破坏丙酮酸激酶M2和整合素相互作用的分子和其用途的制作方法

相关申请

本申请要求2015年2月月26日提交的美国临时专利申请第62/121,338号的权益，所述申请以全文引用的方式并入本文。

本发明所公开的主题大体上涉及用于治疗与受试者的异常整合素αvβ3表达相关联的疾病的组合物和方法。更具体地说，方法涉及向受试者投予有效量的包含抑制pkm2与整合素αvβ3结合的丙酮酸激酶异构体m2(pkm2)拮抗剂的组合物。

背景技术：

现在存在大量的和有说服力的数据主体，其支持整合素αvβ3在激活巨噬细胞依赖性炎症、破骨细胞产生、迁移和骨吸收和发炎性血管生成中起重要作用。所有这些过程在类风湿性关节炎(ra)和相关关节病的发病机理中起重要作用。因此，需要特异性抑制异常整合素αvβ3活性的试剂。

技术实现要素：

如本文中所公开的，丙酮酸激酶异构体m2(pkm2)通过作用于整合素αvβ3促进肌成纤维细胞分化。因此，公开方法用于破坏或阻止pkm2和整合素αvβ3的相互作用。方法涉及向受试者投予有效量的包含抑制pkm2与整合素αvβ3结合/相互作用的pkm2拮抗剂的组合物。pkm2拮抗剂可为通过在整合素相互作用位点处或靠近所述位点结合pkm2有效地抑制此相互作用的任何分子。举例来说，pkm2拮抗剂可为抗体(例如人类化抗体或片段)、小分子、肽或肽模拟物。

所公开的组合物和方法可用于治疗涉及异常整合素αvβ3表达的任何疾病或病况。举例来说，在一些实施例中，方法治疗纤维化疾病，如动脉粥样硬化、哮喘、心脏纤维化、肌肉纤维化、胰腺纤维化、骨髓纤维化、间质性肝纤维化、肝硬化和胆囊硬化、硬皮病、肺纤维化、弥漫性实质性肺病、特发性间质纤维化、间质性肺炎、落屑性间质性肺炎、呼吸道细支气管炎、间质性肺病、急性间质性肺炎、非特异性间质性肺炎、隐源性机化性肺炎、淋巴球性间质性肺炎、肾纤维化或慢性肾病。在一些实施例中，方法抑制或防止受试者病灶的纤维化和/或疤痕。

在一些实施例中，方法治疗骨质疏松。骨质疏松通过激活的破骨细胞活性由过度活性骨吸收引起。激活破骨细胞表达高水平的整合素αvβ3。胞外pkm2可能在破骨细胞活化和细胞凋亡耐药中起作用。因此，所公开的pkm2拮抗剂可对于骨质疏松治疗有效。

在一些实施例中，方法治疗类风湿性关节炎(ra)、相关风湿性疾病和关节病或自身免疫疾病。这些疾病均与通过活化整合素αvβ3信号传导的巨噬细胞的活化有关。

此外公开的为包含特异性破坏丙酮酸激酶异构体m2(pkm2)与整合素αvβ3结合的中和抗体(例如人类化抗体或片段)和药学上可接受的载剂的医药组合物。

在附图和下文描述中阐述本发明公开的主题的一个或多个实施例的细节。本发明所公开的主题的其它特征、目标和优点将从描述和图式且从权利要求书而显而易见。

附图说明

图1示出了促进肌成纤维细胞分化的pkm2的图像，其包括其中通过α-sma的免疫印迹(ib:α-sma)分析在hdfa细胞中的α-sma的细胞水平的图1a，用抗-α-sma(绿色)、罗丹明毒伞素(红色)和dapi(蓝色)的hdfa细胞的if染色的代表性图像的图1b，其中用在左侧示出的细胞用指示试剂处理的图1c，其中通过免疫印迹分析在通过指示的试剂处理的hdfa细胞中磷酸化smad2、smad2/3和α-sma的细胞水平(ib:p-smad2、ib:smad2/3和ib:α-sma)的图1d。

图2包括示出胞外pkm2激活整合素αvβ3信号传导的曲线和图像。来自rpkm2-hdfa的下拉交联带的his-标记的胰蛋白酶分解的肽片段(带下划线的)通过匹配整合素β3和pkm2的氨基酸序列的maldi-tof/tof交联和分析。

图3包括示出在存在5μg/ml的lm609(空白棒)或bsa(填充棒)的情况下hdfa细胞附着到缓冲液、rpkm1和rpkm2涂布的板的条形图。附着表示为每个视场附着到板的细胞的总数。误差棒为五次独立实验的测量结果的标准差。

