用于控制性局部治疗剂递送的电穿孔系统的制作方法
本发明涉及一种用电穿孔将受控的治疗性分子递送至组织内靶细胞群的系统。该系统的应用例子是用电穿孔将dna、治疗性分子或其他试剂递送到细胞中，其中电极集成在插入组织内的阵列内，并且电穿孔的靶向细胞邻近电极而不是在电极之间。
背景技术：
电穿孔是分子生物学中使用的技术，其中将电场施加到细胞以增加细胞膜的通透性，从而将化学物质、药物或dna引入到细胞中。其基本原理是通过两个电极之间的高压脉冲产生的电场引起高强度电场内细胞质膜被瞬时电介质击穿，从而使dna或其他分子进入细胞。
传统的电穿孔利用在物理上分离的电极之间的电场，在电极之间的组织中引起直流通路。发明人之前在国际专利申请号wo2011/006204和wo2014/201511中描述的电穿孔技术，通过利用相对于驱动电极阵列的不对称电场进行电穿孔，使得电极阵列的元件之间的局部电流通路在阵列附近产生从正到负电位变化的电场，并且在阵列附近对细胞进行瞬时电穿孔。
发明人及其团队在论文“pinyonjl,tadrossf,froudke,wongacy,tompsonit,crawforden,kom,morrisr,klugmannm,housleygd(2014)使用人工耳蜗植入电极阵列的闭场电极基因递送对仿生耳的增强(close-fieldelectroporationgenedeliveryusingthecochlearimplantelectrodearrayenhancesthebionicear.)sciencetranslationalmedicine6,233ra54.doi.10.1126/scitranslmed.3008177.(出版23/04/14)中描述了这种电穿孔技术，在这篇论文中，术语“闭场电穿孔”被创造为该技术的标签。在国际专利申请公开号wo2014/201511中也详细描述了该技术，其出版内容通过引用整体并入本文。在这项工作的过程中，发明人发现，与使用开场电穿孔相比，利用与电极阵列相邻的电场实现阵列附近的细胞转染，转染相同数目的细胞所需的累积电荷更低，其中靶细胞或组织被处于电极之间的直流电路中。此外，有人发现细胞电穿孔效率随着电场内电极位置的变化而变化。
技术实现要素：
根据第一方面，提供了一种电穿孔系统，包括：一个插入生物组织中用于电穿孔处理的电穿孔探针，其包含至少两个毗连电极；和一个脉冲发生器，所述脉冲发生器与电穿孔探针电性连接，并通过一个或多个电脉冲序列驱动电穿孔探针，以通过探针进行电流传输并在靠近探针电极的生物组织中引发不均匀电场。
在一个实施例中，非均匀电场包括在50μv/μm至1500μv/μm范围内的电场梯度。
在一个实施例中，电极沿着邻接方向相对延长，其中电极周长小于电极长度。所述探针的一种实施方式包括至少一对毗连电极，每个电极的长度小于或等于1mm。探针的一种实施方式包括线性电极阵列。所述探针的另一种实施方式包括电极的二维或三维阵列。
所述电穿孔系统的一个实施例还包括一个控制器，该控制器设为可选择性地控制脉冲发生器以控制通过探针传送的脉冲序列。在一个实施例中，所述控制器还被设为可选择所要驱动的电极。所述控制器的实施例可以被设置成对阵列周围组织的特性进行测定。
在一个实施例中，所述控制器设为根据载体溶液特性来控制脉冲序列的电脉冲参数。所述控制器可以被设为根据所引发的非均匀电场中的目标电势梯度来计算电脉冲参数。在一个实施例中，电脉冲参数被控制用于电流调节脉冲的传送。在该实施例中，根据蔗糖类型和浓度来确定所用蔗糖基载体溶液的电流幅度。在另一个实施例中，控制电脉冲参数用于电压调节脉冲传送。在本实施例中，根据蔗糖类型和浓度确定所用蔗糖基载体溶液的电压幅度。
在一个实施例中，所述探针含有电记录能力以协助基因电转移的放置和定时，例如电阻测量和电生理学测量。
在一个实施例中，所述控制器被设为用插入在处理环境中的探针测定处理环境的操作特性。所述控制器可以被进一步设为根据所测定的操作特性来预测脉冲传送期间的感应场电压。控制器可以被配置为根据所测定的操作特性来确定用于脉冲传送的电脉冲参数。在一个实施例中，控制器被配置成根据测定的操作特性来触发电脉冲传送。
电穿孔探针的实施例还包括至少一种治疗剂递送结构。在一些探针实施例中，治疗剂递送结构包括流体递送结构。例如，所述流体递送结构可以包括选自下组的任何一个或多个：集成流体腔室、微流体通路或套管。
在一些可选实施例中，所述治疗剂递送结构包括携带递送治疗剂的材料。例如，所述治疗剂可以是选自下组的任何一种或多种：嵌入在材料内，涂覆在材料上或封装在材料内。在一些实施例中，所述材料允许治疗剂不受控制地释放到生物组织中。
在一些实施例中，所述系统还包括治疗递送控制器，其被配置成对治疗剂向生物组织的递送进行控制。在一个实施例中，治疗递送控制器被配置为根据电脉冲序列来控制治疗剂的递送。
一种电穿孔探针，包括至少两个毗连的电极，该电极被配置为暂时插入到生物组织中用于电穿孔处理并且可以连接到脉冲发生器，电极被配置为当使用一个或多个电脉冲序列进行驱动时，在靠近探针电极的生物组织中引发出不均匀电场，所述电脉冲序列可通过探针进行电流传送。
在一个实施例中，每个电极的长度为1mm或更短，并且电极周长小于电极长度。
所述探针的一个实施例包括两条平行的绝缘电线，每条电线相邻的非绝缘区域至少有一对毗连电极。在一个实施例中，所述探针包括用于治疗剂递送的套管，并且所述电线设于套管内。所述套管可以在电极区域打孔，以在电极区域中递送治疗剂。
根据另一个方面，提供了一种电穿孔系统控制器，包括系统处理器和存储器，所述控制器被配置为确定一个或多个电脉冲序列以及电脉冲序列的电脉冲参数，从而在施加到电穿孔探针时，在探针电极附近的生物组织中引发出非均匀电场，以进行电穿孔处理。
根据载体溶液特性可以确定脉冲序列的电脉冲参数。所述控制器可以被配置为根据所引发的非均匀电场的目标电势梯度来计算电脉冲参数。
可确定电脉冲参数用于电流调节性脉冲传送。在这种情况下，根据蔗糖类型和浓度来确定蔗糖基载体溶液的电流幅度。或者，电脉冲参数可被用于电压调节性脉冲传送。在这种情况下，可以根据蔗糖类型和浓度来确定蔗糖基载体溶液的电压幅度。
所述控制器还可以被配置为利用插入到处理环境中的探针测定处理环境的操作特性。在该实施例中，所述控制器被配置为根据所测定的操作特性来预测脉冲传送期间的感应场电压。所述控制器可以被配置为根据所测定的操作特性来确定用于脉冲传送的电脉冲参数。所述控制器还可以被配置为根据所测定的操作特性来触发电脉冲输送。
在一个实施例中，所述控制器进一步被配置为根据电穿孔探针配置、目靶处理区域和载体溶液对一个或多个脉冲序列和电脉冲参数的电穿孔处理结果进行建模。
附图说明
现在，仅利用附图作为参考，采用实施例来描述包含本发明所有方面的实施方式，在附图中：
图1是根据本发明实施例的电穿孔系统的示例性框图。
图2示出了根据本发明实施例的原型探针。
图3示出了使用串联阵列配置记录的场电位脉冲和迹线。
图4a-4c示出了使用串联阵列配置的映射电场和细胞转化结果。
图5a-5c示出了使用交替阵列配置的映射电场和细胞转化结果。
图6a-6b示出了使用1+2阵列配置的映射电场和细胞转化结果。
图7a-7b示出了使用1+5阵列配置的映射电场和细胞转化结果。
图8a-8b示出了使用1+8阵列配置的映射电场和细胞转化结果。
图9示出核定位gfp荧光的统计学比较，其表明对于每个阵列构型，细胞在阵列附近转化。
图10示出了图9的细胞转化的比较。
图11示出了使用串联阵列配置的脉冲持续时间和转化细胞数量之间的关系。
图12示出了串联阵列配置的脉冲持续时间和脉冲数量的比较结果。
图13示出了串联电极配置电穿孔时电压幅度对细胞转化的影响。
图14示出了串联电极配置电穿孔时脉冲数对转导效率的影响。
图15示出了系统实施例的框图。
图16示出了二维阵列和模拟电场的一个例子。
图17a-c示出了原型探针的细节。
图18示出使用图17a-c的原型探针实现电穿孔基因递送。
图19示出使用串联配置的线性电极阵列实现豚鼠cns中的电穿孔基因递送。
图20示出了用2d电极阵列进行电场聚焦的电流引导准单极控制的示意图。
图21示出了取决于阵列内电极配置的电流导引示例。
图22示出了滴定电场聚焦的激发策略示例，包括阵列内毗连电极的单极返回电流。
图23示出了对于100ms持续时间的一定范围的恒定电流脉冲、载体溶液组成对于施加到电极阵列的电压(vapp1)的影响。
图24示出了在恒定电流脉冲期间测量的用于选择载体溶液的感应场结果曲线图。
图25是在基于蔗糖和nacl基载体溶液中施加到阵列上的电压(vapp1)产生的在场(vf)中与仿生阵列的阳极2相邻的电势图。
图26示出使用恒定电流脉冲对转导的hek293细胞面积的盐水和蔗糖载体溶液的比较。
图27是显示hek293细胞gfp表达的荧光图像的一组照片a-d。
图28是显示转染细胞面积的箱形图(数据界限为25％和75％，95％可信区间；个体数据覆盖；虚线表示平均值，中位数以实线表示)。
