本发明属于医药领域，涉及一种由丹参、川芎、骨碎补制成的治疗股骨头坏死的药物及制备方法与检测方法。
背景技术：
骨坏死病是常见的骨科病，尤其以股骨头缺血坏死最为多见。股骨头缺血坏死好发于青壮年，年龄多在20-50岁，致残率高，严重危害人民的身心健康。股骨头缺血坏死发病原因有很多，目前已公认引起股骨头缺血坏死的原因为创伤和激素。据国内外文献报道，近年来本病的发生率不断上升，尤其是因滥用激素与酗酒所致的股骨头缺血坏死为多，其发病率已超过股骨颈骨折所致的股骨头缺血坏死，有学者统计，因激素所致的股骨头缺血坏死已占本病的第一位。随着人口老龄化，每年单纯因骨质疏松所致的股骨颈骨折而并发股骨头缺血坏死就有成千上万之多。目前对该类病的治疗仍是骨科的一大难题，近年来随着生物材料技术与生物力学理论的发展，人工髋关节质量虽然显著提高，全髋置换术能明显提高股骨头缺血坏死患者的生活质量，但由于股骨头缺血坏死患者的年龄相对较轻，目前的人工假体尚不能和患者地寿命相匹配，而早、中期股骨头缺血坏死也不一定需进行全髋置换，因此开发研究阻断或推迟对股骨头缺血坏死进行全髋置换的有效治疗药物仍然迫切需要。
到目前为止，现代医学领域尚无用于治疗骨缺血坏死病的化学药。中药治疗本病的有效作用虽然引起医药学者的广泛关注，但对治疗骨缺血坏死病的新药开发力度却仍然停滞不前，治疗骨缺血坏死病的药品尚少，特别是疗效满意的新药更为缺乏。
申请号为03135340.1、200710055426.7、201410420898.8、200510009962.4、200410069555.8、201410227164.8、201010207274.X、01129030.7、201310137741.X、201510594576.X、200510003123.1、201010279290.X、201110008449.9、201410713897.2、200610159799.4、201410277148.X、200610012248.5、201110439176.3、201010202835.7、200810238738.6、201210575751.7、02125610.1、201510285454.2、201010557465.9、201210182909.4、02110238.4的中国发明专利，公开了多种治疗股骨头坏死的中药组合物，但是，这些药物制剂少则由十几味药味原料制成，多则有二十几味、三十几味，甚至四五十味药味原料制备，其中有的药物组合物还含有一些对人体有毒的药材；而且这些药物多为口服药物制剂，或外用制剂，实际上，这些药物对于股骨头坏死的治疗并没有特别明显的效果；而且由于药味成分复杂，制备工艺非常粗糙，所以它的药物质量难于得到控制。
作为中华人民共和国国家自然科学基金项目——依据补肾／活血法运用中药关节腔灌注对股骨头缺血性坏死修复机制的研究（项目编号：81173276）的项目承担人，发明人对本发明的项目进行了持续的多年研究，得到了本发明的技术方案。
技术实现要素：
本发明的目的提供一种有效治疗股骨头坏死的中药组合物。
本发明的另一目的是提供该治疗股骨头坏死的中药组合物的制备方法。
本发明还有一个目的是提供该治疗股骨头坏死的中药组合物的检测方法。
本发明的目的是通过以下方式实现的：
一种治疗股骨头坏死的药物组合物，该药物组合物由以下重量份的药味原料制成：丹参1～5重量份、川芎1～5重量份、骨碎补1～5重量份。
所述的治疗股骨头坏死的药物组合物，作为优选，该药物组合物由以下重量份的药味原料制成：丹参3重量份、川芎2重量份、骨碎补5重量份。
所述的治疗股骨头坏死的药物组合物，其特征在于该药物组合物与药学可接受的辅料制成注射剂。
所述的治疗股骨头坏死的药物组合物，该药物组合物的制备方法为：
（1）取1/2处方量的丹参、取1/2处方量的川芎、取1/2处方量的骨碎补，加5～15倍量的蒸馏水煎煮3次，第1次2～4h，第2次1～3h，第3次0.5～1.5h，三次煎煮液合并，滤过，滤液浓缩至稠膏状，冷却后加无水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次达到60%、75%、95%，三次醇沉液合并，滤过，滤液用NaOH溶液调pH值至8～10，冷藏，静置12～36h，滤过，滤液挥去乙醇，加入1～3倍量的乙醚，冷藏，静置12～36h，滤过，滤液挥去乙醚，溶于水，水溶液抽滤至清，得提取液Ⅰ；
（2）取1/2处方量的丹参、取1/2处方量的川芎、取1/2处方量的骨碎补，置药材于渗漉缸中，以4～12倍量50%乙醇浸渍36～60h，收集初漉液，再用4～12倍量65%乙醇渗漉药材至无药味，合并两次渗漉液，浓缩至稠粘状，用无水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次达到80%、90%，两次醇沉液合并，滤过，滤液用稀盐酸调其pH值为3～5，冷藏，静置12～36h，滤过，滤液浓缩，加无水乙醇进行第三次醇沉，使含醇量达到95%，滤过，挥尽滤液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀盐酸调pH值为3～5，煮沸，抽滤，滤液再用NaOH溶液调pH值为6～8，得提取液Ⅱ；
（3）将以上提取液Ⅰ与提取液Ⅱ合并，加注射用水至足量，再加苯甲醇、氯化钠、吐温-80溶解于其中，并用NaOH溶液调pH值为6～8，加1%针用活性炭于溶液中煮沸5～15min，抽滤，滤液经检验合格后无菌分装，分装好的注射液用流通蒸汽灭菌0.5～1h，稍冷后灯检，即得。
所述的治疗股骨头坏死的药物组合物，作为优选，该药物组合物的制备方法为：
（1）取1/2处方量的丹参、取1/2处方量的川芎、取1/2处方量的骨碎补，加10倍量的蒸馏水煎煮3次，第1次3h，第2次2h，第3次1h，三次煎煮液合并，滤过，滤液浓缩至稠膏状，冷却后加无水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次达到60%、75%、95%，三次醇沉液合并，滤过，滤液用NaOH溶液调pH值至9，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醇，加入2倍量的乙醚，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醚，转溶于水，水溶液抽滤至清，得提取液Ⅰ；
（2）取1/2处方量的丹参、取1/2处方量的川芎、取1/2处方量的骨碎补，置药材于渗漉缸中，以8倍量50%乙醇浸渍48h，收集初漉液，再用8倍量65%乙醇渗漉药材至无药味，合并两次渗漉液，浓缩至稠粘状，用无水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次达到80%、90%，两次醇沉液合并，滤过，滤液用稀盐酸调其pH值为4，冷藏，静置24h，滤过，滤液浓缩，加无水乙醇进行第三次醇沉，使含醇量达到95%，滤过，挥尽滤液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀盐酸调pH值为4，煮沸，抽滤，滤液再用NaOH溶液调pH值为7，得提取液Ⅱ；
