鼠剂，所以其临床应用仍不广泛。直到1955年，香豆素通过华林法用于治疗心肌梗死开创了先河，自此香豆素类抗凝剂在临床应用中迅猛发展起来。

目前所知，香豆素类衍生物具有抗凝血、抗肿瘤、降压、抗细胞增生、抗菌、抗艾滋病、抗疲劳及增强自身免疫能力等功效，其中双香豆素为临床上实用的抗凝血剂。另外，随着科学的不断发展进步，近年来还发现了双香豆素可作为抗菌剂、hiv-1整合酶、脲酶等的抑制剂。双香豆素为香豆素类抗凝药物，目前临床上一般将其与肝素一起用于深静脉血栓。双香豆素的化学结构与维生素k类似，因此可通过竞争性抑制肝脏对维生素k的利用，进而干扰肝脏对凝血因子的正常合成，而起到抗凝血作用。

要了解双香豆素抗凝作用的机制，则需要对维生素k的代谢有较好的理解。维生素k可由正常饮食及胃肠道菌群产生，吸收入人体内后大部分储存在肝脏中，在nadh醌酮氧化还原酶(nqo1)的作用下可以还原成维生素kh2的形式，维生素kh2在γ羧化酶的作用下可使凝血因子(11，vii，ix，x，蛋白c和s)氨基末端的谷氨酸盐羧化，进而活化凝血因子。维生素kh2此时已被氧化为维生素k环氧化物，其可在维生素k环氧化物还原酶(vkor)的作用下还原成维生素kh2。另外，双香豆素可以与nqo1及vkor相结合，抑制其生物活性，干扰维生素k的代谢，进一步抑制凝血因子的活化，起到抗凝作用。

对于癌症的治疗目前一直是医学领域的一大难题，虽然全世界每年都会有大量的经费投入到癌症的治疗中，然而肿瘤的治疗依然是目前科学界无法取得突破的一个难点。目前临床上常用的抗肿瘤药物主要是细胞毒类药物，而这类药物普遍存在选择性差，毒副作用强，易产生耐药性等缺点。随着医学科技的发展，恶性肿瘤细胞内信号转导、细胞周期调节、细胞凋亡的诱导、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等过程被逐渐阐明。基于此，一些与肿瘤细胞分化增殖及转移相关的细胞信号转导通路的关键酶作为药物筛选的靶点，发现选择性作用于靶点的高效、低毒且特异性强的抗癌药物正逐渐成为一个新的抗癌研究方向。例如，2007年，《癌症细胞》杂质就刊登了一篇关于加拿大阿尔伯塔大学学者的一篇论文，揭示了dca(二氯乙酸钠)的抗癌特性。如今，dca被作为特异性地pdk1抑制剂进而用于肿瘤治疗。然而人们慢慢发现，长期暴露于该药物，易引起外周神经毒性。因此，提供新型的pdk1抑制剂，且不引起外周神经毒性的物质用于肿瘤的治疗中是学者们亟待深入研究的一个新的研究方向和科研思路。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种双香豆素在制备用于治疗和/或预防卵巢癌的药物中的应用，本申请通过探究双香豆素和卵巢癌的关系从而为卵巢癌的治疗或者预防提供了思路，同时也从新的角度解开双香豆素在防治卵巢癌的机制。

更为具体的，在本申请的，双香豆素是通过作为pdk1的抑制剂实现在制备治疗和/或预防卵巢癌的药物中的应用的。对于以nqo1的抑制剂为出发点的肿瘤防治中，值得一提的是，nqo1做为酶，其主要功能是解毒作用，它可以降低活性氧的积累，因此其抑制剂有抗肿瘤的作用。

经过研究发现，双香豆素可以同时抑制sapk及nf-κb的活性，虽然抑制sapk的活性可以上调nqo1缺失细胞nqo1基因的表达进而抗调亡，然而双香豆素抑制nf-κb的活性占主要作用，其抗凋亡作用的减弱间接促进了tnfα诱导的hela细胞的凋亡。事实上，双香豆素抗肿瘤的探讨正逐渐增多，人们研究了其对胶质瘤、乳腺癌、泌尿生殖系统肿瘤、黑色素瘤、肺癌、胰腺癌及粒细胞性白血病等各个系统肿瘤的影响，这些研究中大部分探讨的是双香豆素通过抑制nqo1活性起到抗肿瘤作用。