图29是使用盐水载体的35v100ms脉冲的电转移结果照片。
图30是使用10％蔗糖载体溶液的35v100ms脉冲的电转移结果照片。
图31是在串联配置的阵列上使用恒定电流匹配以传送35v施加电压的盐水(0.9％nacl)载体溶液与10％蔗糖载体溶液在转导hek293细胞面积上的比较图。
图32示出了在串联阵列上获得的电压施加图，其用于改变具有和不具有鲑鱼精子dna(2μg/μl)的蔗糖相对于盐水载体的电流脉冲输入。
图33示出了由不同的串联阵列施加的电压产生的场电压，其在阳极2侧面0.5mm处测得。
图34示出沿着阵列，在规则间隔处测定的电场采样(vf)的配置图像。
图35示出了沿着距离表面0.5mm的阵列测定的电场采样电压(vf)的光栅扫描。
图36示出在10％蔗糖载体溶液(无dna)中施加40伏(am系统2200恒压刺激器)的串联配置电极阵列的右侧(半球)的2d电场图。
图37示出了质粒gfp报告基因构建体的基因电转移后7天，豚鼠背部脑干(孤束核区)中的gfp阳性神经元。
图38是使用3×2ma×100ms脉冲(vapp1＝20v)进行基因电转移4天后，用蔗糖载体(gfp标记的内层鼓阶间充质细胞)的耳蜗基因递送的体内图像。
图39是在使用3×1ma×100ms脉冲(vapp1＝12v)通过恒定电流电源(digitimerds5刺激器)进行基因电转移后4天，用蔗糖载体(gfp标记的内层鼓阶间充质细胞)的耳蜗基因递送的体内图像。
图40显示通过具有可切换阵列配置的基因递送平台在体外hek293细胞单层中使用恒定电流脉冲和蔗糖基载体溶液实现的分布式基因电转移。
具体实施方式
本发明的实施方式提供了用于急性使用的电穿孔系统。如图1所示，本发明的一个实施方案提供了一种电穿孔系统100，其包括具有至少两个毗连电极的电穿孔探针110，该电极被配置为暂时插入生物组织中用于电穿孔处理，以及脉冲发生器120，其与所述探针电性连接，并被设为使用一个或多个电脉冲序列来驱动所述电穿孔探针，以通过探针引起电流传输，并在靠近探针电极的生物组织中引发不均匀电场。
在发明人的相关工作中，他们先前描述了用于递送dna和其他分子的细胞的“闭场电穿孔”(cfe)(pinyon等，sciencetranslationalmedicine，2014年4月)。cfe可以通过在物理上相连的电极之间的局部电流传输来实现，使得电场从阵列辐射出来并将细胞暴露于电场，而不是在靶细胞放置在电极之间并由此在直流通路内的电极之间传递电流。后者可以被描述为“开场电穿孔”(open-fieldelectroporation)。在pinyon等人的研究中，将电极阵列体现为人工耳蜗植入仿生假体，用于将dna递送至耳蜗。这是在体外进行的-将dna注射到耳蜗的鼓阶流体空间中，然后将耳蜗植入物插入到该空间中，并将少量电脉冲应用于所述阵列，将基于电穿孔的基因递送至阵列附近的间充质细胞。然后移除耳蜗植入物，并将组织放置在组织培养中几天。然后基于由裸露(质粒)dna基因盒驱动的绿色荧光蛋白(gfp)报告基因表达对转导的细胞进行成像。然后使用相同的方法在体内进行cfe基因递送-用于基因递送的阵列为急性插入-然后慢慢植入阵列-其中在植入时进行基因递送，然后将阵列留在耳蜗中，以用于听觉神经的常规电刺激。
在这项工作的过程中，本发明人发现，相比使用开场电穿孔，采用闭场电穿孔实现阵列附近的细胞转染，达到相同数目的细胞转染所需的累积电荷更低。此外，本发明人发现细胞电穿孔的效率随着电场内电极位置的变化而变化。除了这些发现之外，与电场均匀的区域相比，本发明人已经在电场不均匀性的区域中鉴定出转染有所改进。本发明人还发现，治疗剂载体溶液的特性也会影响细胞电穿孔的效率。利用这些发现，本发明人已经开发了用于控制电穿孔电场特性的技术，从而能够在目标组织区域中获得可预测的细胞转染结果。发明人开发的系统和方法利用的变量包括选自下组一种或多种：阵列配置、刺激脉冲图案特征和载体溶液特征，用于控制电穿孔处理过程中的电场特性。
电穿孔的电场控制
本发明的电穿孔技术针对与电极阵列相邻的细胞，其中电场通过电流源(正极)和电流回路(负极)的组合而在阵列周围形成电场。图4a，图5a，图6a，图7a和图8a示出了对于八电极阵列由不同的正极和负极配置导致的映射电场电势的示例，而图4b，4c，5b，5c，6b，7b和8b显示了对于每个阵列构型，电穿孔后细胞转化的所得分布。阵列中的8个电极按以下组合配置为正极和负极：
串联-四个并列的负极，四个并列的正极，所有元件的间距为300μm，总长度为5mm(如图4a-c所示)；
交流-交流负极和正极，间距在300μm内，总长度5mm(如图5a-c所示)；
1+2-在300μm间距内的单个正极和单个负极(如图6a-b所示)；
1+5-具有2.45mm间隔的单个正极和单个负极(如图7a-b所示)；
1+8-具有4.55mm间隔的单个正极和单个负极(如图8a-b所示)。
图4b，5b，6b，7b和8b显示了阵列配置对电穿孔介导的基因递送的影响，所有阵列配置使用脉冲序列驱动，所述脉冲序列具有的参数配置：40v，10个脉冲，50ms持续时间和1脉冲/秒。
虽然所有的阵列配置均引起了显著的细胞转导，但是基于正极、负极之间的空间以及正极和负极的数量和图案不同的阵列配置，对转换效率有显著的影响。1+2阵列驱动配置产生了直径约1mm、活性电极在中心的球形细胞区域(图6b)。如图5b和5c所示，交替阵列驱动配置对转染细胞的场产生线性偏差，从而延长了阵列长度(
为了比较，图4a，图5a，图6a，图7a和图8a示出了针对每个阵列配置映射的电场，在施加到阵列的100ms4v脉冲300结束时测量场电位，如图3所示。图3还示出了使用串联阵列配置以0.5v级到4v(100ms持续时间)记录的场电位的迹线310。与“交流”配置中设有相同数量的电极相比，“串联”配置显著提高了转导效率。这项研究还表明，较小的双极电极配置效率较低(1+2,1+5,1+8)。“串联”阵列配置显示细胞转导的意外效率归因于电场聚焦的几何形状(图4a)。串联阵列400表现出最高的电场轮廓密度，从正极和负极410之间的接合处开始无位置追踪(图4a)。相反，尽管利用了相等数量的电极，交替阵列配置500具有较低的电场密度梯度，沿着阵列分布，在阵列510的末端具有峰值(图5a)。给定以“串联”阵列的零点为中心的球形gfp阳性细胞区域(图4b和4c；正交于图4a中电极4和5之间的点410)，数据表明穿过细胞的是电场(电压梯度)而不是绝对阶跃电势变化驱动了电穿孔和dna的摄取。其他阵列配置的细胞分布显示出与所测定电场类似的关联，1+2>1+5>1+8中gfp阳性细胞数量的下降与电场相对于电极的扩大相关。
阵列周围的电场与转化细胞的空间映射密切相关。因此，细胞转导取决于细胞上的电位梯度，而不是绝对电压。使用0.9％盐水溶液、串联配置的等高线图最明显，其中电场的空区域向电极4和5之间的阵列正交迁移(图4a)。电场曲线在这条线上最陡，并保持球形形状，其与转导的细胞图相对应。电位测量的量级在串联阵列的任一端是最大的，但是更均匀。当分离双极电极的距离增加时，电场密度下降，如通过分别比较图6b，7b和8b中的1+2,1+5和1+8阵列的结果所示。
对每个阵列配置的比较结果也进行了统计分析。图9显示了核定位gfp荧光的统计学比较，这表明，从不同电极阵列配置的转导场实例中，每个阵列配置均通过电穿孔对细胞进行了转化。箱形图显示中值(线)，平均值(虚线)，25％和75％的边界覆盖了＝细胞转化的数据(每组n＝4)。图10显示了图9细胞转化的比较。与对照组相比，所有阵列驱动配置产生明显的细胞转化，具有从1+8配置转化的数量最低。
图11显示使用串联阵列驱动配置(40v，5个脉冲，培养48小时)的脉冲持续时间和转化细胞数目之间的关系。图12显示了串联阵列配置的脉冲持续时间和脉冲数量的比较结果。对于1个脉冲，除了0.1ms之外的所有脉冲持续时间实验均产生了显着的电穿孔介导的细胞转化(p<0.004；秩次方差分析(rankedanova)；1个脉冲用holm-sidak多重比较检验；5个脉冲用237mann-whitney秩和检验，0.1ms；p＝0.026；每组n＝6)。细胞转导在100毫秒脉冲持续时间下是最大的。五个脉冲产生的转导显著大于一个脉冲所产生的(双因素秩次方差分析，10ms-400ms在脉冲数和脉冲持续时间之间表现出显著的相互作用；p<0.001)。对于单次脉冲，40ms(38.3±5.1个细胞)、100ms(51.7±7.8个细胞；n＝6)和400ms(49.2±6.9个细胞；n＝6)之间没有差异(p>0.05；holm-sidak多重比较)，而在5次脉冲处理中，脉冲持续时间为40ms(147.2±12.4个细胞)和100ms(211.7±16.6个细胞)所产生的细胞转化显著大于其他持续时间(p＝0.003；p<0.001)。脉冲持续时间为400毫秒的5个脉冲导致从最大值下降了5.5倍(38.3±10.2个细胞；每组n＝6)(p<0.001；双因素秩次方差分析，holm-sidak多重比较)。据信，这是由于电解毒性所引起(下面进一步讨论)。发明人的测试表明，对于2×40ms脉冲或5×40ms脉冲，脉冲间隔为50ms或1s对细胞转导水平没有影响。
