本发明涉及一种具有促进泌乳功能的益生菌组合物及其制备方法与应用，具体涉及一种由植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌组成的益生菌组合物，及其在制备促进泌乳产品中的应用。
背景技术：
母乳是婴儿成长最自然、最安全、最完整的天然食物，它不仅含有婴儿生长所需的全部营养物质，包括碳水化合物、蛋白质、脂肪、维生素、矿物质、及对宝宝脑部发育很重要的脂肪酸和牛磺酸等；还含有增强婴儿免疫力的多种抗体，特别是初乳中的母源抗体。新生儿能够及时喝到初乳，对新生儿的身体发育及增强免疫力具有重要的作用。
通过调查发现，临床上产后产妇乳汁不足较多见，且产后乳汁的缺乏对新生儿的身心发展和身体健康以及产妇的身心健康均会产生很大的不良影响。其一，母乳的“配方”会随着婴儿需要的改变而改变，使用其他喂养方式无法满足婴儿成长发育的全部营养需求；其二，母乳中含有大量的抗体，母乳喂养的婴儿在断奶后仍有较长时间具有抵抗疾病的能力，而缺少母乳喂养的婴儿极易患肠胃感染、尿道感染、食物过敏、肺炎等；其三，缺乏母乳喂养，无法满足婴儿的“口欲期”，孩子长大后会出现咬手指、吸烟、酗酒、爱吃零食等问题；其四，哺乳可刺激母亲的子宫收缩，促进恶露的排出，母乳的缺乏会导致产妇患乳腺癌和卵巢癌的几率增大。
中医认为，产后乳汁分泌不足的主要原因有：一方面为气血虚弱所致，素体脾胃虚弱，孕期产后调摄失宜，产后思虑过度而伤脾，高龄产妇气血虚弱，分娩失血过多导致生化之源不足，气血亏虚，乳汁生成乏源导致缺乳；另一方面为肝郁气滞所致，素体抑郁，为情志所伤，导致气肝郁结，气机不畅，经脉涩滞，乳络不通，阻碍乳汁排泄，导致缺乳。针对缺乳的两大原因——“气血虚弱”和“肝郁气滞”，中医治疗缺乳一般都采用补气养血和血、疏肝解郁、通经下乳等方法，常用的中药为漏芦、丝瓜络、通草、穿山甲、王不留行等。目前市售的产品中多数为单纯中药补气血产品，用药时间长，用药反馈不理想，副作用较大，长期食用后泌乳量减少、容易上火、引起腹泻、便秘、血糖升高等不良反应。因此，迫切需要一种更安全、有效的促进产妇产后乳汁分泌的产品。
技术实现要素：
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种具有促进泌乳功能的益生菌组合物及其制备方法与应用。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明的第一方面，提供一种具有促进泌乳功能的益生菌组合物。
本发明提供的益生菌组合物由植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌组成；
所述益生菌组合物中，植物乳杆菌的含量为2×107～2×109CFU/g，嗜酸乳杆菌的含量为2×107～2×109CFU/g，嗜热链球菌的含量为5×107～5×109CFU/g。
优选的，所述益生菌组合物中，植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌的活菌数比例为1：1：1。
进一步优选的，所述益生菌组合物中，植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌的含量均为2×108CFU/g。
优选的，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌BLCC2-0126，已于2015年3月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2015128。记载在专利“一株具有吸附或降解肠毒素功能的乳酸菌及其应用”(CN104988104A)中。
所述嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌BLCC2-0024，已于2015年3月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2015129。记载在专利“一株降血糖益生菌制剂及其制备方法”(CN105039217A)中。