而在本申请中，开创性地、具体地揭示了双香豆素与卵巢癌的关系，并从新的角度分析了双香豆素防治卵巢癌的机制。双香豆素通过抑制卵巢癌细胞中pdk1活性进而使细胞p-pdh表达下降，并进一步地促进细胞内三羧酸循环，增加了细胞内活性氧簇，细胞内活性氧簇的增加促使线粒体膜电势降低并使得线粒体膜通透性下降、细胞色素c增加，增加了肿瘤细胞内线粒体的凋亡，并导致卵巢癌细胞细胞凋亡(也即本申请所提供的双香豆素其可以扩展至降低细胞p-pdh表达、促进细胞内三羧酸循环、增加细胞内活性氧簇、促使线粒体膜电势降低并使得线粒体膜通透性下降、增加细胞色素c、促使线粒体凋亡等方面新的用途)。

本发明的第二目的在于提供一种pdk1的抑制剂，该抑制剂为双香豆素和/或双香豆素类化合物，现有技术中以往报道的pdk1抑制剂多为二氯乙酸钠，然而二氯乙酸钠长期暴露会造成外周神经毒性，因此存在极大的安全隐患，而本申请提供的新型pdk1的抑制剂-双香豆素或双香豆素类化合物其不但可以对pdk1具有很好的抑制效果，而且还不会引起外周神经毒性，使用安全。

本发明的目的之三在于提供一种活性成份为双香豆素和/或双香豆素类化合物，且用于治疗和/或预防卵巢癌的药物，该药物为卵巢癌的预防或者治疗具有重大的价值。

优选的，该药物包括双香豆素和/或双香豆素类化合物以及药学上可接受的辅料。另外，该药物的剂型可以为现有技术中任一可以实现的剂型，如胶囊剂、丸剂、针剂、颗粒剂和片剂等。

更为具体的，本发明结合双香豆素的抑制效果，还特异性地结合了多种中药组份，实现了以双香豆素和多种活性成分复配并进一步地治疗卵巢癌的药物配制。

所述药物组合物主要包括以重量份数计的如下组份制成：双香豆素50-70份、老牛揣10-40份、火炭母草根25-35份、蜘蛛果20-35份、人工牛黄11-24份、血竭1-5份、人参3-10份、清半夏10-15份、厚朴10-12份、枳壳15-40份、郁金22-35份、茸毛木蓝11-24份、川芎2-4份、白蜡树子10-20份、鱼腥草素2-8份、芝麻素6-12份和萘普生15-20份。

其中，老牛揣，具有清热解毒之效，火炭母草根含有多种氨基酸以及双糖，具有清热解毒，治主体乏力之功效，蜘蛛果具有清热理气，止痛补虚之效。人工牛黄、血竭、人参以及清半夏的配伍可以实现缩减或抑制卵巢肿瘤块的效果，厚朴、枳壳、郁金、茸毛木蓝、川芎和白蜡树子等以特定的组分配伍，互补所短，具有消炎、行气解郁，凉血破瘀之效。更为关键的是，申请人发现白蜡树子与蜘蛛果、老牛揣按照特定比例互配后对于药物组合物抗卵巢癌效果起到了非常关键的效果。此外，鱼腥草素、芝麻素和萘普生等物质与双香豆素互配制剂是本领域中未见先例的，本申请中，最为关键的是，本申请的药物实现了以双香豆素为活性成分，集合了现有技术中具有不同功效的中药组份，通过合理的配伍以辅助实现防治卵巢癌的效果。需要说明的是，在本申请中对于中药组分的选择配伍，一方面在考虑其本身所具备的疗效，另一方面，是出于结合双香豆素以及鱼腥草素、芝麻素和萘普生综合考量所取，以实现配伍后既不与双香豆素药理相克，也不与鱼腥草素、芝麻素和萘普生相克。可以确定的是，双香豆素与鱼腥草素、芝麻素和萘普生的配伍、或者与上述多种中药组分的配伍在本领域中是前所未有的，具有开拓性地。此外，退一步而言，通过实验证明，双香豆素与上述的药物组分特定结合后对于卵巢癌的治疗起到了预料不到的技术效果。