这些结果表明，脉冲持续时间是细胞转导过程的关键决定因素，最佳值约为100ms。由于铂电极的感应电流容量，在电压阶跃增加的电场内直接测定的电位显示了从峰值开始的一些初始衰减(图3)。在电压>2v时，产生持续的电位/场，接近稳态约100ms。这与如下的概念是一致的，即跨越细胞的持续电压梯度对于有效的微域电穿孔是必需的。由发明人记录的电场(在图4a，图5a，图6a，图7a和图8a中示出)提供了所产生电场的相对代表值，因为在这些实验中用于电场测量的独立电压传感器不适合在与dna摄取(基因电转移)有关的施加电压下进行记录。然而，当电压高于2.5v时，电场内(靠近第二个正极)的电位测量值随着电压的增加而线性增加，在4v时，“串联”配置中紧邻阳极和阴极的远端处，最大持续电位将近
发明人还表明，随着脉冲幅度的增加，转化的细胞数量显着增加。图13显示了电压幅度对串联电极配置驱动的电穿孔细胞转化的影响。用10个脉冲，持续时间为40ms、脉冲速率1/s和变化电压来进行电穿孔。40v幅度产生的转化比10v幅度所产生的大40倍以上(196.7±18.5对10v的5.9±1.1和20v的32.3±6.3；每组n＝9)。在六个对照实验(gfp质粒，没有电穿孔)中未检测到转化的细胞。对40v组测定gfp阳性hek293细胞的电场周界用于估计其密度(29±2个细胞/mm2，n＝6)。使用dapi荧光建立hek293细胞的总体密度(5097±333个细胞/mm2)。因此转导效率大约为0.6％，这反映出朝向周界的降低。正如从图13中的结果所证明的，需要大约10v来实现细胞转染，转染细胞的数量随着电压增加而增加。
图14显示了串联电极配置下脉冲数对转导效率的影响。使用20v和40v脉冲以及40ms持续时间并改变脉冲数量来进行电穿孔。该图显示了每个实验的平均转染细胞数量。在40v时，所有脉冲数(1,3,5,10,20,40)所得的转导都显著高于对照(没有电穿孔)，秩次方差分析，与对照组的多重比较，(holm-sidak方法，1脉冲以上p<0.001；1个脉冲的p＝0.031，除了5个脉冲组(n＝9)外，每组n＝6)，用5、10和20个脉冲具有最大值(范围147-170个细胞)，这些处理之间没有显著性差异(anova，holm-sidak比较)。在20v时，3、5、10和20组的脉冲产生的转导显著高于对照(没有电穿孔)；秩次方差分析，与对照组多重比较(holm-sidak方法；p<0.003；每组n＝6)。对于10个脉冲，gfp阳性细胞的峰值数目平均为22个。对于20v和40v的40个脉冲，转染细胞数目都有下降。另外，本发明人观察到碘化丙啶荧光接近电极阵列位置，其作为细胞通透性和细胞毒性的标记。这一发现表明，细胞转化的衰减可能是由于电解和机械破坏与气体有关的细胞单层，这被电穿孔序列之后电极表面上细小的气泡所证明。在此基础上，没有更多的电荷传输。
本发明人已经在图9至14中示出了转染细胞的数量可以通过阵列配置、电压和脉冲参数来控制。本发明人的研究已经表明，当阵列被配置为阳极和阴极组合成双极(“串联”配置)时，实现有效的细胞转导所需的电荷传递最少。与“交流”配置中布线有相同数量的电极相比，“串联”配置达到的转导效率明显更高。这项研究还表明，较小的双极电极配置效率较低(1+2,1+5,1+8)。“串联”阵列配置显示，细胞转导出乎意料的效率归因于电场聚焦的几何形状。与其他配置相比，“串联”阵列显示出与电极相邻的最高电场。给定以“串联”阵列的零点为中心的球形gfp阳性细胞区域(正交于电极4和5之间的点)，这表明穿过细胞的是电场(电压梯度)，而不是绝对阶跃电势变化驱动了电穿孔和dna的摄取。配置电极阵列以产生可预测的电场，因此能够靶向组织内特定区域的细胞进行电穿孔处理。然后可以利用控制电穿孔刺激信号的电参数来影响靶向区域中转染细胞的数量。因此，本发明人开发了使电穿孔处理结果可预测控制(称为“拨号”(dialup)控制)的方法和系统，并且证实了其可以实现基因的电转移。
应该理解的是，对于活体患者的电穿孔治疗，可能需要限制所施加的电刺激参数(即电压和电流)以避免有害的副作用。此外，用于电刺激的所述“安全”参数可根据患者而变化，例如基于以下任意一种或多种：需治疗的组织类型、身体部位、患者年龄(例如，老年人或婴儿)、患者健康状况、对其他治疗的潜在干扰、手术设备或植入物(即起搏器)等。
由于效率低下，电穿孔对于治疗性基因递送仍然被认为是有问题的，将电极放入组织会造成创伤并且需要高电压进行dna摄取。这会被认为是有害的刺激，影响靶器官和组织，也可能影响dna的稳定性。单细胞水平的电穿孔方法研究揭示了转染效率相对于电场与电穿孔效率的不同关系。例如，使用悬浮的中国仓鼠卵巢(cho)细胞的研究表明200v/cm的场强足以用于电穿孔，但是基于报告基因的表达，转染却需要400v/cm。一项对骨骼肌摄取dna的研究显示了持续时间短(100μs)的“高电压梯度”(800v/cm)和持续时间(100ms)较长的“低电压梯度”(8v/cm)脉冲结合的好处，其分别穿透质膜并使dna电泳穿过。使用荧光标记dna的研究表明，尽管细胞在电场的两侧均被穿透，但(toto-1标记的)质粒dna仅进入负极那侧的细胞。细胞膜的穿透发生在电压脉冲的短时间范围内(通常在μs-ms范围内)，而细胞完整性的恢复则在数分钟内发生。这与发明人测试的碘化丙啶荧光成像一致，在电穿孔后30分钟进行的检测显示转导细胞的膜完整性得以恢复。脉冲幅度影响了细胞膜被穿透时的速度和电穿孔膜的面积；脉冲持续时间和脉冲数则影响了穿透的程度。穿透过程取决于导致细胞膜上电荷再分布的电场，其发生比细胞的电容时间常数更快。因此，细胞形状是非常重要的，哺乳动物细胞需要的电压比较小的细菌细胞更低。无论如何，所施加的电压需要使跨膜电位在
利用植入式仿生假体如耳蜗植入物和深部脑刺激器的临床措施本质上是通过“闭场”电穿孔整合入互补基因治疗而实现的。本发明人还设计了急性治疗探针、控制系统和方法来提供受控和/或定制的电穿孔治疗。这可能提供比目前通过其他方法如病毒载体或脂质转染提供更安全和更有针对性的基因强化。在一些实施方案中，基于电极阵列的基因递送可以通过现有的仿生神经假体改良。还设想可以开发定制电极阵列以扩大细胞转导区域形状和面积的控制。
控制电穿孔结果的关键参数是脉冲强度(电压)、脉冲持续时间、脉冲数、脉冲间隔、物理阵列配置、阵列中电极的极性、载体溶液的组分和dna浓度。控制这些参数能够控制电场，从而能够控制电穿孔结果的区域和密度，例如将基因递送到邻近电极的细胞目标区域(也称为“拨号”对照)。本发明的实施方案实际上应用这些参数来提供电穿孔系统，该电穿孔系统被配置为诱发用于电穿孔的受控非均匀电场，并且产生与电极阵列正交的电场梯度。控制电场几何形状使相对于阵列的特定区域内的细胞成为治疗目标。对电场形状的主要影响是阵列配置。控制电穿孔脉冲参数(例如强度，脉冲宽度，脉冲间隔和脉冲数量)控制了靶向区域中转染的细胞数量，其中载体溶液的组分和dna浓度也被发现对电场的几何形状有影响。
关于潜在的组织损伤，在发明人进行的研究中，最高的电荷输送导致hek293细胞单层由于析出气体而产生电解作用和明显的物理破坏。这是铂电极的法拉第限流的结果，其在盐水载体中被估计为约25mc/cm2下的最小有效电荷输送，铂电极可逆电荷输送的赝电容为～210μc/cm2。因此，即使对于惰性电极如铂，当使用了相对长的脉冲持续时间、高电压和长脉冲串时，对细胞的可能性电化学损伤也可能是一个因素，其随着水的还原，在阳极产生h+，和在阴极产生o2或cl2气体以及oh-，从而引起潜在的ph变化。组织(焦耳)加热也可能与电穿孔相关，二者均提高了细胞温度并可能使dna不稳定。基于仿生阵列的基因治疗应用转化需要在可能损坏电极阵列附近的电荷输送水平之下实现。如以上已经证明的，通过配置电穿孔阵列几何结构以在目标区域中产生电场梯度，可以实现使用比已知方法更低电荷输送以达到有效的电穿孔目的。阵列配置和输送脉冲模式的组合可以计算用于所需的治疗并且所提高的效率可以降低潜在的组织损伤风险。
发明人还表明，治疗剂载体溶液的特性以及dna的性质也可以影响产生的电场特性和电穿孔结果的效率。尤其是发明人已经表明，使用蔗糖载体溶液可以增加在阵列附近的电场几何形状的电阻和变化，因此与生理盐水溶液相比其电场强度更接近阵列。因此，当确定用于定制电穿孔治疗的控制参数时，载体溶液可以被视为变量的另一个参数。发明人已经确定，用含有dna的蔗糖载体溶液能使基因电转移的最小有效电荷降低103(～25μc/cm2，在这种情况下，在电极上的气体不可见)，这经使用100μs、15ma的脉冲的实施例所验证(图27)。