（3）将以上提取液Ⅰ与提取液Ⅱ合并，加注射用水至足量，再加苯甲醇、氯化钠、吐温-80溶解于其中，并用NaOH溶液调pH值为7，加1%针用活性炭于溶液中煮沸10min，抽滤，滤液经检验合格后无菌分装，分装好的注射液用流通蒸汽灭菌0.5h，稍冷后灯检，即得。
一种治疗股骨头坏死的药物组合物的制备方法，该药物组合物由以下重量份的药味原料制成：丹参1～5重量份、川芎1～5重量份、骨碎补1～5重量份，其特征在于，该药物组合物的制备方法为：
（1）取1/2处方量的丹参、取1/2处方量的川芎、取1/2处方量的骨碎补，加5～15倍量的蒸馏水煎煮3次，第1次2～4h，第2次1～3h，第3次0.5～1.5h，三次煎煮液合并，滤过，滤液浓缩至稠膏状，冷却后加无水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次达到60%、75%、95%，三次醇沉液合并，滤过，滤液用NaOH溶液调pH值至8～10，冷藏，静置12～36h，滤过，滤液挥去乙醇，加入1～3倍量的乙醚，冷藏，静置12～36h，滤过，滤液挥去乙醚，溶于水，水溶液抽滤至清，得提取液Ⅰ；
（2）取1/2处方量的丹参、取1/2处方量的川芎、取1/2处方量的骨碎补，置药材于渗漉缸中，以4～12倍量50%乙醇浸渍36～60h，收集初漉液，再用4～12倍量65%乙醇渗漉药材至无药味，合并两次渗漉液，浓缩至稠粘状，用无水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次达到80%、90%，两次醇沉液合并，滤过，滤液用稀盐酸调其pH值为3～5，冷藏，静置12～36h，滤过，滤液浓缩，加无水乙醇进行第三次醇沉，使含醇量达到95%，滤过，挥尽滤液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀盐酸调pH值为3～5，煮沸，抽滤，滤液再用NaOH溶液调pH值为6～8，得提取液Ⅱ；
（3）将以上提取液Ⅰ与提取液Ⅱ合并，加注射用水至足量，再加苯甲醇、氯化钠、吐温-80溶解于其中，并用NaOH溶液调pH值为6～8，加1%针用活性炭于溶液中煮沸5～15min，抽滤，滤液经检验合格后无菌分装，分装好的注射液用流通蒸汽灭菌0.5～1h，稍冷后灯检，即得。
所述的治疗股骨头坏死的药物组合物的制备方法，作为优选，该药物组合物由以下重量份的药味原料制成：丹参3重量份、川芎2重量份、骨碎补5重量份，该药物组合物的制备方法为：
（1）取1/2处方量的丹参、取1/2处方量的川芎、取1/2处方量的骨碎补，加10倍量的蒸馏水煎煮3次，第1次3h，第2次2h，第3次1h，三次煎煮液合并，滤过，滤液浓缩至稠膏状，冷却后加无水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次达到60%、75%、95%，三次醇沉液合并，滤过，滤液用NaOH溶液调pH值至9，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醇，加入2倍量的乙醚，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醚，转溶于水，水溶液抽滤至清，得提取液Ⅰ；
（2）取1/2处方量的丹参、取1/2处方量的川芎、取1/2处方量的骨碎补，置药材于渗漉缸中，以8倍量50%乙醇浸渍48h，收集初漉液，再用8倍量65%乙醇渗漉药材至无药味，合并两次渗漉液，浓缩至稠粘状，用无水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次达到80%、90%，两次醇沉液合并，滤过，滤液用稀盐酸调其pH值为4，冷藏，静置24h，滤过，滤液浓缩，加无水乙醇进行第三次醇沉，使含醇量达到95%，滤过，挥尽滤液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀盐酸调pH值为4，煮沸，抽滤，滤液再用NaOH溶液调pH值为7，得提取液Ⅱ；
（3）将以上提取液Ⅰ与提取液Ⅱ合并，加注射用水至足量，再加苯甲醇、氯化钠、吐温-80溶解于其中，并用NaOH溶液调pH值为7，加1%针用活性炭于溶液中煮沸10min，抽滤，滤液经检验合格后无菌分装，分装好的注射液用流通蒸汽灭菌0.5h，稍冷后灯检，即得。
一种治疗股骨头坏死的药物组合物的检测方法，该药物组合物由以下重量份的药味原料制成：丹参1～5重量份、川芎1～5重量份、骨碎补1～5重量份，该药物组合物的制备方法为：取丹参、川芎和骨碎补，混合，粉碎成粗粉，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取得到水蒸气蒸馏提取物，备用；取水蒸气蒸馏提取后的药渣，加入5～10倍重量比的60～80%乙醇浸渍48～60h，再用60～80%乙醇作溶剂缓慢渗滤至滤液呈微黄色，滤液在60～80℃下减压浓缩得相对密度为1.2～1.3的稠膏；再加8～16倍水充分搅拌并静置12～24h使油水分离，去除沉淀物和油脂，收集水层药液，加入药用活性炭静置1～2h吸附药液至无色，上聚酰胺色谱柱，用水饱和正丁醇洗脱，洗脱液在60～80℃下减压浓缩后加入8～12倍重量的90～95%乙醇进行二次乙醇提取，乙醇提液在4～8℃冷藏12～24h后过滤，滤液经减压浓缩后，再加入8～12倍重量份的水进行水提，经冷藏后12～24h，2～6℃离心过滤得水提液，水提液用0.1～0.5%重量比的活性炭脱色，边加边搅拌，并加热至40～50℃后静止0.5～1h；经膜过滤器过滤，超滤后在40～50℃下减压浓缩，得提取物稠膏；将提取物稠膏、水蒸气蒸馏提取物、药用聚乙二醇、甘露醇和医用氯化钠混合，用注射用水稀释，滤过，灌封、灭菌、灯检、包装，即得药物注射液；
采用HPLC-ELSD法同时测定丹参酸甲酯、丁烯基酞内酯、双羟基异补骨脂定3种成分的含量：