在上述方案的基础之上，为了实现本发明药物制剂的制备，所述药物组合物还包括填充剂8-11份、ph调节剂2-3份(根据剂型可适当选取)和稳定剂4-8份；其中，所述填充剂包括甘露醇、山梨醇或葡糖糖中的一种或多种；ph调节剂包括枸橼酸、乳酸或碳酸氢钠中的一种或多种；稳定剂包括硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、精氨酸、谷氨酸或亚硫酸钠中的一种或多种。

上述辅料的选取是基于主料药物成分而定的，一方面可保证辅料加入后对药物的成型过程起到关键帮助，此外还可确保其加入后对药物的活性效果不带来损害。

另外，本发明还提供了一种实现上述药物组合物制备的方法，包括以下步骤：

1)、将老牛揣、火炭母草根、人参、清半夏、厚朴和枳壳混合后置于质量为混合药材总量3-5倍量的水中煎煮0.8-1.5小时，得到水煎液和药渣，将所述水煎液浓缩成浸膏，并将所述浸膏干燥后粉碎得到第一药粉，将所述药渣干燥后粉碎至60-80目的药渣粉；

2)、将郁金、茸毛木蓝、川芎和白蜡树子混合后粉碎至60-80目，并与所述药渣粉混合后加入至质量为混合粉6-10倍且浓度为95％乙醇中，于80-90℃回流提取，得到醇提液，将所述醇提液浓缩干燥后粉碎，得到第二药粉；

3)、分别将人工牛黄、血竭和蜘蛛果粉碎后混合，得到第三药粉；并将所述第三药粉、第一药粉和第二药粉混合均匀后，超微粉碎至200-350目，得到微粉；

4)、将所述微粉与双香豆素、鱼腥草素、芝麻素和萘普生混合后制剂，得到药物组合物。

上述的方法通过对不同属性药物进行针对性的处理(如对老牛揣、火炭母草根、人参、清半夏、厚朴和枳壳采用以水提为主，醇提为辅；郁金、茸毛木蓝、川芎和白蜡树子则以醇提为主)，通过提取(煎煮、醇提以及结合)、粉碎以及制剂等操作实现了上述特定配伍关系的药物组合物的制备。另外，该制备方法中，对于制备流程以及工艺参数的限定都是基于药物原料的特定组分而特定选择的，若工艺参数稍有不当，则对整个药物组合物的药物影响至关重要，需要说明的是，在步骤1)中，对于煎煮后所得的药渣，进行特定目数要求地粉碎，后与步骤2)中的原料一起进行醇提的操作，可以保证药物成分提供完全，并且还发现该操作易于使得郁金、茸毛木蓝、川芎和白蜡树子等活性成分更加完全地被提取。

此外，超微粉碎不但可以保证所得微粉的制剂需求，还可以进一步地保证所得2种活性粉末中的活性成分不受损害。

优选的，在步骤4)中，具体包括：将微粉与双香豆素、鱼腥草素、芝麻素和萘普生混合后，加入甘露醇、精氨酸以及微晶纤维素，制成胶囊剂、颗粒剂或者片剂中的一种或多种。甘露醇、精氨酸以及微晶纤维素为本申请结合药物原料而特定所限的辅料，便于形成胶囊剂、颗粒剂或者片剂等剂型。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)、提供了双香豆素在制备用于治疗和/或预防卵巢癌的药物中的应用，通过探究双香豆素和卵巢癌的关系从而为卵巢癌的治疗或者预防提供了思路，同时也从新的角度解开双香豆素在防治卵巢癌的机制，此外，还针对性地提供了一种不引起外周神经毒性的pdk1抑制剂。

(2)、解开了双香豆素治疗卵巢癌的具体机制，即双香豆素通过抑制卵巢癌细胞中pdk1活性进而使细胞p-pdh表达下降，并进一步地促进细胞内三羧酸循环，增加了细胞内活性氧簇，细胞内活性氧簇的增加促使线粒体膜电势降低并使得线粒体膜通透性下降、细胞色素c增加，增加了肿瘤细胞内线粒体的凋亡，并导致卵巢癌细胞细胞凋亡，为卵巢癌的治疗和预防提供了坚实的理论资料和临床研究方向。

(3)、本发明以双香豆素作为实现治疗和/或预防卵巢癌的有效成分，并辅以中药提取物以及鱼腥草素、芝麻素和萘普生，从而制成不同的药物制剂。其中，中药原料的配伍合理，提取工艺得当，以该配伍关系以及特定制备工艺所获得的药物组合物对于卵巢癌具有非常明显的治疗效果。