载体溶液的组成尤其会影响电场强度，所述电场强度通过调节电穿孔刺激脉冲向阵列电流输送而产生，由此影响了电穿孔和基因到细胞中的电转移。载体溶液的选择也可以影响电压调节条件下的电穿孔结果。
通常使用可控幅度的电压脉冲(恒压电源供应)进行细胞电穿孔和基因电转移。在本发明的实施方案中，使用蔗糖溶液作为dna的载体，以通过恒流源实现细胞间的闭场基因电转移。蔗糖溶液被发现能显著降低在电极阵列外部产生具有足够幅度和持续时间的电场(电压)所需的电流，从而实现细胞电穿孔效率的提高和受控基因递送的dna电转移。例如，相比于使用生理盐水溶液，使用浓度为10％(等渗)的蔗糖，电极阵列上的电阻大约增加了十倍。这使电压依赖性脉冲电穿孔所需的电流减少约三十倍。这在体外hek293细胞单层模型实例中和在耳蜗和脑部的体内模型中发现均对基因电转移有效。
以下参照图23至25讨论了在调节电流条件下载体溶液对电穿孔的影响，其显示了与常规盐水溶液对照相比，在恒定电流控制下用不同的蔗糖载体溶液测定局部场的结果。图23显示了在100ms持续时间、一定范围的恒定电流脉冲下，载体溶液组分对施加到电极阵列的电压(vapp1)的影响。在～95ms进行脉冲测定。耳蜗植入物阵列布线有四个联动的阳极和四个联动的阴极(串联配置)。
发明人用定制的隔离放大器(电极监测系统)来记录电极阵列处的电流和电压，并测量电极附近电场内相对于参考接地的电压。阵列和测量探头的电极都由铂构成。发明人使用了不同浓度的蔗糖或葡萄糖和盐水的溶液，包括它们的混合物。恒定电流使用digitimerds5独立恒流刺激器来传送。使用axoninstruments1440接口和clampex软件控制电流脉冲。电流脉冲在100μs到100ms的持续时间内变化，并且幅度变化到50ma。digitimerds5刺激器的电流和电压输出通过这个接口(5个通道，每个通道的采样率是100khz)记录，以及通过定制的电极监测系统对所施加的电流、电极阵列处的电压以及电场内一点处的电压进行独立测量。
用于这些测试的阵列是具有350μm宽铂环的cochlearltd8节点阵列(cochlearltd.部件号z60274)，其中顶部四个电极被组合在一起作为阳极，挨着的四个电极如上所述以“串联”配置组合在一起作为阴极。如图23所示，测试表明，对于给定的恒定电流脉冲，与普通生理盐水(0.9％nacl；296mosm)或盐水(0.45％)和蔗糖(5％)(310mosm)的混合物相比，蔗糖(5％，10％，15％)和葡萄糖(5.3％)溶液(用0.5mmnaoh缓冲；渗透压分别为154,326,520,315mosm，用微渗透压力计(fiske模型210)测量)会引起阵列电极处电压的大幅增加(vapplied)。
所有蔗糖基载体溶液在1ma电流的有效基因电转移(～10v)范围内产生电压是重要的。生理盐水基溶液需要>20毫安的电流来达到这个目的。根据三次的重复测量，单因素方差分析(anova)统计分析最初是通过用的1ma数据比较进行的，其中测量的vapplied最为匹配。载体溶液之间存在统计学显着差异(p<0.001)；holm-sidak配对比较(显着性α＝0.05)表明，所有的蔗糖载体产生比含盐溶液更高的施加电压，如表1所示。
表1:蔗糖载体溶液和生理盐水对仿生阵列vapplied的比较
在1毫安、100毫秒的电流脉冲期间的vapplied(以伏特为单位)；组间差异p<0.001，单因素方差分析以及holm-sidak配对比较。
如图23的图表所示，5-10％的蔗糖或葡萄糖的vapplied(平均值＝11.48v)在1ma水平下没有显著性差异。然而，2ma×100ms脉冲2320的vapplied的分析解释了图23中的显著性差异(平均值±标准误；5％蔗糖＝21.5±0.05v；5.3％葡萄糖＝22.9±0.52v；10％蔗糖＝23.4±0.42v；15％蔗糖＝27.2±0.03v；p<0.05)，只有10％的蔗糖和5.3％的葡萄糖没有差异(p＝0.336)。对于蔗糖的载体来说，随着增加的电流而增加的vapplied大致与欧姆相关,可以使用线性回归最佳拟合(r2>0.98)从相应的斜率计算电阻：0.9％盐水＝299ω；0.45％盐水+5％蔗糖＝480ω；5％蔗糖＝6.30kω；10％蔗糖＝7.16kω；15％蔗糖＝8.50kω；5.3％葡萄糖＝6.94kω。
从与耳蜗植入物阵列顶端阳极的第二个正交参考位置～500μm进行1ma×100ms脉冲的电场分析。这些数据表明，电极上随着蔗糖而增加的电压(vappl)导致了电场中电势的增大(vf)。图24的曲线图示出了在恒定电流脉冲期间测定的选择载体溶液感应电场的结果。在图24中，曲线2410是15％蔗糖载体溶液2415的测定结果，曲线2420是10％蔗糖载体溶液2425的测定结果，曲线2430是5.3％葡萄糖载体溶液2435的测定结果，曲线2440是5％蔗糖载体溶液2445的测定结果，曲线2450是5％蔗糖+0.45％nacl载体溶液2455的测定结果，曲线2460是0.9％nacl载体溶液2465的测定结果。这些结果显示在恒定电流脉冲期间，蔗糖溶液产生的阵列感应场电压比盐载体溶液产生的更大。用蔗糖载体溶液2415,2425,2435,2445测得的场电压(vf)2410,2420,2430,2440明显大于含有nacl的2455,2465溶液。在布线有四个联动阳极和四个联动阴极的耳蜗植入物阵列的第二阳极电极正交约500μm处测定电压。
表2示出了2.5ma电流脉冲的场电压比较(基于单因素方差分析)。
表2:蔗糖载体溶液和nacl载体溶液的场电压(vf)比较
在1毫安、100毫秒的电流脉冲期间的vf(以伏特为单位)；组间差异p<0.001，单因素方差分析以及holm-sidak配对比较
图25是在蔗糖和nacl基载体溶液中施加到阵列上的电压(vapp1)所产生的在仿生阵列阳极2附近电场测定的电势(vf)图。如图25所示，vappl对vf的曲线2510表明，在同样的施加电压下，蔗糖基载体的生长函数比含nacl的载体(生长函数)大了约三分之一。用15％蔗糖，vf增加0.179×vappl。(r2＝0.995线性回归最佳拟合)，而在0.9％nacl中，vf生长函数为0.119×vappl。(r2＝0.978)。
图25显示，根据同样施加电压下的电场采样的电压(vf)点的测定，蔗糖基载体溶液比含有nacl的载体溶液多产生大约33％的场强。短虚线2520是0.9％nacl载体数据的外推线性回归最佳拟合(vf＝-0.293+0.119xvappl)；长虚线2510的15％蔗糖载体的最佳拟合(vf＝-0.751+0.179×vappl)。用2.5ma，5ma，10ma，20ma的恒定电流脉冲(100ms)获得施加的电压。
这些数据表明，从施加到仿生阵列上的电压可以外推得出，与在盐水基载体溶液相比，蔗糖载体的闭场电势更高。这表明，使用蔗糖的载体溶液比使用盐溶液产生更低的电压和电流刺激信号即可诱导实现电穿孔结果所需的电场。此外，蔗糖的类型和浓度也会影响感应电压。
将恒定电流脉冲与恒定电压脉冲相比较用于闭场基因电转移以进行进一步测试。该研究的结果如图26至28所示。该研究使用仿生电极阵列和蔗糖载体与盐水溶液建立了用于基因电转移的电流脉冲参数，并将这些数据与使用恒定电压脉冲的基因电转移进行比较。使用串联配置布线有八音符人工耳蜗植入物阵列，采用裸gfp报告质粒dna(2μg/μl)在盖玻片上融合的hek293细胞中对基因电转移进行读数。
图26显示了恒定电流脉冲下用盐水和蔗糖载体溶液对转导的hek293细胞面积进行比较。值得注意的是，在0.9％的(生理)盐水中，3×5ma、100ms持续时间、900ms脉冲间隙脉冲产生的gfp阳性细胞平均面积为1.0±0.4mm2(平均±标准误，n＝3)。相同脉冲参数下用10％蔗糖作为载体溶液形成的平均面积为13.9±0.6mm2(p＝0.0000165，双尾t检验)，反映了相同电流幅度下的较高电场。
用三个短的(100μs)高振幅(盐水用50ma，10％蔗糖用15ma)的电穿孔脉冲来研究双脉冲模式的使用效果，间隔100μs，接着是电流幅度较低的三个100ms基因电转移脉冲(盐水用5ma、15ma和25ma；蔗糖载体用5ma和25ma)。图26表明，在蔗糖载体中，三个短电穿孔脉冲显着增加了转导细胞的面积，而盐水载体则没有。发明人认为这是因为蔗糖溶液中能达到的最大电穿孔电压较高。例如，在10％蔗糖载体中3×100ms×5ma脉冲的面积提高到了路上所述的13.9mm2，将它与3×100ms×5ma的32.5±9.9mm2(n＝2)作对比，然后比较3x100msx5ma。当使用10％蔗糖溶液载体(3×100μs×15ma，然后3×50ms×25ma(n＝3))实现了电穿孔细胞的最大面积88.1±9.9mm2，这与生理盐水的最大双脉冲法相比，得出面积结果为7.5±0.5mm2(3x100μsx50ma然后3x50msx25ma(n＝3)(n＝3)(p＝0.00002073).