图4包括示出通过α-sma的免疫印迹(ib:α-sma)分析在hdfa细胞中的α-sma的细胞水平的图像。细胞通过指示的试剂处理。

图5包括示出使用针对磷酸化fak的抗体(ib:p-fak)检测在hdfa细胞中磷酸化fak的细胞水平的图像。细胞通过指示的试剂处理。fak的免疫印迹(ib:fak)指示总fak的水平。在(c)和(d)中，gapdh的免疫印迹为内参考物。

图6包括示出在伤口部位处pkm2抗体对血管生成的影响的图像。(左)通过蛋白g/a珠由单克隆抗体iggpk或兔免疫前血清(iggcon)纯化的igg。(右)在sw620细胞提取物中通过iggpk的纯化的igg的pkm2的特异性识别。

图7包括示出α-sma染色与纤维母细胞er-tr7染色共存的图像。具有针对小鼠α-sma(绿色)、小鼠平滑肌肌球蛋白重链(上部，红色)和er-tr7(底部，红色)的抗体的伤口组织切片的免疫染色的代表性图像。蓝色为dapi染色。融合为三个颜色染色的重叠。组织切片由伤口诱导后三天伤口的组织样本制备。

图8包括示出pkm2经由与整合素αvβ3相互作用而起作用的图像。图8a示出了rpkm2与hdfa细胞表面蛋白质的交联通过pkm2的免疫印迹(ib:pkm2)展现。rpkm2通过戊二醛与hdfa细胞交联。提取物由交联的细胞制备。his标记的rpkm2通过ni珠从制备的提取物拉下。ni珠沉淀通过免疫印迹分析。图8b为整合素β3的共免疫沉淀，其中pkm2(ip:iggpk)通过整合素β3的免疫印迹(ib:β3)检测。pkm2的免疫印迹(ib:pkm2)指示沉淀下来的pkm2的量。使用由免疫前血清纯化的igg(ip:iggcon)的免疫沉淀为对照免疫沉淀。igg重链(igghc)的免疫印迹指示用于每个免疫沉淀的igg的量。

图9包括示出pkm2经由pi3k的活化而起作用的图像。图9a示出在存在指示的试剂的情况下在hdfa细胞中的p21-依赖性激酶2(pak2)的活化分析磷酸化pak2的免疫印迹(ib:p-pak2)。总细胞pak2的免疫印迹(ib:pak2)为指示pak2的总细胞水平的对照。图9b示出了通过α-sma的免疫印迹(ib:d-sma)分析在指示处理下的在hdfa细胞中的α-sma的表达。gapdh的免疫印迹(ib:gpdh)为内参考物。

图10为示出了在存在fbp的情况下rpkm2、rpkm1、bsa和rpkm2与整合素αvβ3结合的代表性结合曲线的图，其通过具有固定于biacore芯片上的整合素的biacore监测。

图11为示出在整合素αvβ3头部片上pkm2二聚体的对接的图。基于在rpkm2和重组整合素αvβ3之间的化学交联计算对接模型。

图12包括示出在rpkm2二聚体和整合素αvβ3头部片之间化学交联图谱的图。相同着色的残余物表示在整合素和pkm2之间每个相对应的交联对。

图13包括示出在存在针对pkm2(填充棒)和兔igg(空白棒)的单克隆抗体的情况下整合素αvβ3与rpkm2结合的elisa分析的条形图。rpkm23μm首先涂布在板上。各种浓度的抗体或igg与整合素αvβ3混合添加到板。在充分洗涤之后，整合素αvβ3与经涂布的rpkm2的结合通过针对整合素的第二抗体测定，作为elisa读数，并且通过在不存在抗体或igg的情况下将结合整合素定义为100％，表示为相对结合整合素。误差棒表示五次重复实验的标准差。

图14包括示出在存在针对pkm2(填充棒)和兔igg(空白棒)的单克隆抗体的情况下整合素αvβ3与rpkm2结合的elisa分析的条形图。重组整合素αvβ33μm首先涂布在板上。各种浓度的抗体或igg与rpkm2混合添加到板。在充分洗涤之后，rpkm2与经涂布的整合素αvβ3的结合通过针对整合素的第二抗体测定，作为elisa读数，并且通过在不存在抗体或igg的情况下将结合rpkm2定义为100％，表示为相对结合rpkm2。误差棒表示五次重复实验的标准差。

图15包括示出通过在充分洗涤之后细胞计数分析在存在抗pkm2抗体(填充棒)或兔igg(空白棒)的情况下huvec细胞附着到pkm2(3μm)涂布的板的条形图。统计每个显微视野附着的细胞(四个视野的平均值)。误差棒表示五次重复实验的标准差。