附图说明

图1为双香豆素对pdk1活性影响的检测结果图；

图2为mtt方法检测双香豆素对卵巢癌细胞skov3活力影响结果图；

图3为免疫印迹法检测双香豆素对pdk1活性影响的结果图；

图4-图5为ocr/ecar检测双香豆素对skov3细胞的氧耗及胞外酸化率的影响的结果图；

图6-图7为葡萄糖及乳酸定量实验检测双香豆素对skov3代谢影响的结果图；

图8-图10为流式细胞术检测双香豆素对skov3线粒体膜电势、ros的水平影响的结果图；

图11-图14为双香豆素对肿瘤生长的影响以及抑制异种移植物pdk1活性的检测结果图；

图15-图16为免疫组化tunel实验探究双香豆素抑制肿瘤生长以及通过降低p-pdh表达量反映双香豆素可以抑制pdk1活性的检测结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明制备厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明提供了一种双香豆素在制备用于治疗和/或预防卵巢癌的药物中的应用，通过探究双香豆素和卵巢癌的关系从而为卵巢癌的治疗或者预防提供了思路，同时也从新的角度解开双香豆素在防治卵巢癌的机制。本申请中，双香豆素是通过作为pdk1的抑制剂实现在制备治疗和/或预防卵巢癌的药物中的应用的。更具体的，双香豆素通过抑制卵巢癌细胞中pdk1活性进而使细胞p-pdh表达下降，并进一步地促进细胞内三羧酸循环，增加了细胞内活性氧簇，细胞内活性氧簇的增加促使线粒体膜电势降低并使得线粒体膜通透性下降、细胞色素c增加，增加了肿瘤细胞内线粒体的凋亡，并导致卵巢癌细胞细胞凋亡。

另外，本申请还提供了一种pdk1的抑制剂，该抑制剂是双香豆素和/或双香豆素类化合物，此外，本申请还提供了一种用于预防和/或治疗卵巢癌的药物组合物，药物的活性成分包括双香豆素和/或双香豆素类化合物；该药物包括双香豆素和/或双香豆素类化合物以及药学上可接受的辅料。

作为一种实现方式，该药物组合物以重量分数计，包括双香豆素50-70份、老牛揣10-40份、火炭母草根25-35份、蜘蛛果20-35份、人工牛黄11-24份、血竭1-5份、人参3-10份、清半夏10-15份、厚朴10-12份、枳壳15-40份、郁金22-35份、茸毛木蓝11-24份、川芎2-4份、白蜡树子10-20份、鱼腥草素2-8份、芝麻素6-12份和萘普生15-20份。更进一步地，所述的药物组合物还包括填充剂8-11份、ph调节剂2-3份和稳定剂4-8份；其中，所述填充剂包括甘露醇、山梨醇或葡糖糖中的一种或多种；所述ph调节剂包括枸橼酸、乳酸或碳酸氢钠中的一种或多种；所述稳定剂包括硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、精氨酸、谷氨酸或亚硫酸钠中的一种或多种。

本发明药物组合物的制备方法，包括以下步骤：

将老牛揣、火炭母草根、人参、清半夏、厚朴和枳壳混合后置于质量为混合药材总量3-5倍量的水中煎煮0.8-1.5小时，得到水煎液和药渣，将所述水煎液浓缩成浸膏，并将所述浸膏干燥后粉碎得到第一药粉，将所述药渣干燥后粉碎至60-80目的药渣粉；

将郁金、茸毛木蓝、川芎和白蜡树子混合后粉碎至60-80目，并与所述药渣粉混合后加入至质量为混合粉(具体为药渣粉和郁金、茸毛木蓝、川芎和白蜡树子组成的混合粉)6-10倍且浓度为95％乙醇中，于80-90℃回流提取，得到醇提液，将所述醇提液浓缩干燥后粉碎，得到第二药粉；