短(100μs)电穿孔脉冲的影响与配对脉冲法分开进行测试。该测试的结果如图27和28所示，显示了在hek293细胞中对质粒基因电转移的100μs电穿孔脉冲的效果。随着电流脉冲幅度的增加，转染细胞的面积逐渐增加。三个恒定电流脉冲被100μs的脉冲间隔分开。10和15毫安的脉冲幅度引起的基因表达显着大于1ma脉冲(秩次方差分析以及邓恩事后配对比较(dunn'sposthocpairwisecomparisons)).图27a-d的照片显示了hek293细胞gfp表达的荧光图像。图28是转染细胞面积的箱线图(95％可信区间，25％和75％的数据边界；个体数据重叠；虚线表示平均值，实线表示中位数)。用10％蔗糖载体中的gfp报告质粒dna(2μg/μl)进行测试。将电脉冲施加到以串联配置布线有八个节点人工耳蜗植入物阵列。电流通过模拟控制器接口驱动的digitimerds5恒流刺激器传送。
在这种情况下，在1ma，5ma，10ma和15ma下仅使用以100μs间隔隔开的3×100μs脉冲。在10％蔗糖载体中，1ma脉冲无效(平均值＝0.0009±0.0003mm2；p＝0.0648-双尾单样本t检验，n＝3)；但是5-15ma脉冲产生了大得多大的gfp阳性hek293细胞的面积(图28)；范围为0.769±0.077mm2(5ma；p＝0.000172，双尾单样本t检验，n＝6)到12.329±1.927mm2(15ma；p＝0.00306，双尾单样本t检验，n＝5)。这些数据是值得注意的，与ms脉冲数据相比，100μs预脉冲达到恒定电流电源(50ma)的最大输出不影响盐水载体中的基因电转移效率(图26)。结果也是非常明显的，用3×100μs×15ma脉冲(～12.33±1.927mm2)获得的转染细胞面积与在5ma(13.87±0.325，n＝3)的3×100ms脉冲所获得的相当。(p＝0.570，双尾t检验表明这些条件之间没有显着差异)。在10％蔗糖载体中实现等同基因表达的脉冲序列电荷转移的差异是相当大的(对于3×100ms×5ma为1.5×10-3c，对于3×100μs×15ma为4.5×10-6c)，更高的电流水平使基因电转移所需的总体电荷显著降低。
最大电流幅度(50ma)能够在生理盐水中串联配置布线有八电极人工耳蜗阵列上施加约35v的电压，这个施加的电压是用含有10％蔗糖载体的10％电流获得的(见图31)。在这里我们比较了在生理盐水(含有tris缓冲液(n＝5)的0.9％nacl(n＝4)；3×100ms×50ma)和10％的蔗糖载体(3×100ms×5ma，n＝5)的电极上施加35v电压对恒定电流的影响。双尾t检验表明，尽管施加电压一致，但使用蔗糖载体的转导细胞面积明显增加(p＝0.0103)，表明蔗糖增强基因电转移的影响超过了溶液电阻率变化引起的电极电压的增加。电转移的比较结果如图29-31所示。图29和30的照片是使用恒定电流脉冲在盐水(0.9％nacl)和10％蔗糖中转导gfp阳性hek293细胞面积的例子，该恒定电流脉冲与在串联配置八电极人工耳蜗阵列上产生的35v电压相匹配。图29的照片是使用盐水载体、35v100ms脉冲的电转移结果，图30的照片是使用10％蔗糖载体溶液、35v100ms脉冲的电转移结果的照片。电流脉冲为3×100ms(图29的nacl载体用50ma，图30的蔗糖载体用5ma)。每个目的区域是4.85mm2并且电极阵列的位置被标记为2910,3010。注意图30中是用蔗糖载体转导的较大细胞面积。图31是用盐水(0.9％nacl)载体溶液和10％蔗糖载体溶液对hek293细胞转导面积的比较图，其采用了与在串联配置阵列上输送使用的35v施加电压相匹配的恒定电流。统计学比较采用了双尾t检验。
发明人还用蔗糖和盐水载体对有和没有dna的电场进行了比较测试。该测试使用人工耳蜗阵列(8电极，串联配置)，其成像于显微镜台，并且使用具有绝缘铂电极的隔离电压放大器将0.5mm垂直于电极位置2(从顶点起第二个阳极)的场电压(vf)进行采样，水浴中的铂电极为参照。根据施加于电极阵列的具有不同幅度的100ms电流脉冲对vf进行测定。测定电极上的电压(vappl)作为恒定电流电源(digitimerds5)的输出。对含有和不含鲑鱼精子dna的载体溶液的vappl和vf进行比较(赛默飞世尔-thermofisher；2μg/μl,平均2kb片段)。
该测试的结果表明，将dna加入蔗糖载体溶液降低了电阻率，而将dna加入盐水载体溶液增加了电阻。表3示出了电阻率的测量结果(基于施加电压的电流)，图32证实了电阻影响，即电流数据和施加电压(vappl)斜率之间的差异。
表3：蔗糖和盐水载体溶液的电阻率。
载体溶液全部经过了0.5mmnaohph调节。*表示使用napagenecu1直接测定；其他测定通过线性回归斜率最佳拟合(r2＝0.89-1.0)。通过digitimerds5刺激器将恒定电流脉冲(100ms)施加到串联阵列。
图32和33显示了生理盐水(0.9％)和10％蔗糖(均用0.5mmnaoh缓冲)中鲑鱼精子dna(2μg/μl)对vapp1和vf的影响。图32的图显示了在串联阵列上获得的施加电压，在含有和不含鲑鱼精子dna(2μg/μl)的蔗糖和盐水载体改变了电流脉冲输入。图33显示了由不同的串联阵列施加的电压产生的场电压，其在阳极2侧面0.5mm处测得。比较了有无鲑鱼精子dna(2μg/μl)的蔗糖和盐水载体。图33显示，用10％蔗糖载体，不考虑dna，vapplied产生了相似的vf(vf10％蔗糖+dna＝-0.237+(0.209*vappl-10％蔗糖+dna；r2＝0.993)；vf不含dna的10％蔗糖＝-0.214+(0.208*vappl10％蔗糖；r2＝0.997))。在含有0.9％盐水和dna的情况下，最佳拟合的斜率是0.147v/v(vf蔗糖+dna＝-0.336+(0.147*vapp盐水+dna；r2＝1.0)而不含有dna的斜率为0.0958v/v(vf没有dna的盐水＝-0.193+(0.0958*vappa不含dna；r2＝0.989)。
用蔗糖对沿阵列的电场进行光栅测量
使用5v恒定电压脉冲(100ms；amsystems2200刺激器)沿着串联阵列的长度测量10％蔗糖载体(无dna)溶液的vf((图34和35)。图34的图显示了沿着阵列以规则间隔测量的电场采样(vf)的配置。该图像是在沿着耳蜗植入物阵列长度的各个位置显示vf采样电极复合叠加显示。图35示出了在距离表面0.5mm的阵列上测量的场中采样电压(vf)的光栅扫描。阵列的中间区域的电场强度最高(在图35中显示为电压相对于沿着阵列的距离最陡的变化)。电极1-4为阳极，电极5-8为阴极(串联阵列配置)。比较含有和不含dna的葡萄糖、蔗糖和生理盐水。使用40v脉冲(100ms)、10％蔗糖载体溶液(无dna)的电场图如图36所示。这突显了在串联阵列的组合阳极和阴极之间空位周围场的压缩。
如图35所示，5.3％葡萄糖或10％蔗糖的场强高于0.9％盐水。dna(2μg/μl)的存在明显增加了所有载体的场强。蔗糖载体溶液中普通施加电压(vappl＝5v)的增加场强与gfp阳性hek293细胞的增加面积相对应，这些载体与盐水载体相比明显。最大场强(图35中2mm和3.5mm之间的曲线的斜率)为：5.3％葡萄糖+dna＝6.4v/cm(最大vf变化＝1.785-(0.640v/mm*最大场电位)；10％蔗糖+dna＝8.86v/cm(最大vf变化＝2.269-(0.886v/mm*最大场电位)；0.9％盐水+dna＝4.46v/cm(最大vf变化＝1.304-(0.446v/mm*最大场强)。含有dna的载体的场强次序：10％蔗糖>5.3％蔗糖>0.9％盐水。
图36示出了使用40v施加(电压)(am系统2200恒压刺激器)、、10％蔗糖载体溶液(无dna)的串联配置电极阵列右侧(半球场)2d电场图。y轴是相对于阳极4和阴极1之间的零点阵列位置。电极阵列长5.5毫米；上部区域由四个电极联合成阳极(+ve)，基底一半有四个电极联合成阴极(-ve)。电场3610的最强区域是与阵列零点正交且为阵列的中点区域(在y轴上的0点)。
图37至图40展示了使用恒定电流脉冲和蔗糖载体溶液进行体内基于仿生阵列的基因电转移的能力。图37是一组使用10％蔗糖载体溶液和串联配置布线仿生阵列实现的豚鼠背部脑干(孤束核区)中的一组神经元中gfp荧光的体内图像。质粒报告基因dna是pcba-egfp(2μg/μl)。在用恒定电流脉冲3×10ma×100ms脉冲(vapp1＝35v)进行基因电转移后7天，经固定(4％多聚甲醛)后对组织进行成像。