图16包括示出pkm2有助于肝纤维化进展的曲线。

图17包括示出由逆转肝纤维化的pkm2抗体构成的治疗的曲线。

图18pkm2抗体逆转博莱霉素引起肺纤维化

肺纤维化由博莱霉素引起。

定义

术语“纤维化”是指涉及在器官或组织中过量纤维结缔组织的任何疾病或病状。

术语“中和”是指试剂如抗体特异性结合配位体并且在如此操作时阻断或抑制配位体的生物活性的能力。中和抗体为抑制或消除其靶抗原的一些生物活性的抗体。

术语“抗体”是指结合或选择性地结合靶抗原的天然或合成抗体。术语包括多克隆和单克隆抗体。除了完整免疫球蛋白分子之外，此外包括在术语“抗体”内的为选择性地结合靶抗原的那些免疫球蛋白分子和人类或人类化形式的免疫球蛋白分子的片段或聚合物。

术语“单克隆抗体”可从基本上同源的抗体群体获得，即，在群体内的个别抗体除了可以抗体分子的小子集存在的可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中重和/或轻链的一部分与在衍生自特定物种或属于具体抗体类别或子类别的抗体中相对应的序列相同或同源，同时(一个或多个)链的剩余部分与在衍生自另一个物种或属于另一个抗体类别或子类别的抗体以及这类抗体的片段中的相对应的序列相同或同源，只要它们呈现期望的拮抗活性。单克隆抗体可衍生自包括但不限于兔和小鼠的物种。

术语“肽”、“蛋白”和“多肽”互换使用是指包含通过一个氨基酸的羧基键联到另一个氨基酸的α氨基的两个或更多个氨基酸的天然或合成分子。

蛋白的“活性”包括例如转录、转译、胞内易位、分泌、通过激酶磷酸化、通过蛋白酶断裂、与其它蛋白质同嗜性和异嗜性结合、泛素化。

术语“肽模拟物”是指包括正常肽化学性质的一些变化的肽的模拟物。肽模拟物通常增强初始肽的一些特性，如提高稳定性、提高的功效、增强的递送、提高的半衰期等。举例来说，在美国专利第5,631,280号；第5,612,895号；和第5,579,250号中描述基于已知多肽序列制备肽模拟物的方法。肽模拟物的用途可涉及在给定位置处并入具有非酰胺键的非氨基酸残基。

术语“特异性结合”是指决定在蛋白和其它生物制剂的异源群体中存在抗原或受体的结合反应。一般来说，“特异性结合”第二分子(例如抗原)的第一分子(例如抗体)与第二分子的亲和力常数(ka)大于约10⁵m^-1(例如10⁶m^-1、10⁷m^-1、10⁸m^-1、10⁹m^-1、10¹⁰m^-1、10¹¹m^-1和10¹²m^-1或更大)。

术语“受试者”是指为投予或治疗的目标的任何个体。受试者可为脊椎动物，例如哺乳动物。因此，受试者可为人类或家畜患者术语“患者”是指在临床医生(例如医师)的治疗下的受试者。

术语“治疗有效”是指足以改善疾病或病症的一种或多种原因或症状的组合物的量。这类改善仅需要疾病或病症的降低或变化，不一定消除疾病或病症。

“药学上可接受”是指在合理医学判断的范围内，适合用于与人类和动物的组织接触，而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，相应具有合理的受益/风险比率的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

术语“治疗”是指以治愈、改善、稳定或预防疾病、病理性病状或病症为意图而对患者进行医学管理。这一术语包括积极治疗，即专门为了改善疾病、病理性病状或病症而进行的治疗，并且还包括病因治疗，即专门为了去除相关疾病、病理性病状或病症的原因而进行的治疗。另外，这一术语包括缓解性治疗，即为了缓解症状而非治愈疾病、病理性病状或病症而设计的治疗；预防性治疗，即为了最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理性病状或病症的发展而进行的治疗；以及支持性治疗，即为了对另一种改善相关疾病、病理性病状或病症的具体疗法加以补充而采用的治疗。

术语“抑制”是指活性、响应、病状、疾病或其它生物参数的降低。这可包括但不限于活性、响应、病状或疾病的完全消失。这还可包括例如活性、响应、病状或疾病相比于原来或对照程度降低10％。

具体实施方式

根据图1到18，具体实施例包括用于所公开的组合物和方法中的pkm2拮抗剂。某些实施例包括在结构域a(α-螺旋6'到α-螺旋6和α-螺旋7')、结构域b：(β-折叠1和β-折叠5)和/或结构域c(α-螺旋5到β-折叠4)处特异性结合pkm2的pkm2拮抗剂，(共同并且单独地被称作“pkm2结合位点”并且抑制pkm2结合受试者的整合素αvβ3的能力。这些结构特征或结构域很好地表征并且可例如在mattevi,a.等人《结构(structure)》3,729-741(1995)中发现。