所述嗜热链球菌为嗜热链球菌BLST，已于2012年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2012282。记载在专利“一株具有降胆固醇能力的嗜热链球菌及其应用”(CN102899276A)中。
本发明还提供上述益生菌组合物的制备方法，步骤如下：
(1)分别将植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌发酵培养，至发酵液中的菌体浓度达到对数生长期0.5～2×109CFU/mL；
(2)将植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌的发酵液分别离心，弃上清，收集菌泥；将菌泥与保护剂混合均匀，冷冻干燥，分别得到植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌的菌粉，按比例混合，即得益生菌组合物。
本发明还提供上述益生菌组合物在制备促进泌乳产品中的用途。
本发明的第二方面，提供一种促进泌乳的产品，其活性成分为上述益生菌组合物。
进一步的，所述促进泌乳的产品由上述益生菌组合物和一种或多种食品和/或药品上可接受的载体制备而成。
所述食品和/或药品上可接受的载体为现有技术中的常规产品，例如可以选自麦芽糊精、海藻糖、甜菜碱、淀粉、羧甲基纤维素钠等。
所述促进泌乳的产品可以被制备成片剂、粉剂、胶囊剂等各种剂型。
本发明的第三方面，提供一种具有促进泌乳功能的中药益生菌复合制剂，由上述益生菌组合物和中药组合物复配而成；
所述中药组合物由下述重量份的原料药制成：
黄芪10-15份、熟地10-15份、茯苓9-15份、红枣3-8份、桂圆3-8份、赤小豆5-10份、甘草5-10份。
中药益生菌复合制剂中，植物乳杆菌的含量为2.5×106～2.5×109CFU/g，嗜酸乳杆菌的含量为2.5×106～2.5×109CFU/g，嗜热链球菌的含量为2.5×106～2.5×109CFU/g。
优选的，上述中药益生菌复合制剂中，所述中药组合物由下述重量份的原料药制成：
黄芪12份、熟地12份、茯苓12份、红枣3份、桂圆3份、赤小豆9份、甘草6份。
本发明还提供上述中药益生菌复合制剂的制备方法，步骤如下：
(1)将黄芪、熟地、茯苓、红枣、桂圆、赤小豆和甘草用水浸泡1-2h，再煎煮2-3次，合并煎煮液，将煎煮液浓缩至固形物含量在30％以上，冷冻干燥，即得中药组合物；
(2)将步骤(1)制备的中药组合物与益生菌进行复配，即得中药益生菌复合制剂。
本发明的中药益生菌复合制剂中含有中药组分，而中药的配伍讲究相须、相使、相畏、相杀、相恶、相反，由于不同的中药之间存在不同的配伍关系，因此在使用两味以上中药时，必须有所选择，充分发挥药物之间相须相使的配伍关系。本发明的中药复方中通过将多味中药进行配伍，药物之间共同发挥了促进泌乳的作用，具有明显的增效作用，充分发挥了相须相使的配伍关系。
本发明的有益效果：
(1)本发明采用益生菌为原料制备的具有促进泌乳功能的益生菌组合物，开发了益生菌促进乳汁分泌的新用途，具有安全有效的特点，能够促进益生菌在人体内的增殖，调节人体肠道菌群、防止产妇便秘、促进食物营养吸收、维持血糖平衡、降低胆固醇、促进乳汁分泌。
(2)本发明提供的具有促进泌乳功能的中药益生菌复合制剂，采用中药提取物和益生菌组合物为原料，通过将中药与益生菌进行合理配伍，二者起到了协同促进作用。中药益生菌复合制剂中，各原料组分是一个有机的整体，缺一不可。发明人在研发过程中发现，减少上述复合制剂中的任何一种原料组分，或以具有相似药性的原料药对本发明中药组合物的原料组分进行替换，或者对益生菌的组成进行替换，则复合制剂整体的作用效果显著降低；在本发明的复合制剂的基础上再增加其他的原料组分，复合制剂的整体效果并未有明显的改善，甚至有复合制剂的整体效果降低的情况出现。经试验验证，采用本发明中药提取物和益生菌组合物制备的中药益生菌复合制剂，其促进泌乳的功能最为显著，而且质量稳定，功效确切。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1：具有促进泌乳功能的益生菌组合物的制备