图38和39中的图像是利用蔗糖载体(gfp标记的内层鼓阶间充质细胞)的耳蜗基因递送的体内图像。dna是pcba-egfp质粒(2μg/μl)。用串联配置的仿生阵列基因电转移后4天用4％多聚甲醛固定后，对组织进行成像；10％蔗糖载体。对耳蜗四周脱钙。这些图显示gfp阳性的豚鼠耳蜗间充质细胞(绿色)鼓阶底。在图38所示的数据的实验中用3×2ma×100ms脉冲(vappl＝20v)，在图39中的数据的实验中用3×1ma×100ms脉冲(vappl＝12v)，通过恒定电流功率供应(digitimerds5刺激器)。
正如之前提到的，控制电场的几何形状能够空间靶向于电穿孔处理的区域，而由电穿孔脉冲引发的电场强度vf则控制了转染细胞的数量。载体溶液和dna浓度的选择可以使场强度改变并影响电场的几何形状。具体地，已经显示相比于盐水基载体溶液，蔗糖基载体溶液能够驱动电穿孔刺激脉冲利用较低的电流和电压振幅来实现细胞转染。因此，通过选择载体溶液可以减少为实现细胞转染而递送的累积电荷。这具有的优点如在治疗期间减少机电毒性风险并降低刺激脉冲递送要求。以下进一步详细讨论用于受控电穿孔的系统和方法的实施例。
该系统的实施方案可以更有效地转染dna、治疗性分子或其它药剂。本发明的实施方案涉及电穿孔探针和系统，其被配置为在用于电穿孔的一个或多个目标区域中产生不均匀的正交电场。该系统的实施例使电场在可使细胞摄取裸dna的参数内聚焦。
系统实例概述
在图1的框图中示出了本发明的电穿孔系统的简单实施例。系统100包括电穿孔探针110和脉冲发生器120。电穿孔探针或阵列110被配置为暂时插入到生物组织中用于电穿孔处理，并具有至少两个毗连的电极。优选地，作为阳极和阴极驱动的每对毗连电极之间的间距最好小于1mm，以在该对电极之间引起高电场梯度。
脉冲发生器120与所述探针电性连接，并且被配置为使用一个或多个电脉冲序列来驱动所述电穿孔探针，从而通过探针引起电流传输并且在探针电极附近的生物组织中引起非均匀电场。脉冲发生器120可以受电压或电流控制的，以向探针110提供一个或多个幅度和持续时间受控的脉冲序列。脉冲发生器不限于产生单个脉冲序列的单个源。例如，可以在各种电极上同时激活多个电流源和电流集，形成电场。
电场的形状受电极的物理结构和脉冲发生器驱动电极极性的影响。此外，改变脉冲持续时间、幅度、脉冲数量和载体溶液将影响细胞转化的数量。基于提供给治疗的治疗剂载体溶液和所期望的治疗结果，可以对脉冲持续时间、幅度和脉冲数量进行控制。因此，通过改变探针的电极阵列配置以及如何通过脉冲发生器驱动阵列元件(电极)，可以控制电场的形状，从而可以靶向于电穿孔的特定组织。设想可以制备具有各种构型的电穿孔探针，每个适合用于产生不同形状的区域。因此，探针可以针对特定的临床应用甚至为患者进行量身定制。探针电极阵列的物理结构为控制电场提供了一个方面，另一方面的配置是电极作为阳极和阴极的连接。在一些实施例中，脉冲发生器或电穿孔控制器可以适于将电极阵列元件选择性地配置为阳极和阴极。
对电场和驱动脉冲的控制可以根据电场的大小和形状以及场内转化细胞的密度来调节转导细胞的空间场。换句话说，本发明的实施例使局部定向基因递送的“拨号”控制成为可能。控制基因递送的另一个变量是载体溶液。在一些应用中，当确定基因疗法治疗时，载体溶液可能是可变的，载体溶液的选择可由临床医师选择。然而，应该认识到，也可预先选择载体溶液，例如由制造商预先选择，并且只有一种或少量的载体溶液可供临床医生选择。在适于dna递送的电穿孔系统的一个实施方案实例中，探针电极和驱动脉冲被配置为产生与阵列正交的非均匀电场，包括在50μv/μm至1500μv/μm范围内的电场梯度。其他电穿孔应用可以具有不同的目标电场参数，例如，适用于不同类型的细胞和治疗剂，并且所有这样的变化都在本发明的范围内。可见本发明电穿孔系统的实施方式可以通过修改探针配置和驱动参数以产生具有目标非均匀性参数的电场，从而配置适用于不同类型的治疗和靶细胞。也可以根据要使用的载体溶液来选择驱动参数。该系统可以通过产生瞬时透化细胞膜以允许分子易位的聚焦电场来将大量的分子递送至细胞。
具体探针/电极阵列配置
该系统的一个方面是包含了电极阵列的接口或探针110，所述电极阵列可以插入到生物组织中，相对于电极阵列的空间配置以可控制的方式递送能够引起电穿孔的成形电场。本发明电穿孔探针110被设计用于临时插入到生物组织中以达到基因递送目的，或者通过细胞的瞬时电穿孔递送其他治疗分子。
一个实施方案提供了一种不可植入的“电穿孔基因递送探针”(egd-p)。该探针由两个或更多个电极组成，当该电极由脉冲发生器(电压源或电流源)的电脉冲急速驱动时，能将探针附近的细胞进行电穿孔。电极之间的间隔最好小于1mm。原型探针的一个例子如图2a所示，相应的原理图如图2b所示。电穿孔探针包括两个或更多个电极，所述电极物理上相连接以插入组织中(未被组织分开)，并且被配置为将电流从一个或多个电极传递到其他电极产生的电场进行集中，用于分子(特别是dna)的闭场电穿孔递送目的。原型探针210包括由绝缘套管包裹的两根导电电线，电极阵列220设置在探针210的远侧末端。图2b是详细说明电极阵列配置的示意图。两根绝缘导线230延伸穿过探针的长度到末端。沿着导线的部分，去除绝缘层240以形成电极。如图2b所示，在探针纵向并列的每根导线的一部分上去除绝缘层，以形成毗连的电极对。在所示的实施例中，电极对形成的截面大约为2mm长，电极之间的间距小于1mm。电极对的数量和间距可以根据目标治疗区域来选择。具体地，本实施例用亚毫米间隔用于阵列内的阳极和阴极之间-以靶向于电极对区域中的治疗区域。可以沿着探针的长度使用多个电极对，从而沿着探针扩大目标治疗面积。在这个实施例中，每根电线将使用不同的极性来驱动，所以一根导线的电极是阳极，而另一根导线的电极是阴极。例如，导线分别电连接到脉冲发生器的正端和负端。
在该实施例中，也可以用套管来递送治疗剂(dna、药物或其他分子)，并且在电极的区域中套管进行了打洞从而能够递送治疗剂并提供电流通路。在电极由具有电绝缘性能的套管或其他材料覆盖的情况下，探针的电导性可以通过与电极相关的端口物理或材料特性来控制。应该理解的是，该实施方式能够将治疗剂递送至电极间进行电穿孔的目标区域，并有助于产生自阵列的电场的成型。在一些实施方案中，可以结合电穿孔来控制治疗剂递送。探针电极阵列的配置能够控制转化细胞的电场形状和密度。该装置将使得“拨号”跨细胞疗法递送成为局部基因治疗的理想选择。
应理解，用于插入组织的探针部分的尺寸直径可以非常小(例如在所示的原型中小于200μm)，从而可以用于微创治疗。所述探针还可以被制成具有协助插入组织的特性，例如兼顾刚度和灵活性，从而能够在与生物组织兼容的同时进行受控的放置。该装置与组织相兼容，因此其物理特性允许插入组织的同时保持所需的形状，或者应对组织内的机械压力以采用能够将阵列内的电极定位在组织内目标细胞群附近的形状。所述套管将被配置为递送治疗剂溶液并且可能受到溶液性质(例如分子大小、溶液粘度等)的限制。在一些实施方案中，可选择适合于通过所述探针递送的治疗剂溶液。例如，对于某些类型的治疗(例如新生儿、小儿或神经学治疗)，可以选择低粘度溶液从而采用导管较窄的较小探针；这可包括较低粘度的蔗糖，如蔗糖载体中的等渗葡萄糖。
所述探针包括两个或多个电极，其在物理上相连接，从而用于插入组织中，并且被配置为将电流从一个或多个电极传递到其他电极产生的电场进行集中，用于分子(特别是dna)的闭场电穿孔递送目的。在优选的实施方式中，电极阵列被配置成使得电场被构造为建立在50μv/μm至1500μv/μm的范围内的电场梯度，而与离电极表面150μm距离处的参照电势无关。在一优选实施例中，电极由最少两个相邻的电极组成，其电极尺寸通常为1mm长并且周长<1mm。
所述探针电极可以被配置成线性阵列，或者分布在整个表面上以形成二维阵列甚至三维阵列，例如平面的、弯曲的/保形的(conformal)表面。二维或三维阵列配置也可以使用各自承载着一个电极对的多个线性探针来提供。在一个实施例中，可以在柔性片上形成二维阵列，以在植入期间将阵列在组织上成形。
电场形状可以通过电极阵列内的阳极和阴极的变化配置布线来调节，在这种情况下，电极可以具有较小的尺寸(<1mm长度/周长>50μm长度/周长)。例如，可以在使用相对紧密间隔的交替阳极和阴极电极的线性阵列平行的载体中实现用dna转化细胞，而使用细长的阳极和阴极可以实现正交延伸到线性阵列的球形形状的转化细胞区域，或通过一起驱动多组相邻的电极(联动)作为阳极和阴极，并使电流在电极之间局部通过。
电穿孔基因递送探针(egd-p)被认为是一类医疗设备-建立一系列电极阵列探针作为生物性交互产物，用于最广泛范围的生物组织、体内或细胞和组织培养条件下的急性基因递送。在临床上，可紧急使用所述探针，其中作为经包装的消耗品，将其插入组织内的目标区域，例如大脑，并且通过将电流(或通过施加差分电压)从阵列内的电极子集局部地传递到阵列内的另一电极子集，产生局部成形的电场，该电场使得能够在探针附近的细胞上进行电穿孔和电泳作用，并引起治疗性dna穿过那些细胞的细胞膜而形成易位。