（1）色谱条件：Agilent Zorbax SB-C18分析柱；流动相为：甲醇-0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液，线性梯度洗脱，0至15min，流动相甲醇的比例从95%线性递减到65%，流动相0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液的比例从5%线性递增到35%；16至30min，流动相甲醇的比例从65%递减到50%，流动相0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液的比例从35%线性递增到50%；31至40min，流动相甲醇的比例从50%递减到20%，流动相0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液的比例从50%线性递增到80%；体积流量0.2～1.0mL·min-1；检测器参数：载气流量1.0～3.0L·min-1，漂移管温度80～100℃；
（2）对照品溶液的制备：精密称取丹参酸甲酯对照品、丁烯基酞内酯对照品、双羟基异补骨脂定对照品各适量，加甲醇，超声1～5min使溶解，用甲醇制成每1mL含丹参酸甲酯0.50mg，丁烯基酞内酯0.50mg，双羟基异补骨脂定0.10mg的混合对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密吸取待测样品注射液1～3mL，置25mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得；
（4）测定：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各2～20μL，注入高效液相色谱仪进行测定。
所述的治疗股骨头坏死的药物组合物的检测方法，作为优选，该药物组合物由以下重量份的药味原料制成：丹参3重量份、川芎2重量份、骨碎补5重量份，该药物组合物的制备方法为：
（1）取1/2处方量的丹参、取1/2处方量的川芎、取1/2处方量的骨碎补，加10倍量的蒸馏水煎煮3次，第1次3h，第2次2h，第3次1h，三次煎煮液合并，滤过，滤液浓缩至稠膏状，冷却后加无水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次达到60%、75%、95%，三次醇沉液合并，滤过，滤液用NaOH溶液调pH值至9，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醇，加入2倍量的乙醚，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醚，转溶于水，水溶液抽滤至清，得提取液Ⅰ；
（2）取1/2处方量的丹参、取1/2处方量的川芎、取1/2处方量的骨碎补，置药材于渗漉缸中，以8倍量50%乙醇浸渍48h，收集初漉液，再用8倍量65%乙醇渗漉药材至无药味，合并两次渗漉液，浓缩至稠粘状，用无水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次达到80%、90%，两次醇沉液合并，滤过，滤液用稀盐酸调其pH值为4，冷藏，静置24h，滤过，滤液浓缩，加无水乙醇进行第三次醇沉，使含醇量达到95%，滤过，挥尽滤液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀盐酸调pH值为4，煮沸，抽滤，滤液再用NaOH溶液调pH值为7，得提取液Ⅱ；
（3）将以上提取液Ⅰ与提取液Ⅱ合并，加注射用水至足量，再加苯甲醇、氯化钠、吐温-80溶解于其中，并用NaOH溶液调pH值为7，加1%针用活性炭于溶液中煮沸10min，抽滤，滤液经检验合格后无菌分装，分装好的注射液用流通蒸汽灭菌0.5h，稍冷后灯检，即得；
采用HPLC-ELSD法同时测定丹参酸甲酯、丁烯基酞内酯、双羟基异补骨脂定3种成分的含量：
（1）色谱条件：Agilent Zorbax SB-C18分析柱；流动相为：甲醇-0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液，线性梯度洗脱，0至15min，流动相甲醇的比例从95%线性递减到65%，流动相0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液的比例从5%线性递增到35%；16至30min，流动相甲醇的比例从65%递减到50%，流动相0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液的比例从35%线性递增到50%；31至40min，流动相甲醇的比例从50%递减到20%，流动相0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液的比例从50%线性递增到80%；体积流量0.5mL·min-1；检测器参数：载气流量2.0L·min-1，漂移管温度90℃；
（2）对照品溶液的制备：精密称取丹参酸甲酯对照品、丁烯基酞内酯对照品、双羟基异补骨脂定对照品各适量，加甲醇，超声3min使溶解，用甲醇制成每1mL含丹参酸甲酯0.50mg，丁烯基酞内酯0.50mg，双羟基异补骨脂定0.10mg的混合对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密吸取待测样品注射液2mL，置25mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得；
（4）测定：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各5μL，注入高效液相色谱仪进行测定。
一种药物组合物在制备治疗股骨头坏死药物中的应用，该药物组合物由以下重量份的药味原料制成：丹参3重量份、川芎2重量份、骨碎补5重量份，该药物组合物的制备方法为：
（1）取1/2处方量的丹参、取1/2处方量的川芎、取1/2处方量的骨碎补，加10倍量的蒸馏水煎煮3次，第1次3h，第2次2h，第3次1h，三次煎煮液合并，滤过，滤液浓缩至稠膏状，冷却后加无水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次达到60%、75%、95%，三次醇沉液合并，滤过，滤液用NaOH溶液调pH值至9，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醇，加入2倍量的乙醚，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醚，转溶于水，水溶液抽滤至清，得提取液Ⅰ；
（2）取1/2处方量的丹参、取1/2处方量的川芎、取1/2处方量的骨碎补，置药材于渗漉缸中，以8倍量50%乙醇浸渍48h，收集初漉液，再用8倍量65%乙醇渗漉药材至无药味，合并两次渗漉液，浓缩至稠粘状，用无水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次达到80%、90%，两次醇沉液合并，滤过，滤液用稀盐酸调其pH值为4，冷藏，静置24h，滤过，滤液浓缩，加无水乙醇进行第三次醇沉，使含醇量达到95%，滤过，挥尽滤液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀盐酸调pH值为4，煮沸，抽滤，滤液再用NaOH溶液调pH值为7，得提取液Ⅱ；