抗体/pkm2拮抗剂

在一个具体实施例中，pkm2或pkm2结合位点拮抗剂为抗体。可用于所公开的组合物和方法的抗体包括任何类别的全部免疫球蛋白(即，完整抗体)、其片段和至少含有结合抗体的可变结构域的抗原的合成蛋白。可变结构域在抗体之间的序列不同并且用于对于其特定抗原的每种特定抗体的结合和特异性。然而，变化可能通过抗体的可变结构域而不平均分布并且可集中在均在轻链和重链可变结构域中的被称作互补决定区(cdr)或高变区的三个链段中。可变结构域的更高保守性的部分称为构架(fr)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个fr区，所述fr区大部分采用β-折叠构形，通过三个cdr连接，其形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。在每条链中的cdr通过fr区极为接近地保持在一起，并与来自其它链的cdr一起促进抗体的抗原结合位点的形成。因此，所公开的抗体至少含有结合pkm2和抑制pkm2和整合素αvβ3的结合/相互作用所必需的cdr。

用于产生单克隆抗体(包括完全人类单克隆抗体)的方法为本领域中已知的。任何这类已知方法可用于本申请的上下文中以制备与pkm2或pkm2结合位点特异性结合的人类抗体。使用用于产生单克隆抗体、对pkm2或pkm2结合位点高亲和力嵌合抗体的已知方法初始地分离具有人类可变区和小鼠恒定区。如在下文实验章节中，表征并且选择抗体用于期望特征，包括亲和力、选择性、表位等。小鼠恒定区被期望的人类恒定区替换以产生本发明的全人类抗体，例如野生型或修饰的igg1或igg4。虽然选择的恒定区可根据具体用途而变化，但是高亲和力抗原结合和靶特异性特征存在于可变区中。

为了筛检与特定表位结合的抗体(例如阻断与到高亲和力受体的ige结合的那些)，可执行常规交叉阻断检验如在harlow和lane(1990)同前文献中描述。其它方法包括丙胺酸扫描突变、肽印迹(reineke(2004)《分子生物方法(methodsmolbiol)》248:443-63(具体地以全文引用的方式并入本文中)，或肽断裂分析。此外，可以采用如抗原的表位切除、表位提取和化学修饰的方法(tomer(2000)《蛋白质科学(proteinscience》9:487-496)(具体地以全文引用的方式并入本文中)。

在一些实施例中，pkm2拮抗剂为包括重链可变区和轻链可变区的抗体。在一些实施例中，抗体在结构域a(α-螺旋6'到α-螺旋6和α-螺旋7')处与pkm2特异性结合。在一些实施例中，抗体与结构域b：(β-折叠1和β-折叠5)结合。在一些实施例中，抗体与结构域c(α-螺旋5到β-折叠4)结合。在一些实施例中，抗体特异性地识别实例序列元素和涉及与整合素avb3相互作用的pkm2的其它序列。具体序列的非限制性实例包括结构域aa-螺旋6、argdlgieipaekvflaqkmmigrcnr和a-螺旋7'qmlesmikkp、结构域bβ-折叠1evelkkgat和β-折叠5islqvkqkga，和结构域ca-螺旋5dvdlrvnfamnvgka和β-折叠4kkgdvvivltgwr。

在一个具体实施例中，pkm2拮抗剂能够结合pkm2的以下序列：结构域a螺旋6(argdlgieipaekvflaqkmmigrcnr)和α-螺旋7'(qmlesmikkp)、结构域bβ-折叠1(evelkkgat)和β-折叠5(islqvkqkga)结构域cα-螺旋5(dvdlrvnfamnvgka)和β-折叠4(kkgdvvivltgwr)。

在一些实施例中，本发明所公开的主题涉及包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中所述抗体与选自由结构域a、结构域b和结构域c组成的群组的至少一个pkm2结构域特异性结合。

此外公开的为具有生物活性的抗体的片段。片段(无论是否附着到其它序列)包括特定区或具体氨基酸残基的插入、删除、替代或其它选择的修饰，其条件是片段的活性相较于未修饰的抗体或抗体片段不显著改变或减弱。

技术还可适合于生产对pkm2具有特异性的单链抗体。单链抗体可通过使用短肽连接子使重链和轻链的可变结构域稠合在一起，由此重组在单个分子上的抗原结合位点而产生。已经开发其中一个可变结构域的c末端经由15个到25个氨基酸肽或连接子系栓到其它可变结构域的n末端而不显著破坏抗原结合或结合的特异性的单链抗体可变片段(scfv)。选择连接子以准许重链和轻链在其恰当构形取向上结合在一起。

二价单链可变片段(di-scfv)可通过连接两个scfv工程化。这可通过生产具有两个vh和两个vl区的单肽链，产生串联scfv来进行。scfv还可被设计具有对于两个可变区太短而不能折叠在一起(约五个氨基酸)的连接子肽，迫使scfv二聚。双链抗体已经示出具有低于相对应的scfv高达40倍的解离常数，意指其具有对于其靶高得多的亲和力。另外较短连接子(一个或两个氨基酸)导致形成三聚体(三链抗体或三倍体)。也已生成四链抗体。其呈现比双链抗体甚至更高的对于其靶的亲和力。