分别将人工牛黄、血竭和蜘蛛果粉碎后混合，得到第三药粉；并将所述第三药粉、第一药粉和第二药粉混合均匀后，超微粉碎至200-350目，得到微粉；

将所述微粉与双香豆素、鱼腥草素、芝麻素和萘普生混合后制剂，得到药物组合物。

接下来，本发明基于双香豆素、以其为有效成分制成的药物给出以下具体实施例，另外需要说明的是，本申请所提及的双香豆素购于上海源叶生物科技有限公司。

实施例1

双香豆素对pdk1活性的影响的检测

s11：从abcam购买p-pdha1elisa试剂盒及pdk1活性酶。

s12：按照说明书准备试剂(incubation,washbuffer)，收集、裂解并定量skov3细胞。

s13：将定量后的蛋白加入到96孔板中，250mg/50μl/well，盖上盖子，室温孵育2h(96孔板离心机，300rpm)，吸掉液体，洗2次(300μl1*washbuffer)，最后一次吸掉液体后将其倒扣在干净的纸上去除残余液体。

s14：准备磷酸化溶液以及pdk1加入；

在干净的50ml离心管中加入22ml1*washbuffer,mgcl2(1mm)，atp(2mm)。根据实验组的设计加入pdk1。(在含有200μl磷酸化溶液的ep管中孵育pdk12μg/well，dca50mm+pdk12μg/well，dmso2％+pdk12μg/well，双香豆素100μm+pdk12μg/well，双香豆素200μm+pdk12μg/well)，ep管在30℃水浴锅中孵育1h。

s15：将预热好的药物混合物加入到96孔板，200μl/well，每个组设置3个副孔，孵育10min，30℃(96孔板离心机300rpm)，吸掉液体，洗2次。

s16：50μl1*detector抗体(用1*incubation配好的)孵育1h，室温(300rpm)，吸掉液体，洗2次。

s17：50μl1*hrp标记的二抗(用1*incubation配好的)孵育1h，室温(300rpm)，吸掉液体，洗2次。加入100μltmb，呈蓝色；再加入100μl(1mol/lhci)，呈棕黄色，终止后测od450nm。

检测结果如图1所示，发现双香豆素对pdk1活性起到了一定的影响。

实施例2

mtt方法检测双香豆素对卵巢癌细胞skov3活力的影响

s21：将对数生长期skov3细胞进行消化处理，细胞计数。

s22：取96孔细胞培养板，每孔加入100μl含有8×10³细胞的细胞悬液，设空白调零组每孔只加入100μl不含细胞的培养液。37℃、5％co2孵箱中培养。细胞融合度80％时进行加药处理细胞。

s23：药物处理细胞；

对照组：含有10％fbs的1640细胞培养液100μl/孔；

实验组：单加双香豆素组-药物浓度800μm、400μm、200μm、100μm、50μm、25μm、12.5μm、6.25μm、3.125μm、1.5625μm，进行倍比稀释；终体积均为100μl/孔；每组设5个复孔，37℃、5％co2孵箱中培养24h。

s24：加入浓度为10mg/ml的mtt液体10μl/孔，继续孵育4h，小心弃掉培养液每孔加入150μldmso，在振荡器上震荡5min，让颗粒充分溶解。

s25：利用酶联免疫检测仪检测od570nm处各孔的吸光值，记录结果；吸光度值同细胞生存率成正比，以药物剂量为横坐标、吸光度值为纵坐标，计算细胞存活率。

检测结果如图2所示，发现随着双香豆素添加量的递增，卵巢癌细胞skov3活力明显受到影响。

实施例3

免疫印迹法检测双香豆素对pdk1活性的影响

s31：样本制备；

每次上样蛋白质量为50μg，根据蛋白质浓度计算出每次上样需要的蛋白体积。每次上样终体积为15μl，5×loadingbuffer：(蛋白质体积+补充双蒸水体积)＝1:4，稀释样品，为方便使用、减少误差，每次制备出8次所需样本。混合好样本之后，95℃水浴，10min；37℃水浴，10min。样本保存于-20℃。

s32：配胶；根据配方分别制备相应分离胶、浓缩胶。

s33：电泳；上层浓缩胶100v，25-30min，下层分离胶200v，30-60min，待溴酚蓝指示剂到达胶底部为佳，适当延长或者缩短时间。

s34：切胶和转膜；

根据待检测蛋白的分子量将分离胶切割，利用湿式转膜仪，将胶与pvdf膜、上下各3层滤纸、海绵相叠加，250mm，40-90min不等，转膜时间由蛋白分子量决定，分子量小的蛋白转膜时间适当缩短、分子量大的蛋白转膜时间适当延长。