电场成形可以通过电极阵列内的阳极和阴极的变化配置布线来调节，在这种情况下，电极可以具有较小的物理尺寸(＜1mm长/周长>20μm长/周长)。例如，使用交替的阳极和阴极电极可以在平行于线性阵列的载体中实现用dna转化细胞，而正交地延伸到线性阵列的变形细胞的球形场可以通过分离阳极和阴极并在联动电极之间局部传送电流来实现。
在一个实施例中，egd-p装置由多个电极(两个或多个)以线性、二维或三维结构组成。图16显示了一个二维阵列和模拟电场的例子。
在一个实施例中，电极阵列由导电水凝胶材料制成，由低电导率区域(绝缘体)隔开。导电水凝胶可以在涂覆有导电聚合物层的金属(通常为铂)基底上生成，然后扩展到水凝胶以形成交互网络。然而，其他水凝胶实施方式也在本发明的范围内。导电电极具有电连续性，例如向电极提供电势时，将电场集中在阵列内的位置上，电极被一起驱动(联动)以产生同时回流到多个电极的局部电流。
在一个实施例中，可以用电极阵列耦合的特定配置来制造探针，使得基因递送靶向于组织内细胞的目标区域。例如，如上所讨论的线性阵列可以用在电极的绝缘体中具有间隙的绝缘电线来形成。在其他实施例中，电极可被印在或固定在基板上，使目标场有一个给定的形状。在其他实施例中，电极可以用电线网络形成绝缘的、暴露的和相互连接的配置以实现目标电场形状和梯度。
或者，该阵列可以是可配置如下，例如在一个实施例中，可以选择性地驱动每个电极，通常一起驱动两个或更多个联动电极作为阳极或阴极以实现所需的电场形状。在一个实施例中，这可以通过电连接要被共同驱动作为阳极或阴极的联动电极来实现，或者可以单独选择性地驱动每个电极。可以通过物理手段使电极结合在一起，例如通过手动物理连接电极线或使用插入接口来使电极之间的互连。例如，可以提供不同的可重复使用的互连模块，用于脉冲发生器和探针之间的互连，通过互连不同组的电极来重新配置阵列以实现不同的场形状。这可以使得一个实施例，其中含有电极阵列的通用一次性探针可以利用探针和脉冲发生器之间的不同互连模块/板并使用不同的阳极和阴极配置(联动)来驱动。
或者，可以提供配置模块以允许在控制器的控制下配置电极联动，例如配置模块可以像选择性地将电极连接为阳极或阴极的配电盘一样操作。在简单的硬件实施例中，这可以是一系列可手动操作的开关，每个电极一个。在另一硬件实施例中，可以使用一组电子可控固态开关，并且该实施例可以通过基于软件的控制器来实现配置控制。在一个实施例中，阵列可以由控制器配置，该控制器选择性地控制施加到阵列中的电极的极性和脉冲以控制所产生的电场。下面介绍控制器的更多细节。
图40中的一组图像显示，通过具有可切换阵列构造的基因递送平台在体外hek293细胞单层中使用恒定电流脉冲和基于蔗糖的载体溶液来实现分布式基因电转移。用一系列沿着阵列的电流脉冲，使用串联阵列配置gfp报告基因的递送沿着阵列的长度分布，以在电极1-4(阳极)和5-8(阴极)之间聚焦电场。在将3×100ms×1ma的电流脉冲传送到电极1-8(或者对于其他研究2ma或3ma脉冲)之后，使用开关箱将有源阵列(activearray)移位到第二场位置(电极9-12作为阳极和13-16作为联动阴极)，并重复特定的电流脉冲方案。在第四天固定后，这产生了转导后hek293细胞的延伸区域，成像为gfp荧光。将hek293细胞单层暴露于pcba-egfp质粒(2μg/μl)，基因电转移使用10％蔗糖载体溶液。在图40所示的例子中，前3个电流脉冲(3×100ms)被传送到最顶端的8个电极(1；其中阵列的轮廓显示在每个图像的底部，以便不掩盖经转染的gfp阳性hek293细胞)，然后将相同分布的第二系列脉冲递送到相邻(更基底部)的8个电极。串联阵列配置，四个相邻的联动阳极和四个相邻的联动阴极。如图所示，电流脉冲为1ma(vappl＝15v)，2ma(vappl＝25v)或3ma(vappl＝35v)。10％蔗糖载体；digitimerds5恒流刺激器，用于电流脉冲传输。基因电转后48小时成像。这些结果展示了利用可配置阵列来治疗可预测的、有针对性的组织区域。
在其它实施方案中，可以通过将一些电流引导至一个或多个分开的电极来调节电场形状，在电穿孔介导的dna递送有效电场外的距离处-或者与阵列完全分离，或者在与阵列中激活的电极之间的距离，该阵列用于限定靶基因递送电场(由基因递送控制器来调节)。
治疗分子，药剂或dna的递送
探针可以具有dna递送能力，例如作为涂层，通过从集成基质中洗脱，或通过微流体室进行递送。
在一个实施方案中，探针是不可植入的，这使得探针的实施方案也能够用于递送治疗剂、分子或dna。例如，egd-p可以包括包装的dna，其在电极之间通过电流之前释放到目标组织区域中以实现基因递送。基因递送探针可具有dna或分子递送能力，其通过集成的流体腔室(包括微流体通路或套管)递送治疗溶液。dna递送的方法可以是直接注射、通过具有一个或多个小孔的探针内嵌入式套管，微流体，或通过材料(例如但不限于与egd-p一体化的水凝胶基质)扩散(被动或电门控)，或通过热膨胀进行。尽管来自探针的多种药物递送可在单次操作中经多个电穿孔进行基因递送，但探针是不可植入的单次操作装置，其在预加载有治疗性dna或rna的良好生产规范(gmp)认证下的有效消耗品基因盒。当作为可植入仿生接口界面的附属物用于基因递送时，egd-p的尺寸可以小于可植入电极阵列。因此，可将egd-p制造成可缩放的，用诸如水凝胶和导电聚合物材料之类的复合材料生产，而不是包含在常规植入式仿生接口界面中使用的铂电极。在治疗递送方法是水凝胶基质或涂层的情况下，可以选择载体材料以引发目标电场反应，类似于上述对载体溶液所讨论的方法。例如，水凝胶基质组合物在治疗剂释放并进行治疗时可影响阵列区域中的电阻率，当确定治疗参数时，该材料组合物提供可控变量。
一些探针实施方式可以是具有一个以上的药剂递送结构。例如，用两个套管达到两种不同药物的分别受控递送，或者用一种套管和其他药物递送方法的组合，即补充药物洗脱涂层。在本发明的范围内可以想到药剂递送机制的任何组合。应该理解的是，可以在物理装置中提供多于一种流体或药物递送机制，并且这种结构不限于仅用于基因治疗剂。例如，除了基因治疗剂，可以通过递送机制提供其它化学物质。例如，作为电穿孔治疗的补充，可以通过探针递送补充治疗药物或抗生素。在一些情况下，载体溶液，特别是利用不含dna或其他治疗剂的蔗糖载体溶液可以产生对电场形状和强度的积极影响，因此在一些治疗中，可能希望仅递送蔗糖溶液以实现目标电场刺激，而不依赖于任何治疗剂的递送。可将递送系统控制器设置成控制两种或更多种药剂或其他化学品/溶液的递送顺序，其中两种或更多种药剂可以同时递送或序贯递送。药物/流体递送顺序可以与脉冲递送顺序同步。
应理解，本发明的实施例可以利用可植入探针。例如，可植入探针可用于一段时间的基因治疗疗程，例如几个月，并且为了最大限度地减少物理性损伤，将可植入探针一次性植入但在治疗过程(例如几个月或几年)中多次使用，然后任选地进行移除。可植入探针可以含有治疗剂，例如在涂层或电激励释放机制中，设置成与治疗剂递送机制相连。除了植入物的正常操作之外，或可以对植入物(例如耳蜗植入物)进行改造以用作电穿孔探针。植入物可以被设为临时性使用而仅作为基因递送探针，也可以根据植入物的基本功能永久使用。例如，可以向可植入装置增加治疗剂递送能力，例如通过还含有一套管，其可临时性连接到治疗递送线，或通过将治疗剂结合到可电激发的微流体释放机制中。可以对植入物进行控制，以从常规操作切换到基因治疗模式从而提供治疗，再恢复常规功能。在植入物实施方案中，可以选择治疗剂载体溶液以使得能够利用低幅度电穿孔脉冲达到功率消耗最小化和/或在驱动基因治疗的电极时避免设计用于基本功能的植入电极过载。
基因递送探针可以包括能够控制或不受控地释放嵌入或涂覆的治疗分子的材料。在一个实施方案中，基因递送探针可以被组装成绝缘材料片，其中阵列中的嵌入式电极被包裹在用于dna递送的套管周围。用于dna递送的套管通常是多孔的，并且电极片(阵列)的包裹可以是多孔的，以允许从中心套管递送溶液。
具有或不具有套管的片材阵列可以是可缩放的，其中重复的电穿孔原件通常包括电极，该电极被设置为将距离电极表面不超过5mm体积的组织转换。
在一个实施方案中，探针可以包括流体通道，例如套管或微流体，以在电穿孔介导递送治疗分子穿过细胞膜之前使得治疗剂(例如dna)穿过装置运动到装置周围的空间。这可以使药物递送和电穿孔进行多次重复，或者多个分离的治疗剂在不同位置进行递送，位置是通过瞬时电穿孔接收试剂的细胞目标场。在一个实施例中，探针包括可由控制器操作的递送致动器，以使治疗剂递送能够由控制器自动控制。例如，这可以将药物递送和电穿孔脉冲的协调序列编程到控制器中从而自动执行。应理解，对药剂递送和电穿孔的自动控制可以提供更精确的治疗控制和优化。这也使得训练有素的技术人员能够在治疗之前与专家/外科医生协商准备所需的程序，并且一旦专家/外科医生将探针放置在生物组织中，就可以在自动控制下进行治疗。