任选地，抗体在其它物种中产生并且为了在人类中投予而“人类化”。抗体可人类化，而保持对抗原的高亲和力和其它有利生物特性。为了达到此目的，人类化抗体可通过使用亲本和人类化序列的三维模型分析亲本序列和多种概念人类化产品的方法制备。说明和展示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构形结构的计算机程序是可用的。检查这些显示器允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的潜在作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以此方式，可选择fr残基并且将其与共有和导入序列组合使得实现期望的抗体特征，如对于(一种或多种)靶抗原提高的亲和力。一般来说，cdr残基直接并且最基本上涉及影响抗原结合。

抗体的靶向功能可通过使抗体或其片段与治疗剂偶合在治疗上使用。抗体或片段(例如免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分)与治疗剂的这类偶合可通过制备免疫结合物或通过制备包含抗体或抗体片段和治疗剂的融合蛋白质实现。

肽

在一些实施例中，pkm2拮抗剂为肽。特异性结合pkm2、pkm2结合位点或整合素αvβ3的肽可使用常规方法，如噬菌体呈现和酵母双杂交检验来识别。

所公开的肽一般含有至少一个选择性结合pkm2的链段。所公开的结合肽可具有如本文所描述的多种长度和结构。一般来说，长度可以在肽到多肽长度的范围内，并且涵盖如本文所描述的所有这类长度。仅为方便起见，所公开的肽和多肽一般在本文中被称作“多肽”，但是除非上下文另外明确指示，否则希望使用此术语涵盖可被视为肽的这类组合物。

在一些实施例中，结合肽为整合素αvβ3的非活性片段，例如含有对于pkm2但不是整合素αvβ3的活化所需要的其它结构域的(一个或多个)结合/相互作用位点。

医药配制物

本发明公开在药学上可接受的载剂中含有治疗有效量的一种或多种所公开的pkm2或pkm2结合位点拮抗剂的医药组合物。适合于投予所公开的pkm2或pkm2结合位点拮抗剂的医药载剂包括适合于特定模式的投予的本领域的技术人员已知的任何这类载剂。在一个实施例中，医药组合物包含特异性结合丙酮酸激酶异构体m2(pkm2)并且抑制pkm2与整合素αvβ3结合的分子，和药学上可接受的载剂。分子试剂可包括中和抗体、人类化抗体和单克隆抗体。单克隆抗体可具有重链可变区和轻链可变区，并且其中所述抗体与选自由结构域a、结构域b和结构域c组成的群组的至少一个pkm2结构域特异性结合。

此外，化合物可调配作为在组合物中唯一药学上活性成分或可与其它活性成分组合。举例来说，化合物可与已知nsaid、抗炎化合物、类固醇和/或抗生素调配或组合。

pkm2拮抗剂可调配成合适的药物制剂，如溶液、悬浮液、片剂、可分散片剂、丸、胶囊、粉末或持续释放配制物。

在一个具体实施例中，调配组合物用于单剂量投予。为了调配组合物，将化合物的重量份以有效浓度溶解、悬浮、分散或以其它方式混合在所选择的载剂中，所述有效浓度使得所治疗的病状得以解除或使一种或多种症状得以改善。

活性化合物以在对治疗的患者不存在不希望的副作用的情况下足以发挥治疗有效作用的量包括在药学上可接受的载剂中。可通过在活体外、离体和活体内体系中测试化合物凭经验确定治疗有效浓度，随后从此外推用于人类的剂量。

活性化合物在医药组合物中的浓度将取决于活性化合物的吸收、失活和排泄率，化合物的物理化学特征，剂量日程安排和投予量，以及本领域的技术人员已知的其它因素。

可由本领域中的技术人员确定用于在所公开的方法中使用的治疗抗体的投予的剂量和日程安排。举例来说，抗体的剂量可以在约0.1mg/kg到约50mg/kg，通常约1mg/kg到约25mg/kg的范围内。在特定实施例中，4抗体剂量为1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg或25mg/kg。用于投予抗体的剂量日程安排可根据如由医生确定的治疗的期望积极性而变化。

例示性治疗方案需要每两周投予一次或每个月一次或每3到6个月一次。抗体通常在多个时刻投予。单剂量之间的时间间隔可以按周、月或年算。可替代地，抗体可以持续释放调配物形式投予，在此情况下，需要较不频繁的投予。剂量和频率根据抗体在患者中的半衰期而变化。一般来说，人类抗体示出最长半衰期，后面是人类化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。投予的剂量和频率可根据治疗是预防性或治疗性而变化。在预防性应用中，在长时间段内，以相对不频繁的时间间隔投予相对低的剂量。一些患者在其余生继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对短的时间间隔投与相对高的剂量直到疾病进展减慢或终止，并且直到患者示出疾病症状的部分或完全改善。此后，可以向专利投予预防性方案。