s35：封闭；

转膜结束后，将膜放入10％脱脂奶粉中，水平摇床室温封闭1h。

s36：一抗孵育；

封闭结束后用pbst洗膜3次，每次10min；加入按比例稀释一抗，4℃过夜(或水平摇床室温1.5h)。

s37：二抗孵育；

一抗孵育结束后用pbst轻柔洗膜3次，每次10min；加入按比例稀释好的、与一抗相对应的二抗，置于水平摇床，室温孵1.5-2h。

s38：显色；

二抗孵育结束后将膜用pbst洗膜3次，每次10min；按比例配置ecl发光试剂、增强型化学发光液孵育膜2min，利用ecl发光仪显影分析系统进行显色，保存图像，利用灰度值分析软件imagej进行统计分析。

检测结果如图3所示，通过图3可以看出，双香豆素可以抑制pdk1的活性，并促进skov3细胞凋亡。

实施例4

ocr/ecar检测双香豆素对skov3细胞的氧耗及胞外酸化率的影响

s41：将处于对数生长期skov3细胞接种于细胞培养板中，接种密度为8×10⁴个/孔；10％fbs+rpmi-1640培养基过夜培养。

s42：第二天将不同浓度双香豆素、阳性对照(dca)、溶剂对照(dmso2％)与探针(mito-xpress或ph-xtra)预热混合后加入到96孔板中，设置3个复孔。

s43：用多功能酶标仪测时间分辨荧光强度，计算斜率。以斜率为纵坐标，绘制柱形图。

结果如图4和5所示，发现双香豆素可以将肿瘤细胞skov3的糖代谢方式从有氧糖酵解逆转为有氧氧化。

实施例5

葡萄糖及乳酸定量实验检测双香豆素对skov3代谢的影响

s51：将处于对数生长期细胞接种于6孔细胞培养板中，接种密度为4×10⁵个/孔。10％fbs+rpmi-1640培养基培养，至融合率80％后，收集con组的培养液于ep管中，收集con组细胞；其他5个孔不同浓度双香豆素，阳性对照，溶剂对照处理24h，实验重复3次。

s52：收集其余5个孔的培养液浓度并收集药物处理后的细胞。

s53：将收集的培养液按照试剂盒说明书进行操作，并用酶标仪测od505(葡萄糖)和od530(乳酸)。

s54：将收集好的细胞裂解并定量蛋白，用蛋白量标准化测得的od值。

结果如图6和7所示，发现双香豆素促进skov3细胞摄糖量增加，乳酸生成减少。

实施例6

流式细胞术检测双香豆素对skov3线粒体膜电势、ros水平

s61：将处于对数生长期细胞接种于6孔板中，接种密度为4×10⁵个/孔，10％fbs+rpmi-1640培养基培养，至融合率80％后双香豆素处理24h。

s62：收集细胞；

收集培养液，利用不含edta的胰酶消化细胞，密切观察消化状态，切勿过度消化，利用培养液终止消化，轻柔吹打，吹打次数不宜过多，细胞悬液离心800rpm，5min。

s63：弃上清，预冷的pbs洗涤细胞2次，手弹重悬，相同条件离心弃上清。

s64：每个样品加入1×jc-1染色液或1×mitosox染色液，颠倒混匀数次，37℃避光孵育30min。

s65：离心弃上清后，超纯水洗2遍，继续离心弃上清，培养液重悬，用流式细胞术检测。

检测结果如图8-10所示，发现双香豆素可使skov3细胞线粒体膜电势降低，线粒体ros升高，促进细胞凋亡。

实施例7

裸鼠皮下成瘤实验检测双香豆素对肿瘤生长的影响以及双香豆素通过抑制异种移植物pdk1活性，抑制肿瘤生长的检测过程

s71：25只balb/c雌性(6-8)周裸鼠(14-16g)随机分为每组5只，收集skov3细胞按1×10⁷/ml/只，2ml/只皮下植入到裸鼠背部。

s72：在裸鼠皮下成瘤体积达到100mm³(s＝1/2ab²，a为最长轴，b为垂直最长轴的轴，单位均为mm)的时候，腹腔注射药物。空白组nacl，阳性对照组dca，溶剂对照组naoh，实验组分为双香豆素50mg/kg，30mg/kg。隔天给药一次，一次2ml。隔天称体重一次，量体积一次。