1材料
1.1种子液体培养基
种子液体培养基：葡萄糖2.0％，柠檬酸铵0.2％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸锰0.02％，硫酸镁0.05％，蛋白胨1.0％，牛肉膏1.0％，酵母膏0.5％，吐温-80 0.1％，均为质量百分数，pH6.0，0.1MPa灭菌15min。
1.2固体斜面培养基
固体斜面培养基为1.1种子液体培养基中添加质量分数为1.5％的琼脂粉。
1.3发酵培养基
同1.1种子液体培养基。
2方法
2.1菌粉的制备工艺
①菌种：选用植物乳杆菌BLCC2-0126、嗜酸乳杆菌BLCC2-0024、嗜热链球菌BLST；
②菌种的活化：
将其冻干粉菌种分别接种于斜面培养基上，在37℃培养24～48h；
③种子液的培养：
分别将培养好的斜面，在无菌条件下用接种环接两环于100mL种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养16～48h；
④菌体的发酵：
采用5％的接种量，接种至3L大三角瓶中(装液量为2.5L)，37℃厌氧培养24～48小时，检测其菌液浓度，菌含量超过10亿/毫升，即可作为乳杆菌液体发酵终止。
⑤将各菌种发酵液后分别离心，弃上清，菌体沉淀洗涤，离心，弃上清，获得菌泥。
⑥配制菌粉保护剂，配方为蔗糖含量为8g、脱脂奶粉26g、甘油1mL，蒸馏水100mL，115℃，灭菌15min。
⑦将菌粉保护剂分别和菌泥充分混合，然后将各混合物分别预冻，再进行真空冷冻干燥。
⑧粉碎过筛：将上述益生菌干粉，经超微粉碎后，过80-100目筛。
2.2菌粉计数
利用平板菌落计数法测量益生菌干粉的活菌数。
2.3配料
称量过筛后的益生菌干粉，按照植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌的活菌数比例为1：1：1的比例进行配料，其中植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌含量均为2×108CFU/g。
2.4混合
将配好的益生菌及辅料充分混匀至色泽均匀一致，无色差，即得到具有泌乳功能的益生菌组合物1。
实施例2：
具体步骤同实施例1，不同之处在于：步骤2.3中配料，其中植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌含量均为2×107CFU/g，嗜热链球菌含量为5×107CFU/g，辅料为脱脂奶粉，得到具有促进泌乳功能的益生菌组合物2。
实施例3：
具体步骤同实施例1，不同之处在于：步骤2.3中配料，其中植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌含量均为2×107CFU/g，嗜热链球菌含量为5×109CFU/g，辅料为脱脂奶粉，得到具有泌乳功能的益生菌组合物3。
试验例1：
1材料
1.1受试样品：实施例1制备的益生菌组合物。人体推荐药效成分剂量为2g/60kg。
1.2实验动物：SPF级昆明白孕二胎小鼠，雌性，体重40～60g。
2实验方法
2.1实验分组：设置阴性空白对照和3个受试样品剂量组。剂量分别为0.165g/kg·bw、0.33g/kg·bw、0.99g/kg·bw组，分别相当于人体推荐摄入量的5倍、10倍、30倍。受试物以超纯水配制，空白对照组用超纯水灌胃，每组每只0.6ml。
2.2超负荷哺乳模型的建立：孕鼠适应性喂养3～4天后分娩，按照分娩后母鼠体重随机分为空白对照组和各剂量组，每组10只母鼠，每只母鼠带养10只仔鼠，微调各窝仔鼠体重使之差异不显著，每只母鼠及其仔鼠单笼饲养。
2.3受试物给予方式：母鼠分娩后，稳定哺乳一段时间，于产后第三天开始给予受试样品，受试样品给予时间15天。
2.4测定方法：
2.4.1仔鼠体重：实验开始时称量全窝仔鼠初始窝重，以后每天与仔鼠分离前固定时间称量仔鼠体重，直至实验结束，计算仔鼠平均日增重。