方法

本发明公开用于抑制或预防与受试者的异常整合素αvβ3相关联的疾病的方法，其涉及向受试者投予在药学上可接受的受体中含有有效量的pkm2拮抗剂的组合物。在具体实施例中，pkm2拮抗剂特异性结合pkm2并且抑制受试者的pkm2与整合素αvβ3的结合/相互作用。在这些实施例中的一些中，组合物含有有效量的pkm2拮抗剂以抑制pkm2与整合素αvβ3的结合/相互作用至少10％到100％，包括约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

一个具体实施例包括用于治疗与受试者的异常整合素αvβ3表达相关联的疾病的方法，包含向受试者投予有效量的包含丙酮酸激酶异构体m2(pkm2)拮抗剂的组合物，其中pkm2拮抗剂抑制pkm2与整合素αvβ3的结合。pkm2拮抗剂可为选择性结合pkm2的抗体。pkm2拮抗剂可为单克隆抗体。单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，并且其中所述抗体与选自由结构域a、结构域b和结构域c组成的群组的至少一个pkm2结构域特异性结合。在一些实施例中，pkm2拮抗剂为选择性结合pkm2的肽或肽模拟物。

投予

所公开的含有pkm2结合分子的医药组合物可以多种方式投予以实现在受试者的循环中治疗有效量的pkm2结合分子。举例来说，所公开的组合物可静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、腔内或经皮投予。组合物可非经肠、经眼、经阴道、经直肠、经鼻内或通过吸入剂投予。

如果使用，那么非经肠投予组合物的一般特征在于注射。可注射剂可以常规形式以液体溶液或悬浮液形式、以适合于在注射之前形成溶液或液体中悬浮液的固体形式、或以乳液形式制备。修订的非经肠投予方法涉及使用缓慢释放或持续释放系统以维持恒定剂量。

所公开的组合物可预防性地向处于与异常整合素αvβ3相关联的疾病的风险的患者或受试者投予。因此，方法可进一步包含在投予所公开的组合物之前识别处于纤维化风险的受试者。

所需组合物的准确量随受试者不同而变化，取决于受试者的人种、年龄、体重和一般健康状况、待治疗的过敏病症的严重程度、使用的特定组合物，投予的模式等因此，不可能限定每种组合物的准确量。然而，本领域的普通技术人员可仅使用本文中的教示提供的常规实验来确定适当量。举例来说，用于投予组合物的有效剂量和日程安排可凭经验确定，并且进行这类确定在所属领域的技术范围内。用于投予组合物的剂量范围为足够大以产生其中影响症状病症的期望作用的那些。剂量应不大到引起不良副作用，如非所需交叉反应、过敏性反应等。一般来说，剂量将随着患者的年龄、健康状况、性别和疾病的程度、投予的途，或方案中是否包括其它药物而变化，并且可由本领域的技术人员确定。在任何反向指示的情况下，个别医师可调节剂量。剂量可变化，并且可以每天一次或多次投予剂量进行投予，持续一天或若干天。对指定类别的医药产品的适当剂量可以在文献中找到指导。单独使用的抗体的典型日剂量可根据上述因素在每天约1mg/kg体重到高达100mg/kg体重或更大的范围内。

剂量的频率将取决于分子的半衰期和其作用的持续时间。如果分子具有短半衰期(例如2到10小时)，那么它可需要给予每天一次或多次的剂量。可替代地，如果分子具有长半衰期(例如2到15天)，那么它可仅需要给予每天一次、每周一次或甚至每1或2个月一次的剂量。

已经描述本发明所公开的主题的多个实施例。尽管如此，应理解，在不脱离本发明所公开的主题的精神和范围的情况下可做出各种修改。因此，其它实施例在以下权利要求书的范围内。