（3）将以上提取液Ⅰ与提取液Ⅱ合并，加注射用水至足量，再加苯甲醇、氯化钠、吐温-80溶解于其中，并用NaOH溶液调pH值为7，加1%针用活性炭于溶液中煮沸10min，抽滤，滤液经检验合格后无菌分装，分装好的注射液用流通蒸汽灭菌0.5h，稍冷后灯检，即得；
采用HPLC-ELSD法同时测定丹参酸甲酯、丁烯基酞内酯、双羟基异补骨脂定3种成分的含量：
（1）色谱条件：Agilent Zorbax SB-C18分析柱；流动相为：甲醇-0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液，线性梯度洗脱，0至15min，流动相甲醇的比例从95%线性递减到65%，流动相0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液的比例从5%线性递增到35%；16至30min，流动相甲醇的比例从65%递减到50%，流动相0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液的比例从35%线性递增到50%；31至40min，流动相甲醇的比例从50%递减到20%，流动相0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液的比例从50%线性递增到80%；体积流量0.5mL·min-1；检测器参数：载气流量2.0L·min-1，漂移管温度90℃；
（2）对照品溶液的制备：精密称取丹参酸甲酯对照品、丁烯基酞内酯对照品、双羟基异补骨脂定对照品各适量，加甲醇，超声3min使溶解，用甲醇制成每1mL含丹参酸甲酯0.50mg，丁烯基酞内酯0.50mg，双羟基异补骨脂定0.10mg的混合对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密吸取待测样品注射液2mL，置25mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得；
（4）测定：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各5μL，注入高效液相色谱仪进行测定。
本发明提供以下实验研究资料，用以充分公开本发明的技术方案以及本发明的技术效果。
实验一：对治疗实验性股骨头坏死的处方与活性部位的药效学筛选研究
1 材料与方法
1.1 材料：
1.1.1 动物：Wistar大鼠乳鼠，60只，日龄10d，由黑龙江中医药大学动物中心提供。动物合格证号：医动字第1024－03号。实验动物均预先饲养24小时，适应实验室饲养条件。
1.1.2 试剂：醋酸泼尼松龙注射液，0.125g/ml，浙江仙琚制药厂股份有限公司。
1.1.3 仪器：双能X线骨密度仪，微循环显微观察系统，MTS生物材料试验机，美国产品。
1.1.4 药物：
1.1.4.1 血塞通注射液：黑龙江珍宝岛药业股份有限公司生产，国药准字Z23020787。
1.1.4.2 甲药物注射液：
处方：丹参300g、川芎200g、骨碎补500g。
制备方法：（1）取150g丹参、取100g川芎、取250g骨碎补，加10倍量的蒸馏水煎煮3次，第1次3h，第2次2h，第3次1h，三次煎煮液合并，滤过，滤液浓缩至稠膏状，冷却后加无水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次达到60%、75%、95%，三次醇沉液合并，滤过，滤液用NaOH溶液调pH值至9，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醇，加入2倍量的乙醚，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醚，转溶于水，水溶液抽滤至清，得提取液Ⅰ；
（2）取150g丹参、取100g川芎、取250g骨碎补，置药材于渗漉缸中，以8倍量50%乙醇浸渍48h，收集初漉液，再用8倍量65%乙醇渗漉药材至无药味，合并两次渗漉液，浓缩至稠粘状，用无水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次达到80%、90%，两次醇沉液合并，滤过，滤液用稀盐酸调其pH值为4，冷藏，静置24h，滤过，滤液浓缩，加无水乙醇进行第三次醇沉，使含醇量达到95%，滤过，挥尽滤液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀盐酸调pH值为4，煮沸，抽滤，滤液再用NaOH溶液调pH值为7，得提取液Ⅱ；
（3）将以上提取液Ⅰ与提取液Ⅱ合并，加注射用水至足量，再加苯甲醇、氯化钠、吐温-80溶解于其中，并用NaOH溶液调pH值为7，加1%针用活性炭于溶液中煮沸10min，抽滤，滤液经检验合格后无菌分装，分装好的注射液用流通蒸汽灭菌0.5h，稍冷后灯检，即得。
1.1.4.3乙药物注射液：
处方：丹参300g、川芎200g、骨碎补500g。
制备方法：取干燥的丹参500g、川芎300g和骨碎补200g，混合，粉碎成粗粉，加入8倍重量比的70%乙醇浸渍50h，再用70%乙醇作溶剂缓慢渗滤至滤液呈微黄色，滤液在70℃下减压浓缩得相对密度为1.25的稠膏；再加12倍水充分搅拌并静置24h使油水分离，去除沉淀物和油脂，收集水层药液，加入药用活性炭静置2h吸附药液至无色，上聚酰胺色谱柱，用水饱和正丁醇洗脱，洗脱液在70℃下减压浓缩后加入10倍重量的95%乙醇进行二次乙醇提取，乙醇提液在6℃冷藏24h后过滤，滤液经减压浓缩后，再加入10倍重量份的水进行水提，经冷藏后24h，4℃离心过滤得水提液，水提液用0.3%重量比的活性炭脱色，边加边搅拌，并加热至40℃后静止1h；经膜过滤器过滤，超滤后在40℃下减压浓缩，得提取物稠膏；将提取物稠膏、药用聚乙二醇、甘露醇和医用氯化钠混合，用注射用水稀释，滤过，灌封、灭菌、灯检、包装，即得乙药物注射液。
1.1.4.4丙药物注射液：
处方：丹参300g、川芎200g、骨碎补500g。
制备方法：取干燥的丹参300g、川芎200g和骨碎补500g，混合，粉碎成粗粉，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取得到水蒸气蒸馏提取物，备用；取水蒸气蒸馏提取后的药渣，加入8倍重量比的70%乙醇浸渍50h，再用70%乙醇作溶剂缓慢渗滤至滤液呈微黄色，滤液在70℃下减压浓缩得相对密度为1.25的提取物稠膏；将提取物稠膏、水蒸气蒸馏提取物、药用聚乙二醇、甘露醇和医用氯化钠混合，用注射用水稀释，滤过，灌封、灭菌、灯检、包装，即得丙药物注射液。