仔鼠平均增重＝每窝仔鼠平均体重-初始平均体重；
2.4.2泌乳量:每天将母鼠与仔鼠隔离5～6h，再合笼后哺乳1h，观察每窝仔鼠体重变化，计算泌乳量：
泌乳量＝哺乳后仔鼠窝重-哺乳前仔鼠窝重；
2.4.3结果判定标准
实验组在任一个时间点有两个剂量组仔鼠体重增加与对照组比较差异有统计学意义，或任两个时间点仔鼠体重增加与对照组比较差异有统计学意义；同时相应剂量组任一时间点3天累计泌乳量增加与对照组比较差异有统计学意义，可判定该受试样品促进泌乳功能动物实验结果阳性。
3结果
3.1母鼠泌乳量的变化
统计各组母鼠分娩后第4天至第18天的每天1h泌乳量，结果见表1。与对照组相比，30倍剂量组在第4天、第8天可显著性地提高母鼠泌乳量(P＜0.05)；10倍和5倍剂量在第8天、第12天可显著地增加母鼠泌乳量(P＜0.05)，其中10倍剂量组在第16天仍能显著地增加母鼠泌乳量(P＜0.05)。
表1不同时间点1h母鼠泌乳量(±s)(单位：g)
由表2可知，母鼠分娩后第4～6天，三天累积泌乳量30倍剂量组、10倍剂量组和5倍剂量组均显著性的高于空白对照组(P＜0.05)。
表2累积泌乳量
3.2平均日增重
统计各组仔鼠平均日增重，可以看出30倍剂量组、10倍剂量组和5倍剂量组在第8、11、14日龄仔鼠平均日增重均显著性的高于空白对照组(P＜0.05)。
表3平均日增重
4结论
动物实验结果可见，与空白对照组相比，30倍剂量组、10倍剂量组和5倍剂量组可使母鼠泌乳量和累积泌乳量显著性提高(P＜0.05)，在第8、11、14日龄仔鼠平均日增重均显著性的高于空白对照组(P＜0.05)。根据保健食品保健功能评价标准，可判断该受试物促进泌乳功能动物实验结果阳性。
实施例4：具有促进泌乳功能的中药益生菌复合制剂的制备
具体方法如下：
(1)中药组合物的制备：
称取黄芪12份、熟地12份、茯苓12份、红枣10份、桂圆肉10份、赤小豆9份、甘草6份，先用清水润洗一遍，再用8倍体积水浸泡1～2h。
在中药提取罐中煎煮，水开后继续煎煮30min，过滤得到第一滤液；药渣用8～10倍水进行二次煎煮，水开后继续煎煮30min，过滤得到第二滤液与第一滤液混合均匀，通过减压浓缩至固形物含量为30％以上，得到浓缩液与麦芽糊精以一定比例混合均匀后，进行冷冻干燥。得到冷冻干燥物，粉碎，过100目以上筛，即得中药组合物。
(2)将中药组合物与实施例1制备的益生菌组合物进行复配，即得中药益生菌复合制剂。制备的中药益生菌复合制剂中，植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌含量均为2×108CFU/g。
实施例5：
具体步骤同实施例4，不同之处在于：制备中药组合物的原料药的比例为：黄芪10份、熟地10份、茯苓9份、红枣8份、桂圆肉8份、赤小豆5份、甘草5份。
实施例6：
具体步骤同实施例4，不同之处在于：制备中药组合物的原料药的比例为：黄芪15份、熟地15份、茯苓15份、红枣12份、桂圆肉12份、赤小豆10份、甘草10份。
试验例2：
具体步骤同试验例1，不同之处在于：分组为空白对照组、受试物(实施例4制备的中药益生菌复合制剂)30倍剂量、受试物10倍剂量、受试物5倍剂量，给药体积为0.6mL/只)。本发明人对其促进泌乳动物实验的结果进行分析。
1、母鼠泌乳量的变化
统计各组母鼠分娩后第4天至第16天的每天1h泌乳量，结果见表4。与对照组相比，30倍剂量组在第4天、第8天可显著性地提高母鼠泌乳量(P＜0.05)；10倍剂量在第4、8、12、16天均可显著地增加母鼠泌乳量(P＜0.05)；5倍剂量组在第4、8、16天可显著地增加母鼠泌乳量(P＜0.05)。
表4不同时间点1h母鼠泌乳量(±s)(单位：g)
由表5可知，母鼠分娩后第4～6天，三天累积泌乳量30倍剂量组、10倍剂量组和5倍剂量组均显著性的高于空白对照组(P＜0.05)。
表5累积泌乳量(单位：g)
2、平均日增重