实例

以下实例旨在示出本发明的某些实施例。它们为本发明的例示性的并且将不理解为其限制。因此，在实例中描述的组合物为本发明所公开的主题的实施的组合物的非限制性实例。

实例1：通过在伤口部位处浸润嗜中性白细胞释放的丙酮酸激酶m2有助于伤口愈合。

胞外pkm2促进肌成纤维细胞分化

进行实验以确定rpkm2是否可诱导培养的成纤维细胞的肌成纤维细胞分化。将rpkm2添加到hdfa细胞的培养基中。细胞的if染色展现胞外pkm2促进形成具有肌成纤维细胞的典型图案的α-sma的应力纤维束(图1b)。此外，将rpkm2添加到hdfa的培养液中提高胶原蛋白i分泌(图1c)。tgfetgfβ为刺激在伤口部位处形成肌成纤维细胞的主要可溶因子。紧接在皮肤伤口后，通过累积血小板分泌tgfetgfβ以有助于将纤维母细胞转化成肌成纤维细胞(gillitzerr等人《白细胞生物学杂志(jleukocbiol.)》200169(4):513-21；werners等人《生理学综述(physiolrev.)》200383(3):83570)。为了确定rpkm2是否将加强tgfetgfβ的影响以有助于肌成纤维细胞分化，将rpkm2添加到除了tgfetgfβ之外的hdfa的介质中。显而易见，rpkm2强化tgfe诱导肌成纤维细胞形成的影响(图1a)。为了排除rpkm2对肌成纤维细胞分化的影响是由于存在残基tgfe或tgfe受体的活化的可能性，使用中和tgfe的抗体和抑制tgfe受体活化的抑制剂。抗体和抑制剂均对dα-sma的上调的rpkm2的功能无影响(图1d)。此外，已知tgfetgfβ/tgfetgfβ受体经由活化smad途径而有助于肌成纤维细胞分化。因此进行实验以确定将rpkm2添加到hdfa细胞的培养液中是否导致smad的活化。免疫印迹表明smad不通过rpkm2激活(图1d)。结果表明胞外pkm2对肌成纤维细胞分化的影响独立于tgfe信号传导。

pkm2通过对整合素αvβ3起作用而促进肌成纤维细胞分化

提取物由rpkm2交联的细胞制备。交联蛋白通过his-标记下拉分离。pkm2的免疫印迹展现rpkm2交联蛋白。切出rpkm2交联蛋白带并且由胰蛋白酶消化，并且随后通过maldi-tof/tof分析。ms-分析示出rpkm2与整合素β3交联(图2)。通过rpkm2与在hdfa细胞提取物中的β3的共免疫沉淀证实pkm2与整合素的相互作用(图2)。已知整合素αv通常与β3配对。细胞附着检验用于验证pkm2和整合素αvβ3相互作用。hdfa细胞附着到具有rpkm2涂层的培养液板。附着被lm609完全阻断，抗体识别整合素αvβ3并且阻断整合素活化(图3)。此外，抗体lm609消除rpkm2对hdfa细胞迁移(图8b)和在细胞中的α-sma上调两者的影响。作为对照，抗体对tgfe在调节α-sma表达中的活性具有小得多的影响(图4)。lm609对rpkm2的活性的影响支持胞外pkm2经由细胞表面整合素αvβ3起作用的观点。整合素αvβ3信号传导在肌成纤维细胞分化和整合素αvβ3的真皮成纤维细胞表达高水平中起重要作用(gailitj,等人《实验细胞研究(expcellres.)》1997232(1):118-26；hinzb.《牙周病学(periodontol)》2000.201363(1):14-28)。推断，pkm2可经由整合素αvβ3信号传导的活化而有助于肌成纤维细胞分化。实际上，将rpkm2添加到hdfa细胞的培养液中导致强的fak活化(图5)。fak抑制剂消除pkm2在α-sma上调中的影响(图5)。

待解决的问题为胞外pkm2如何作对整合素αvβ3上调α-sma表达起作用。调节影响不经由smad途径调节。tgfβ可经由pi3k的活化通过smad独立途径促进肌成纤维细胞分化(wilkesmc,等人《癌症研究(cancerres.)》200565(22):10431-40)。另一方面，整合素信号传导的活化导致pi3k的活化(wegenerkl,等人《分子膜生物学(molmembrbiol.)》200825(5):376-87)。

实例2：针对pkm2的抗体和抗体的用途

抗体中断在pkm2和整合素αvβ3之间的相互作用。

pkm2与整合素αvβ3相互作用并且激活整合素信号传导(图11和12)。基于在rpkm2和重组整合素αvβ3之间的化学交联计算对接模型。如图13和14所示，pkm2通过由靠近fbp结合位点的(1)两个b-结构域和来自相同单体的a-结构域和c-结构域，和(2)二聚体-二聚体介面形成的整合素αvβ3表面而与整合素αvβ3相互作用。此外，图15示出了在具有/无rpkm2结合的情况下整合素αvβ3的电子显微图像。

用于分析中断pkm2和整合素αvβ3相互作用的抗体的有效的检验。

elisa分检验。将重组pkm2涂布在elisa板上。将重组整合素αvβ3连同测试抗体或igg(作为对照)添加到pkm2涂布的板中。板洗涤若干次。使用针对整合素αvβ3的抗体测量整合素αvβ3与pkm2的结合(图13)。

将重组整合素αvβ3涂布在elisa板上。将重组整合素αvβ3连同测试抗体或igg(作为对照)添加到整合素αvβ3涂布的板中。板洗涤若干次。使用针对整合素pkm2的抗体测量pkm2与整合素αvβ3的结合(图14)。

细胞附着检验。细胞培养板用重组pkm2涂布。将huvec或cos-7细胞连同igg的测试抗体(作为对照)～2到5μm添加到板中。在培育50分钟之后。统计附着到板的细胞(图18)。