1.1.4.5丁药物注射液：
处方：丹参300g、川芎200g、骨碎补500g。
制备方法：取干燥的丹参300g、川芎200g和骨碎补500g，混合，粉碎成粗粉，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取得到水蒸气蒸馏提取物，备用；取水蒸气蒸馏提取后的药渣，加入8倍重量比的70%乙醇浸渍50h，再用70%乙醇作溶剂缓慢渗滤至滤液呈微黄色，滤液在70℃下减压浓缩得相对密度为1.25的稠膏；再加12倍水充分搅拌并静置24h使油水分离，去除沉淀物和油脂，收集水层药液，加入药用活性炭静置2h吸附药液至无色，药液经膜过滤器过滤，超滤后在40℃下减压浓缩，得提取物稠膏；将提取物稠膏、水蒸气蒸馏提取物、药用聚乙二醇、甘露醇和医用氯化钠混合，用注射用水稀释，滤过，灌封、灭菌、灯检、包装，即得丁药物注射液。
1.2 方法：
（1）分组与给药：动物分成：正常对照组、模型对照组、血塞通注射液组、甲药物注射液组、乙药物注射液组、丙药物注射液组、丁药物注射液组，共7个组，每组10只动物。正常对照组乳鼠不作任何处理。模型对照组乳鼠出生10d乳鼠肘关节以上剪除左前肢。自尾根部剪除尾部，烧灼止血后放回笼中，继续由母鼠喂养。1个月后，开始灌服醋酸泼尼松，20mg/kg体重，隔日1次，共30d。甲药物注射液组、乙药物注射液组、丙药物注射液组、丁药物注射液组、血塞注射液给药组：在大鼠灌服醋酸泼尼松同时每天静脉注射给药一次，共30d。
（2）检测指标：股骨骨密度，股骨强度、钢性，股骨湿重、干重、灰重，股骨头毛细血管分布观察，股骨头骨组织内脂肪沉积观察。
1.3 统计学处理：
各组结果以均数±标准差（±s）表示。选择Student检验进行各组间算术平均数的差异显著性检验。
结果
2.1 甲药物注射液组的股骨BMD、BMC、骨强度、骨钢性、AREA含量明显高于模型对照组，也高于乙药物注射液组、丙药物注射液组、丁药物注射液组（P<0.01，表1）。
2.2 甲药物注射液组的股骨湿重明显高于模型对照组，也高于乙药物注射液组、丙药物注射液组、丁药物注射液组，甲药物注射液还可以明显降低软骨和骨细胞脂肪着色率，明显高于模型对照，也高于乙药物注射液、丙药物注射液、丁药物注射液（P<0.05，表2）。
2.3 模型动物的股骨头内毛细血管明显稀疏，排列紊乱，单位面积内毛细血管所占比例明显下降。甲药物注射液治疗组股骨头内毛细血管接近恢复正常水平股骨头内密布毛细血管，排列也较规律。
表1 对大鼠股骨骨密度、骨矿、骨面积、骨强度和骨钢性的影响（n=10）
注：与模型对照组比较，*P<0.05，#P<0.01；与正常对照组比较，△P<0.01；与血塞通组比较，☆P<0.05，▲P<0.01
表2 对大鼠股骨重量、软骨和骨细胞脂肪着色率的影响（n=10）
注：与模型对照组比较，*P<0.05，#P<0.01；与正常对照组比较，△P<0.01；与血塞通注射液组比较，☆P<0.05，▲P<0.01
3 讨论与结论
本研究结果表明，甲药物注射液活血化瘀用于治疗股骨头坏死有较好的改善作用，能增加股骨骨密度，骨矿度，骨重量，骨强度，骨钢性，改善股骨上毛细血管紊乱，降低股骨骨细胞内脂肪着色率。同时，甲药物注射液治疗股骨头坏死作用优于乙药物注射液、丙药物注射液、丁药物注射液，提示甲药物注射液的组方及制备工艺具有明显优势，在特定的组方和特定的制备方法下，具有特别突出的有益效果。
实验二：本发明注射液安全性实验报告
为探讨本发明注射液临床用药的安全性，本研究进行了安全性实验。
受试药物：
本发明注射液药物：
处方：丹参300g、川芎200g、骨碎补500g。
制备方法：（1）取150g丹参、取100g川芎、取250g骨碎补，加10倍量的蒸馏水煎煮3次，第1次3h，第2次2h，第3次1h，三次煎煮液合并，滤过，滤液浓缩至稠膏状，冷却后加无水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次达到60%、75%、95%，三次醇沉液合并，滤过，滤液用NaOH溶液调pH值至9，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醇，加入2倍量的乙醚，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醚，转溶于水，水溶液抽滤至清，得提取液Ⅰ；
（2）取150g丹参、取100g川芎、取250g骨碎补，置药材于渗漉缸中，以8倍量50%乙醇浸渍48h，收集初漉液，再用8倍量65%乙醇渗漉药材至无药味，合并两次渗漉液，浓缩至稠粘状，用无水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次达到80%、90%，两次醇沉液合并，滤过，滤液用稀盐酸调其pH值为4，冷藏，静置24h，滤过，滤液浓缩，加无水乙醇进行第三次醇沉，使含醇量达到95%，滤过，挥尽滤液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀盐酸调pH值为4，煮沸，抽滤，滤液再用NaOH溶液调pH值为7，得提取液Ⅱ；
（3）将以上提取液Ⅰ与提取液Ⅱ合并，加注射用水至足量，再加苯甲醇、氯化钠、吐温-80溶解于其中，并用NaOH溶液调pH值为7，加1%针用活性炭于溶液中煮沸10min，抽滤，滤液经检验合格后无菌分装，分装好的注射液用流通蒸汽灭菌0.5h，稍冷后灯检，即得。
2 方法
2.1 局部刺激性实验
2.1.1 实验动物
日本大耳白家兔，雌雄兼用，体重2.0～2.5Kg，由黑龙江中医药大学动物中心提供。动物合格证号：医动字第1024－03号。实验动物均预先饲养24小时，适应实验室饲养条件。
2.1.2实验方法
取健康无损伤的家兔2只，以无菌操作法分别在其左右两腿股四头肌内各注入供试品1.0mL/只，注射后48h处死动物，解剖取出股四头肌，纵向切开，观察注射部位局部刺激反应，按表3换算成相应的反应级。
表3 注射肌肉刺激反应评级标准
2.1.3 实验结果
实验结果表明：两只家兔，经肌肉注射后，家兔健康正常，腿部活动正常。家兔处死取出股四头肌后，肉眼观察给药部位，给予本发明注射液的2例股四头肌刺激反应级数各为0级。提示本品对家兔股四头肌无刺激作用。
2.2血管刺激性实验
2.2.1实验动物
日本大耳白家兔，雌雄兼用，体重2.0～2.5Kg，由黑龙江中医药大学动物中心提供。动物合格证号：医动字第1024－03号。实验动物均预先饲养24小时，适应实验室饲养条件。
2.2.2实验方法