s73：12天后用颈椎脱臼法处死裸鼠。将取下的肿瘤组织分为3部分，1部分用于western，1份用于免疫组化，另一部分备用。

检测结果如图11-图14所示，发现双香豆素可以抑制异种移植物pdk1活性，抑制肿瘤生长。

实施例8

免疫组化tunel实验探究双香豆素抑制肿瘤生长,促使p-pdh表达量降低并反映双香豆素可以抑制pdk1活性的检测过程

s81：常规程序制备石蜡组织块和5mm厚石蜡组织切片。

s82：然后按照tunel原位细胞凋亡检测试剂盒的标准步骤进行tunel染色。

s83：对于石蜡切片：

a.二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟，90％乙醇2分钟，70％乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。

b.滴加20μg/ml不含dnase的蛋白酶k，20-37℃作用15-30分钟

c.用pbs洗涤3次。

d.在用pbs配制的3％过氧化氢溶液(3％h2o2inpbs)中室温孵育10分钟，以灭活切片内源的过氧化物酶。随后用pbs洗涤3次

s84：tunel液或p-pdh一抗孵，相应二抗孵育，dab显色后光学显微镜拍照计数阳性细胞。

检测结果如图15-16所示，可以看出，免疫组化tunel实验发现双香豆素可以抑制肿瘤生长，p-pdh表达量降低反映了双香豆素可以抑制pdk1活性。

另外，下述实施例9-13为以双香豆素为活性成分的用于治疗卵巢癌的中药组合物及其具体制备方法的举例。

实施例9

中药组合物的原料配伍关系如下：

双香豆素50份、老牛揣10份、火炭母草根25份、蜘蛛果20份、人工牛黄12份、血竭1份、人参3份、清半夏10份、厚朴10份、枳壳20份、郁金25份、茸毛木蓝18份、川芎2份、白蜡树子10份、鱼腥草素2份、芝麻素6份和萘普生15份。

制备方法如下：

s91：将老牛揣、火炭母草根、人参、清半夏、厚朴和枳壳混合后置于质量为混合药材总量3倍量的水中煎煮1-1.5小时，得到水煎液和药渣，将所述水煎液浓缩成浸膏，并将所述浸膏干燥后粉碎得到第一药粉，将所述药渣干燥后粉碎至80目的药渣粉；

s92：将郁金、茸毛木蓝、川芎和白蜡树子混合后粉碎至80目，并与所述药渣粉混合后加入至质量为混合粉8倍且浓度为95％乙醇中，于85℃回流提取，得到醇提液，将所述醇提液浓缩干燥后粉碎，得到第二药粉；

s93：分别将人工牛黄、血竭和蜘蛛果粉碎后混合，得到第三药粉；并将所述第三药粉、第一药粉和第二药粉混合均匀后，超微粉碎至250目，得到微粉；

s94：将所述微粉与双香豆素、鱼腥草素、芝麻素和萘普生混合后制剂，得到药物组合物。

实施例10

中药组合物的原料配伍关系如下：

双香豆素60份、老牛揣25份、火炭母草根30份、蜘蛛果30份、人工牛黄20份、血竭3份、人参7份、清半夏12份、厚朴12份、枳壳35份、郁金30份、茸毛木蓝20份、川芎3份、白蜡树子15份、鱼腥草素5份、芝麻素9份和萘普生17份。

制备方法如下：

s101：将老牛揣、火炭母草根、人参、清半夏、厚朴和枳壳混合后置于质量为混合药材总量4倍量的水中煎煮1.5小时，得到水煎液和药渣，将所述水煎液浓缩成浸膏，并将所述浸膏干燥后粉碎得到第一药粉，将所述药渣干燥后粉碎至60目的药渣粉；

s102：将郁金、茸毛木蓝、川芎和白蜡树子混合后粉碎至70目，并与所述药渣粉混合后加入至质量为混合粉7倍且浓度为95％乙醇中，于90-回流提取，得到醇提液，将所述醇提液浓缩干燥后粉碎，得到第二药粉；

s103：分别将人工牛黄、血竭和蜘蛛果粉碎后混合，得到第三药粉；并将所述第三药粉、第一药粉和第二药粉混合均匀后，超微粉碎至300目，得到微粉；

s104：将所述微粉与双香豆素、鱼腥草素、芝麻素和萘普生混合后制剂，得到药物组合物。

实施例11

中药组合物的原料配伍关系如下：

双香豆素70份、老牛揣40份、火炭母草根35份、蜘蛛果35份、人工牛黄24份、血竭5份、人参10份、清半夏15份、厚朴10-12份、枳壳40份、郁金35份、茸毛木蓝24份、川芎4份、白蜡树子20份、鱼腥草素8份、芝麻素12份和萘普生20份。