实例3：胞外pkm2有助于肝纤维化进展

图16a和图16b示出pkm2有助于肝纤维化进展，并且用抗体治疗能够降低纤维化。图16a示出taa/乙醇肝纤维化诱导和后续rpkm2/rpkm1治疗的示意日程安排。图16a和16b示出肝纤维化由taa/乙醇引起，并且动物随后用指示的试剂治疗，如图16a所示。图16b示出了在治疗疗程期间体重改变，(c)在终点处动物的肝重量，(d)具有放大调用以示出表面特征的代表性肝图像。(e)来自用指示试剂治疗的小鼠的肝组织的天狼星红染色的代表性图像。调用为示出天狼星红染色特征的放大图像。(f)来自用指示试剂治疗的小鼠的肝组织切片的天狼星红染色的量化。根据10个小鼠的测量结果计算量化。对每个动物四个随机选择的组织切片和在每个切片中三个随机选择的视场进行量化。天狼星红染色的量表示为总面积的％。

在balb/c小鼠的情况下，肝纤维化通过在饮用水中腹膜内投予taa和10％乙醇引起。在第一剂量的taa投予之后15天，将重组细菌表达的pkm2(rpkm2)、pkm1(rpkm1)或缓冲液添加到纤维化诱导物中(图16a)。在实验结束时，处死动物。紧接着检测动物体重、肝重量和肝的外表面。显而易见，将rpkm2添加到taa-乙醇纤维化诱导物中显著降低小鼠体重并且提高肝尺寸和重量(图16a和图16b)。在添加rpkm2的动物群组的肝表面上的纤维化特征相较于没有添加rpkm2的那些和添加rpkm1的那些更明显。肝组织切片的天狼星红染色表明在经由rpkm2添加治疗的动物群组的肝中更多和更厚的胶原蛋白累积。在经由rpkm2添加治疗的动物的肝中致密胶原蛋白弯曲和交叉网络指示更强的肝硬化。

实例4-针对pkm2的抗体逆转肝纤维化

一对兔单克隆pkm2抗体用于破坏pkm2-整合素相互作用(16-2)-一个为活性而另一个不是。另一个(21-3)不是(图17a)。balb/c小鼠的肝纤维化通过用taa-乙醇治疗引起。在纤维化诱导结束时，来自两个杂交瘤系的纯化抗体以4mg/kg腹膜内投予10剂量。在治疗结束时，处死动物。检测动物体重、肝重量和肝的外表面。相较于igg和21-3治疗的群组的那些，抗体16-2治疗导致小鼠体重提高和肝尺寸和重量降低(图17b)。肝脏组织切片的天狼星红染色展现胶原蛋白含量和密度的显著降低，表明通过pkm2抗体治疗在纤维化肝中胶原蛋白累积的分解。

图17示出了pkm2抗体逆转肝纤维化(a)在存在缓冲液、pkm2抗体克隆16(iggpk16)、pkm2抗体克隆21(iggpk21)和lm609(avb3ab)的情况下lx-2细胞附着到rpkm2涂布的板。附着表示为每个视场附着到板的细胞的总数。对照为无rpkm2涂布的板。图17b肝纤维化由taa/乙醇引起并且动物随后用指示试剂治疗。图17b在治疗疗程期间体重改变，(c)在终点处动物的肝重量，(d)来自用指示试剂治疗的小鼠的肝组织的天狼星红染色的代表性图像。调用为示出天狼星红染色特征的放大图像。

实例5针对pkm2的抗体逆转博莱霉素引起肺纤维化

balb/c小鼠的肺纤维化通过博莱霉素治疗引起。在纤维化诱导(5周)结束时，来自杂交瘤系的纯化pkm2抗体以4mg/kg腹膜内投予10剂量。在治疗结束时，处死动物。收集并且描绘来自治疗的动物的肺(未示出)。显而易见，博莱霉素引起强的肺纤维化。在pkm2抗体治疗的群组的肺表面上的纤维化特征相较于igg、缓冲液和吡非尼酮治疗的群组显然更小。肺组织切片的天狼星红染色展现胶原蛋白含量和密度的显著降低(总面积的百分比)，表明在通过pkm2抗体治疗的纤维化肺中胶原蛋白累积的分解(图18)。

图18pkm2抗体逆转博莱霉素引起的肺纤维化

肺纤维化由博莱霉素引起并且动物随后用指示试剂治疗。来自用指示试剂治疗的小鼠的肺组织切片的天狼星红染色的量化。根据10个小鼠的测量结果计算量化。对每个动物四个随机选择的组织切片和在每个切片中三个随机选择的视场进行量化。天狼星红染色的量表示为总面积的％。正常为来自未引起纤维化并且还无后续治疗的小鼠的样本。在治疗之前为来自刚刚在纤维化诱导之后而无后续治疗处死的小鼠的样本。iggpk为针对pkm2的抗体。igg为纯化兔igg。吡非尼酮为fda审批通过用于肺纤维化治疗的药物。

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