取健康、两耳无损伤的家兔2只。用无菌操作方法于左耳耳缘静脉注射灭菌生理盐水2.0mL/Kg，于右耳耳缘静脉注射本发明注射液的浓缩液2.0mL/Kg，1次/d，连续3d。于末次注射24h后将动物放血处死，分别距注射部位进针点2cm处向心端剪下耳缘约2cm作为标本，标本用福尔马林固定，常规组织切片，观察血管周围变化、血管壁是否损伤、内皮细胞有无脱落、有无血栓形成以及其他病理变化。
2.2.3实验结果
实验结果表明：家兔左右耳肉眼观察注射部位均无异常，血管无充血，周围组织无水肿现象。病理切片观察结果表明，给予生理盐水的2例耳缘和给予本发明注射液的2例耳缘均未见血管扩张和炎细胞浸润，提示本品对家兔血管无刺激作用。
2.3过敏实验
2.3.1实验动物
健康无伤雄性豚鼠，由黑龙江中医药大学动物中心提供。动物合格证号：医动字第1024－03号。实验动物均预先饲养24小时，适应实验室饲养条件。
2.3.2实验方法
取健康无伤豚鼠8只，体重250～350g，间日腹腔注射供试品0.5mL，连续3次，然后分为两组，每组4只，分别在第1次注射后14d及21d静脉注射本品1mL进行攻击，在注射后15min内观察动物反应。如有竖毛、呼吸困难、喷嚏、干呕或咳嗽3声等现象中的两种或两种以上者，或有啰音、抽搐、虚脱或死亡现象之一者为阳性。
2.3.3实验结果
实验结果表明：本发明注射液于第1次腹腔注射后第10天和第15天进行攻击，均未发生过敏反应，表明在本次实验条件下，本发明注射液对豚鼠无全身性致敏作用结果见表4。
表4 不同时间过敏实验观察结果
“ -”表示为阴性结果 ；“ +”表示为阳性结果
2.4溶血性实验
2.4.1实验动物
日本大耳白家兔，雄性，体重2.3Kg，由黑龙江中医药大学动物中心提供。动物合格证号：医动字第1024－03号。实验动物均预先饲养24小时，适应实验室饲养条件。
2.4.2实验方法
取健康家兔1只，从颈总动脉取血约10mL，放置于200mL三角瓶中，用玻璃棒搅动血液10min，除去纤维蛋白原，使成脱纤血液，加约10倍量的生理盐水，摇匀，离心（2000r/min，5min）除去上清液，沉淀的红血球再用生理盐水如下法洗涤2～3次，至上清液不显红色为止。取沉淀的红细胞1mL，加生理盐水50mL，制得2%的兔红细胞混悬液。取试管7支，按表3配比量依次加入2%兔红细胞混悬液和生理盐水，混匀后，置于37℃恒温水浴箱30min，然后分别加入不同量的上述药液（第6管为阴性对照管，第7管为阳性对照管），摇匀，置37℃恒温水浴箱中。开始每隔15min观察1次，1h后，每隔1h观察1次，共4次。见表5。
表5溶血实验配比量表 mL
2.4.4溶血判定标准
全溶血：溶液澄明红色，管底无细胞残留；部分溶血：溶液澄明红色或棕色，管底有少量红细胞残留；无溶血：红细胞全部下沉，上层液体无色澄明；凝集：虽无溶血，但出现红细胞凝集，振摇后不分散。
2.4.5实验结果
本发明注射液无溶血和凝集反应结果见表6。
表6 各种时段溶血实验结果
“-”表示无溶血或凝集反应，“+”表示有溶血或凝集反应
3 结论
本发明注射液经动物实验结果表明其安全性好，可供临床使用。
实验三：本发明实施例1注射剂临床观察
临床观察：男性6例，女性5例，共11例，年龄55～62岁。
临床表现：局部红肿、刺痛，疼有定处，入夜尤甚，面色暗，发质暗红，脉沉，中医诊断为气滞血瘀型，西医诊断为局部疼痛或放射性疼痛；腰向健侧弯曲：“4”字征（+）；骨盆分离试验阳性；肌肉萎缩；X线片、CT片显示有骨坏死的临床表现。
临床疗效显示：患者日静脉滴注一次，每次10mL，溶于200mL 0.9%氯化钠溶液，10天为一个疗程，跟踪观察统计治疗骨坏死总有效率为90.9%。
实验四：HPLC-ELSD法同时测定本发明注射液中丹参酸甲酯、丁烯基酞内酯、双羟基异补骨脂定3种成分的含量
1 材料
Waters 2690四元梯度自动进样色谱系统；Al-tech2000型ELSD检测器。Empower化学工作站。
丹参酸甲酯对照品、丁烯基酞内酯对照品、双羟基异补骨脂定对照品，均购于深圳子科生物科技有限公司。甲醇为色谱纯；0.2mol/L磷酸二氢钠溶液为分析纯；水为超纯水。
本发明注射液：处方：丹参300g、川芎200g、骨碎补500g。
制备方法：（1）取150g丹参、取100g川芎、取250g骨碎补，加10倍量的蒸馏水煎煮3次，第1次3h，第2次2h，第3次1h，三次煎煮液合并，滤过，滤液浓缩至稠膏状，冷却后加无水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次达到60%、75%、95%，三次醇沉液合并，滤过，滤液用NaOH溶液调pH值至9，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醇，加入2倍量的乙醚，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醚，转溶于水，水溶液抽滤至清，得提取液Ⅰ；
（2）取150g丹参、取100g川芎、取250g骨碎补，置药材于渗漉缸中，以8倍量50%乙醇浸渍48h，收集初漉液，再用8倍量65%乙醇渗漉药材至无药味，合并两次渗漉液，浓缩至稠粘状，用无水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次达到80%、90%，两次醇沉液合并，滤过，滤液用稀盐酸调其pH值为4，冷藏，静置24h，滤过，滤液浓缩，加无水乙醇进行第三次醇沉，使含醇量达到95%，滤过，挥尽滤液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀盐酸调pH值为4，煮沸，抽滤，滤液再用NaOH溶液调pH值为7，得提取液Ⅱ；
（3）将以上提取液Ⅰ与提取液Ⅱ合并，加注射用水至足量，再加苯甲醇、氯化钠、吐温-80溶解于其中，并用NaOH溶液调pH值为7，加1%针用活性炭于溶液中煮沸10min，抽滤，滤液经检验合格后无菌分装，分装好的注射液用流通蒸汽灭菌0.5h，稍冷后灯检，即得。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Agilent Zorbax SB-C18分析柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为：甲醇-0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液，线性梯度洗脱，0至15min，流动相甲醇的比例从95%线性递减到65%，流动相0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液的比例从5%线性递增到35%；16至30min，流动相甲醇的比例从65%递减到50%，流动相0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液的比例从35%线性递增到50%；31至40min，流动相甲醇的比例从50%递减到20%，流动相0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液的比例从50%线性递增到80%；体积流量0.5mL·min-1；检测器参数：载气流量2.0L·min-1，漂移管温度90℃。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取丹参酸甲酯对照品、丁烯基酞内酯对照品、双羟基异补骨脂定对照品各适量，加甲醇适量，超声3min使溶解，用甲醇制成每1mL含丹参酸甲酯0.50mg，丁烯基酞内酯0.50mg，双羟基异补骨脂定0.10mg的混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