制备方法如下：

s111：将老牛揣、火炭母草根、人参、清半夏、厚朴和枳壳混合后置于质量为混合药材总量5倍量的水中煎煮1-1.2小时，得到水煎液和药渣，将所述水煎液浓缩成浸膏，并将所述浸膏干燥后粉碎得到第一药粉，将所述药渣干燥后粉碎至80目的药渣粉；

s112:将郁金、茸毛木蓝、川芎和白蜡树子混合后粉碎至80目，并与所述药渣粉混合后加入至质量为混合粉6-10倍且浓度为95％乙醇中，于90-回流提取，得到醇提液，将所述醇提液浓缩干燥后粉碎，得到第二药粉；

s113：分别将人工牛黄、血竭和蜘蛛果粉碎后混合，得到第三药粉；并将所述第三药粉、第一药粉和第二药粉混合均匀后，超微粉碎至350目，得到微粉；

s114：将所述微粉与双香豆素、鱼腥草素、芝麻素和萘普生混合后制剂，得到药物组合物。

实施例12

双香豆素60份、老牛揣25份、火炭母草根30份、蜘蛛果30份、人工牛黄20份、血竭3份、人参7份、清半夏12份、厚朴12份、枳壳35份、郁金30份、茸毛木蓝20份、川芎3份、白蜡树子15份、鱼腥草素5份、芝麻素9份、萘普生17份、填充剂10份和稳定剂6份。

制备方法同实施例10，区别仅在于在制剂的过程加入了以等重量的甘露醇与山梨醇组成的填充剂和以等质量的精氨酸与微晶纤维素组成的稳定剂。

对比例1

老牛揣10份、火炭母草根25份、蜘蛛果20份、人工牛黄12份、血竭1份、人参3份、清半夏10份、厚朴10份、枳壳20份、郁金25份、茸毛木蓝18份、川芎2份、白蜡树子10份、鱼腥草素2份、芝麻素6份和萘普生15份。

制备方法：基于上述的配伍关系参照同实施例9相同的方法制成相同的剂型。

对比例2

双香豆素10份、老牛揣25份、火炭母草根30份、蜘蛛果30份、人工牛黄20份、血竭3份、人参7份、清半夏12份、厚朴12份、枳壳35份、郁金30份、茸毛木蓝20份、川芎3份、鱼腥草素5份、芝麻素9份和萘普生17份。

制备方法如下：基于上述的配伍关系参照同实施例10相同的方法制成相同的剂型。

对比例3

双香豆素50份、老牛揣25份、火炭母草根30份、蜘蛛果30份、厚朴12份、枳壳35份、郁金30份、茸毛木蓝20份、川芎3份、鱼腥草素5份和萘普生17份。

制备方法如下：基于上述的配伍关系参照同实施例10相同的方法制成相同的剂型。

试验例

将本发明实施例9-12以及对比例1-3所制成的粉末制剂，以200mg/kg的给药剂量对实验组小鼠(即模型组小鼠，每个模型组设置多个平行)进行给药，每天持续给药2次，共计给药20天，检测小鼠肿瘤大小变化情况，结果如下表1所示：

其中，模型组小鼠按照以下方法构建：收集skov3细胞按1×10⁷/ml/只，2ml/只皮下植入到裸鼠背部，在裸鼠皮下成瘤体积达到100mm³(s＝1/2ab²，a为最长轴，b为垂直最长轴的轴，单位均为mm)的时候，模型构建成功。

表1实施例9-12以及对比例1-3的制剂对小鼠肿瘤大小影响的检测结果

综上，本发明为双香豆素提供了一种新的用途，即作为pdk1的新型抑制剂从而实现了其在治疗/预防卵巢癌方面的应用，此外，本发明还以双香豆素为出发点提供了用于治疗/预防卵巢癌的新型药物组合物，以实现治疗和/或预防卵巢癌的同时，不会引起外周神经毒性。该双香豆素的用途以及含有双香豆素的药物为卵巢癌的预防或治疗具有重大的医学价值。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。