由表6统计各组仔鼠平均日增重，可以看出30倍剂量组、10倍剂量组和5倍剂量组在第8、11、17日龄仔鼠平均日增重均显著性的高于空白对照组(P＜0.05)，其中10倍剂量组和5倍剂量组仔鼠在第14日龄平均日增重均显著性的高于空白对照组(P＜0.05)。
表6平均日增重(单位：g)
3、对仔鼠体重变化的影响
表7可以看出，各实验组未经处理时，仔鼠各实验组体重没有显著差异(P＞0.05)，即实验前各处理组仔鼠体重分布均匀。30倍剂量组、10倍剂量组、5倍剂量组在第8、12、16天时，仔鼠体重均显著性高于空白对照组(P＜0.05)。
表7仔鼠体重变化(单位：g)
4、结论
动物实验结果可见，与空白对照组相比，30倍剂量组、10倍剂量组和5倍剂量组可显著性的提高母鼠泌乳量和累积泌乳量(P＜0.05)，在第8、11、17日龄仔鼠平均日增重均显著性的高于空白对照组(P＜0.05)，在第14日龄时，10倍剂量组和5倍剂量仔鼠平均日增重显著性的高于空白对照组(P＜0.05)。根据保健食品保健功能评价标准，可判断该受试物促进泌乳功能动物实验结果阳性。
试验例3：临床试验
1、材料
1.1受试样品：受试物(实施例4制备的中药益生菌复合制剂)。人体推荐药效成分剂量为每天20g/60kg。
1.2受试人群
1.2.1受试者纳入标准：乳母年龄<35岁，单胎，乳量不足，婴儿吃不饱，母子身体均健康的志愿受试者。
1.2.2排除受试者标准：乳母乳房发育不正常，有乳腺疾病者；有影响催乳素水平各种因素者；哺乳期再次妊娠者；有不良嗜好(抽烟、喝酒)，服用其它有促泌乳药物者；有产后大出血者；对本受试样品过敏者；短期内服用与受试功能有关的物品，影响到结果的判断者。
1.3试验设计及分组
将100例受试者随机分入空白对照组和试服组，每组50例，试服组给予受试样品每次10g，每天2次；空白对照组不给予任何形式样品或安慰剂。受试样品给予时间15天。
1.4判定指标
1.4.1乳房胀度判断标准
A 乳房胀满、触之疼痛、有溢奶现象或手挤有奶喷出 2分
B 乳房微胀、触之微痛、无溢奶现象但手挤有奶喷出 1分
C 乳房不胀、触之不痛、手挤无奶或滴状奶 0分
累计服用受试样品期间(15天)的积分。
有效：试食组与对照组的积分比较，差异有显著性。
1.4.2泌乳量
于婴儿上次哺乳后2小时,将乳汁全部挤出，测定泌乳量。分别于试验开始时和试验结束时测定一次。计算其试食期间泌乳量的增加值或直接比较泌乳量的差别。
1.4.3乳汁蛋白含量(参见GB5009.5—2010凯氏定氮法)
在试验结束时，进行一次乳汁中蛋白质的含量测定。
1.5判定标准
试食后，试食组乳房胀度和泌乳量两项指标自身比试食前明显增强或增加，试食组两项指标与对照组比明显增强或增加，且乳汁蛋白质含量不低于对照组，可判定该受试样品具有促进泌乳功能的作用。
2结果
2.1受试者一般情况
两组受试者试用样品15天后，受试者及其婴儿情况良好，未见不良反应。
2.2乳房胀度
由表8可见，用t检验进行统计处理，乳房胀度15天总积分对照组和试服组比较，差异显著(P＜0.05)，即本发明的中药和益生菌组合物能够增加乳房胀度。
表8乳房胀度积分(±s)
2.3对泌乳量的影响
由表9可见，原始数据方差齐，用t检验进行统计处理，试食组泌乳量显著性的高于对照组，差异显著性(P＜0.05)，即本发明的中药和益生菌组合物能够增加泌乳量。
表9对泌乳量的影响(±s)(单位：ml)
2.4乳汁蛋白含量
表10乳汁蛋白含量的测定
由表10可见，原始数据进行方差齐性检验，符合方差齐的要求，用t检验进行统计处理，其试食后乳汁蛋白质含量在对照组和试食组间比较差异无显著性(P＞0.05)，本发明的中药和益生菌组合物对乳汁中的蛋白含量无影响。
3结论
在本次试服试验中，试服组食用本发明中药和益生菌组合物15天后，能显著增加乳房胀度，说明经过两个小时的不如间隔后，能显著增加乳汁的存储，显著增加泌乳量；对乳汁蛋白含量没有影响，说明泌乳量的增加并不只是增加了乳汁中的水分，而是增加了整体的泌乳量。由此可见，本发明的中药和益生菌组合物具有一定的促进泌乳作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。