精密吸取待测样品注射液2mL，置25mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
2.4 方法学考察
2.4.1 线性关系的考察
精密吸取丹参酸甲酯、丁烯基酞内酯和双羟基异补骨脂定混合对照品溶液（含丹参酸甲酯0.50g·L-1，丁烯基酞内酯0.50g·L-1，双羟基异补骨脂定0.10g·L-1）1，2，3，4，5，6，7μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以各样品质量浓度的对数为横坐标，以相应的峰面积积分值的对数为纵坐标，得回归方程，分别为：
丹参酸甲酯：Y=5.7854+2.3654X（r=0.9975）；
丁烯基酞内酯：Y=7.1256+2.5698X（r=0.9914）；
双羟基异补骨脂定：Y=7.1568+2.3698X（r=0.9988）。
2.4.2精密度试验
精密吸取同一混合对照品溶液，连续进样6次，测定各峰峰面积值，计算丹参酸甲酯、丁烯基酞内酯和双羟基异补骨脂定RSD分别为1.2%、1.1%、1.4%。
2.4.3 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液，分别在制备后的1，2，3，4，5，6h进样分析，测定各成分峰面积，计算丹参酸甲酯、丁烯基酞内酯和双羟基异补骨脂定RSD分别为0.3%、0.8%、1.2%。结果表明供试品溶液中这3种成分在6h内稳定。
2.4.4 重复性试验
取样品（批号150612）6份，制备供试品溶液，按含量测定方法要求测定其含量，结果丹参酸甲酯、丁烯基酞内酯和双羟基异补骨脂定质量分数的RSD分别为0.8%、1.0%、1.3%。
2.4.5回收率试验
精密吸取样品（批号150622）1mL，置25mL量瓶中，精密加入混合对照品甲醇溶液（丹参酸甲酯0.5000g·L-1；丁烯基酞内酯0.5000g·L-1；双羟基异补骨脂定0.1000g·L-1）10mL，加甲醇稀释至刻度，按正文下方法进行试验，结果见表7、表8、表9。
表7 丹参酸甲酯加样回收率
注：样品中量均为5.155mg；加入量均为5.000mg。
表8 丁烯基酞内酯加样回收率
注：样品中量均为5.265mg；加入量均为5.000mg。
表9 双羟基异补骨脂定加样回收率
注：样品中量均为1.112mg；加入量均为1.000mg。
2.5样品测定
精密吸取混合对照品溶液2μL，6μL和供试品溶液5μL，对6批本发明注射液进行测定，用外标两点法计算含量，测定结果见表10。
表10 6批样品质量浓度 g·L-1
3讨论
本研究所建立的采用HPLC-ELSD方法，可以同时测定本发明注射液中上述丹参酸甲酯、丁烯基酞内酯、双羟基异补骨脂定3种成分，方法简便、准确、重复性好，可以检测本发明注射液的质量，为该注射剂提供了一种可靠、实用的检测方法。
实验五：不同药物中丹参酸甲酯、丁烯基酞内酯、双羟基异补骨脂定的含量测定
1 待测样品
1.1 甲药物注射液：
处方：丹参300g、川芎200g、骨碎补500g。
制备方法：（1）取150g丹参、取100g川芎、取250g骨碎补，加10倍量的蒸馏水煎煮3次，第1次3h，第2次2h，第3次1h，三次煎煮液合并，滤过，滤液浓缩至稠膏状，冷却后加无水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次达到60%、75%、95%，三次醇沉液合并，滤过，滤液用NaOH溶液调pH值至9，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醇，加入2倍量的乙醚，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醚，转溶于水，水溶液抽滤至清，得提取液Ⅰ；
（2）取150g丹参、取100g川芎、取250g骨碎补，置药材于渗漉缸中，以8倍量50%乙醇浸渍48h，收集初漉液，再用8倍量65%乙醇渗漉药材至无药味，合并两次渗漉液，浓缩至稠粘状，用无水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次达到80%、90%，两次醇沉液合并，滤过，滤液用稀盐酸调其pH值为4，冷藏，静置24h，滤过，滤液浓缩，加无水乙醇进行第三次醇沉，使含醇量达到95%，滤过，挥尽滤液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀盐酸调pH值为4，煮沸，抽滤，滤液再用NaOH溶液调pH值为7，得提取液Ⅱ；
（3）将以上提取液Ⅰ与提取液Ⅱ合并，加注射用水至足量，再加苯甲醇、氯化钠、吐温-80溶解于其中，并用NaOH溶液调pH值为7，加1%针用活性炭于溶液中煮沸10min，抽滤，滤液经检验合格后无菌分装，分装好的注射液用流通蒸汽灭菌0.5h，稍冷后灯检，即得。
1.2 乙药物注射液：
处方：丹参300g、川芎200g、骨碎补500g。
制备方法：取干燥的丹参300g、川芎200g和骨碎补500g，混合，粉碎成粗粉，加入8倍重量比的70%乙醇浸渍50h，再用70%乙醇作溶剂缓慢渗滤至滤液呈微黄色，滤液在70℃下减压浓缩得相对密度为1.25的稠膏；再加12倍水充分搅拌并静置24h使油水分离，去除沉淀物和油脂，收集水层药液，加入药用活性炭静置2h吸附药液至无色，上聚酰胺色谱柱，用水饱和正丁醇洗脱，洗脱液在70℃下减压浓缩后加入10倍重量的95%乙醇进行二次乙醇提取，乙醇提液在6℃冷藏24h后过滤，滤液经减压浓缩后，再加入10倍重量份的水进行水提，经冷藏后24h，4℃离心过滤得水提液，水提液用0.3%重量比的活性炭脱色，边加边搅拌，并加热至40℃后静止1h；经膜过滤器过滤，超滤后在40℃下减压浓缩，得提取物稠膏；将提取物稠膏、药用聚乙二醇、甘露醇和医用氯化钠混合，用注射用水稀释，滤过，灌封、灭菌、灯检、包装，即得乙药物注射液。
1.3 丙药物注射液：
处方：丹参300g、川芎200g、骨碎补500g。
制备方法：取干燥的丹参300g、川芎200g和骨碎补500g，混合，粉碎成粗粉，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取得到水蒸气蒸馏提取物，备用；取水蒸气蒸馏提取后的药渣，加入8倍重量比的70%乙醇浸渍50h，再用70%乙醇作溶剂缓慢渗滤至滤液呈微黄色，滤液在70℃下减压浓缩得相对密度为1.25的提取物稠膏；将提取物稠膏、水蒸气蒸馏提取物、药用聚乙二醇、甘露醇和医用氯化钠混合，用注射用水稀释，滤过，灌封、灭菌、灯检、包装，即得丙药物注射液。
1.4 丁药物注射液：
处方：丹参300g、川芎200g、骨碎补500g。
制备方法：取干燥的丹参300g、川芎200g和骨碎补500g，混合，粉碎成粗粉，将其进行水蒸气蒸馏提取，从中提取得到水蒸气蒸馏提取物，备用；取水蒸气蒸馏提取后的药渣，加入8倍重量比的70%乙醇浸渍50h，再用70%乙醇作溶剂缓慢渗滤至滤液呈微黄色，滤液在70℃下减压浓缩得相对密度为1.25的稠膏；再加12倍水充分搅拌并静置24h使油水分离，去除沉淀物和油脂，收集水层药液，加入药用活性炭静置2h吸附药液至无色，药液经膜过滤器过滤，超滤后在40℃下减压浓缩，得提取物稠膏；将提取物稠膏、水蒸气蒸馏提取物、药用聚乙二醇、甘露醇和医用氯化钠混合，用注射用水稀释，滤过，灌封、灭菌、灯检、包装，即得丁药物注射液。
2 测定方法
采用本发明实验四提供的检测方法对各个药物中的活性成分进行含量测定。
3 测定结果
测定结果见表11
表11 样品含量测定结果 （g·L-1，n=3）
4 讨论与结论
从表11中可以看出，甲药物注射液中的丹参酸甲酯、丁烯基酞内酯、双羟基异补骨脂定的含量明显高于其他药物，这可能也是甲药物注射液在治疗股骨头坏死方面的效果优于其他药物的原因。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进行进一步阐述：
实施例1：
处方：处方：丹参300g、川芎200g、骨碎补500g。
制备方法：（1）取150g丹参、取100g川芎、取250g骨碎补，加10倍量的蒸馏水煎煮3次，第1次3h，第2次2h，第3次1h，三次煎煮液合并，滤过，滤液浓缩至稠膏状，冷却后加无水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次达到60%、75%、95%，三次醇沉液合并，滤过，滤液用NaOH溶液调pH值至9，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醇，加入2倍量的乙醚，冷藏，静置24h，滤过，滤液挥去乙醚，转溶于水，水溶液抽滤至清，得提取液Ⅰ；
（2）取150g丹参、取100g川芎、取250g骨碎补，置药材于渗漉缸中，以8倍量50%乙醇浸渍48h，收集初漉液，再用8倍量65%乙醇渗漉药材至无药味，合并两次渗漉液，浓缩至稠粘状，用无水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次达到80%、90%，两次醇沉液合并，滤过，滤液用稀盐酸调其pH值为4，冷藏，静置24h，滤过，滤液浓缩，加无水乙醇进行第三次醇沉，使含醇量达到95%，滤过，挥尽滤液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀盐酸调pH值为4，煮沸，抽滤，滤液再用NaOH溶液调pH值为7，得提取液Ⅱ；
（3）将以上提取液Ⅰ与提取液Ⅱ合并，加注射用水至足量，再加苯甲醇、氯化钠、吐温-80溶解于其中，并用NaOH溶液调pH值为7，加1%针用活性炭于溶液中煮沸10min，抽滤，滤液经检验合格后无菌分装，分装好的注射液用流通蒸汽灭菌0.5h，稍冷后灯检，即得。
采用HPLC-ELSD法同时测定丹参酸甲酯、丁烯基酞内酯、双羟基异补骨脂定3种成分的含量
（1）色谱条件：Agilent Zorbax SB-C18分析柱；流动相为：甲醇-0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液，线性梯度洗脱，0至15min，流动相甲醇的比例从95%线性递减到65%，流动相0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液的比例从5%线性递增到35%；16至30min，流动相甲醇的比例从65%递减到50%，流动相0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液的比例从35%线性递增到50%；31至40min，流动相甲醇的比例从50%递减到20%，流动相0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液的比例从50%线性递增到80%；体积流量0.5mL·min-1；检测器参数：载气流量2.0L·min-1，漂移管温度90℃；
（2）对照品溶液的制备：精密称取丹参酸甲酯对照品、丁烯基酞内酯对照品、双羟基异补骨脂定对照品各适量，加甲醇适量，超声3min使溶解，用甲醇制成每1mL含丹参酸甲酯0.50mg，丁烯基酞内酯0.50mg，双羟基异补骨脂定0.10mg的混合对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：精密吸取待测样品注射液2mL，置25mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得；
（4）测定：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各5μL，注入高效液相色谱仪进行测定；
（5）测定结果：丹参酸甲酯含量为5.214g·L-1、丁烯基酞内酯含量为5.126g·L-1、双羟基异补骨脂定含量为1.118g·L-1。
根据《中国药典》2010年版二部附录XIXC稳定性试验指导原则，对最优组合的实施例1制得样品进行稳定性试验考察：
加速试验：将实施例1样品，置于温度40℃、相对湿度75％的恒温恒湿箱中，放置6个月，分别于第1、2、3、6个月时取样，按照稳定性考察项目进行检测，并与0月的数据进行比较。
长期试验：将实施例1样品，置于温度25℃、相对湿度60％的条件下放置，分别于第3、6、12、18个月时取样，按照考察项目进行检测，并与0月的数据进行比较。稳定性试验结果见表12。
表12 实施例1注射液稳定性考察试验结果
由表12数据可见，本发明注射液加速试验6月与长期试验18月后，各项质量均符合规定，本发明技术方案制备的注射液质量稳定可控。