在一个可选的实施方案中，探针可以包括封装在装置材料内的治疗分子，从而能够设计界面材料的治疗分子洗脱曲线以确保在电穿孔之前，治疗分子在细胞靶区域内就得以快速平衡。这可以包括使用水凝胶基质，其分子构造与产生相对于治疗性分子的扩散性质所需的洗脱速率(通常取决于尺寸和电荷)相匹配。在一些这样的实施例中，将探针放置在生物组织中可以触发分子的释放。
或者/除此以外，可以通过电极的激活来刺激分子的释放。例如，在一个实施方案中，所述装置可以包括门控药物递送，其中治疗剂通过连续的电偏压电位保留在基质材料(例如水凝胶)上或经其释放。可以利用比电穿孔脉冲更低的功率信号(电流或电压控制)激活电极以刺激分子的释放，该信号足以刺激分子释放到组织，但不足以引起任何其它生物效应。在该实施方案中，分子释放信号和电穿孔脉冲可以按时间顺序以优化临床结果。
所述探针可以被设计成消耗品，用作一次性药物递送和电穿孔探针，并且可以具有电记录能力以帮助基因电转移的放置和时机，例如电阻测量和电生理学测量。理想的探针由水凝胶成分或允许机器制造的材料制成，其中导电元件(电极)的尺寸通常小于500μm3，且理想的接口尺寸比传统的可植入仿生电极阵列(如耳蜗植入物)占用的体积更小，可以在使用该基因/药物递送装置之后将其植入电场。因此，egd-p的制造将涉及自动化的可扩展阵列生产，而不是依赖于使用常规电极材料(例如铂)和手动组装/布线。具体地，水凝胶骨架例如pva/hep(肝素)将被结合到分层的复合材料，并且导电聚合物例如聚(3,4-亚乙基二氧噻吩)(pedot)将被掺杂在结构内和表面(如电极点)。
控制器
如图1所示，电穿孔系统的实施例可以是简单的，具有探针110和脉冲发生器120，其可以被手动控制或被设置为提供固定的脉冲序列。例如，为专门的临床应用而设计的系统，其中对于所有患者使用相同的参数，脉冲发生器可以被设为传递设定的脉冲序列。因此，对于每个患者，新的一次性探针连接到脉冲发生器，插入到目标组织中，然后激活发生器以提供目标脉冲，最后移除探针并丢弃。这样一个简单的实施例可以适用于常规的常规治疗，例如可以开发一种适用于常规皮肤科治疗的这种治疗。
然而，本发明人认为该系统可适用于许多不同类型的治疗，特别是基因疗法治疗，其需要对治疗进行定制化和并控制其高度。如以上所讨论的，本系统的实施例可以包括设置用于控制脉冲生成的控制器，并在一些实施例中包括药剂递送。实施例还可以提供了在时间上是多路复用的通过电流或施加电压，所以短时间内在整个阵列的不同位点中可能会产生一系列的电穿孔事件。
控制器也可以用来来控制阵列配置。系统中可以含有控制器，以便于设置和控制产生电场所需的参数。在一个实施例中，控制器可以包含脉冲发生器并且设置为向基因递送探针输送电流。电流控制模式和电压控制模式针对的是不同的控制器实施例，或者实施例能够选择性地在电压控制模式或电流控制模式下进行操作。控制器可以向基因递送探针内阳极和阴极的预设电极配置提供电流，或者阵列内的电极配置可以手动切换或通过控制器切换。
包含脉冲发生器的控制器能够向阵列电极提供足以实现基因递送探针周围必须电场梯度所需的电压。所述控制器还可以包括对治疗性分子递送的控制。所述控制器可以设为基于治疗剂的载体溶液调整脉冲发生器的参数。例如载体溶液类型可以由操作员输入到控制器。可选地，控制器可以被配置为根据载体溶液性质的确定来调整治疗脉冲参数，例如通过治疗输送模块的化学传感器或通过对操作特性的测定。在一个实施例中，可以设置控制器利用放置在治疗环境(体内或体外)中的探针来测定操作特性。在一个实施例中，可以设置控制器执行预处理测试以确定阵列和载体溶液体内的视电阻率，以预测施加电穿孔脉冲时的电压。例如，控制器可以触发脉冲发生器产生已知电流或电压的短持续时间低幅度脉冲，并且基于测量的电压和电流特性确定视电阻率。视电阻率可受治疗剂溶液组合物、阵列周围的治疗剂溶液(例如dna浓度和载体)的量，阵列周围的组织对治疗溶液渗透性和组织特性的影响。在一些实施方案中，可以仅供应载体溶液(例如不含dna或其他治疗剂的蔗糖基载体溶液)以局部改变所治疗组织的体内电特性以降低达到电穿孔效果所需的电荷。控制器可以被配置为：如果所测量的电阻率特性落在治疗的容许范围之外则自动调整治疗脉冲参数。例如，在电阻率高于预期的情况下，控制器可以减小驱动脉冲电流幅度以控制电流源脉冲发生器。如果电阻低于预期，那么驱动脉冲幅度可能会相应增加。这种调整的目的是在治疗阶段驱动阵列以实现达到治疗结果所需的目标电场特性。也可以使用电阻率测量来触发电穿孔脉冲序列，例如可以监测电阻率以确定何时递送适当量的治疗剂溶液(以及任选的其它载体溶液)以进行治疗-例如，当阵列的电阻率达到阈值或停止改变指示饱和时。因此，测量阵列电阻率预处理的反馈可以提高治疗结果的可靠性。
图15中示出了包括控制器的系统实施例的框图，系统1500包括如上所述的探针和电极1510以及控制器1530。在该框图中，所显示的控制器包括脉冲发生器1520，然而脉冲发生器可以是单独的设备。所阐述的实施例还包含可选特征，例如配置组件1540，从而能够控制如上所述的阵列配置；药剂递送模块1550，用于通过探针控制治疗剂的递送；用户界面1560；以及用于存储诸如治疗参数1580和治疗记录1590数据的存储器1570。
在一个实施例中，控制器使用计算机系统来实现，该计算机系统可以涵盖该系统的全部功能，或者经由数据连接来控制专用硬件组件。控制器硬件、固件和软件的任何可能的配置都在本发明的范围内。在一个实施例中，控制器功能可以使用专用硬件设备来实现，例如经修改以提供控制器功能的脉冲发生器的版本，或者专用硬件设备，例如包括硬件逻辑asic(专用集成电路)或fpga(现场可编程门阵列)，实现控制器功能的固件和软件。专用系统的优点可以独立于商业软件平台和操作系统，这可能有利于获得监管批准并将系统限制用于预期目的。然而，该实施例的缺点可能是增加系统开发和持续维护成本，并且无法利用技术领域中的新技术或新发展而缺乏灵活性。
可选地，控制器功能可为在计算机系统上执行的软件程序，例如个人计算机、服务器或平板电脑，并被配置为向独立的脉冲发生器和诸如药剂传送致动器之类的其他可选硬件提供控制指令。可采用市售计算机硬件，基于软件的控制器可执行实施例为专家提供用户界面1560以输入用于电穿孔治疗1580的参数，然后存储在存储器1570中以用于驱动脉冲发生器1520和任选的配置组件1540以及在电穿孔治疗输送期间的药剂递送组件1550。在一个实施例中，这可以包括控制器分析目标治疗区域参数和载体溶液参数；确定适当的电极阵列配置；以及定义基于上述关系计算的至少一个脉冲序列，以针对每个适当的阵列配置实现目标治疗区域。在药剂输送可由控制器控制的实施例中，控制器还可以计算和定义治疗脉冲序列中的药剂输送启动。在阵列配置可由控制器控制的实施例中，控制器还确定了由配置模块启用阵列配置。在阵列配置取决于固定阵列配置选择的实施例中，所选探针阵列配置可由专家/外科医生/临床医生输入到控制器，或者控制器可输出探针选择推荐。如果一种以上的阵列和脉冲序列组合被确定适于满足治疗要求，则可能的组合均可被输出给外科医生/专家/临床医生进行选择。
控制器的一些实施例可以提供软件来对治疗进行建模。在一些实施例中，用于建模的数据可以包括患者图像数据(即，mri或ct扫描)从而能够结合患者数据考虑建模的治疗区域。建模数据还可以包括治疗剂载体溶液的选项。例如，确定可行或最佳的载体溶液参数，通过建模安全地达到理想的治疗效果。或者，在可供选择的载体溶液数量有限的情况下，为每个选项建立可能的结果模型，以有助于专家/外科医生/临床医师的决策。
应该理解的是，与计划治疗相关联地提供的系统功能可能是复杂的，而且利用复杂的软件模型来确定驱动物理治疗设备所需的数据。但是物理上执行处理所需的实际数据可以非常简单-确定的阵列配置(其甚至可以是固定阵列)，定时的脉冲序列以及任选的用于选择药剂溶液的药剂输送控制信号。因此，控制器可以简单地输出序列数据用于驱动物理治疗设备。
脉冲发生器1520的实施例可以在电压或电流驱动模式下操作。在一个实施例中，脉冲发生器是具有独立于控制器的自给电源独立单元。脉冲发生器可以与控制器进行数据通信，以使控制器能够用脉冲序列对脉冲发生器进行编程。或者，脉冲序列可由控制器计算并通过手动编程或数据传输(例如通过直接连接、无线连接或经由诸如便携式固态存储器装置的物理介质)加载到脉冲发生器中，并且脉冲发生器独立于控制器进行治疗输送。来自控制器的脉冲发生器的隔离可能是某些系统安全的要求，特别是一次性探针能用已经批准并可用于人类临床使用的脉冲发生器来操作。在一些国家，这可以使得探针的独立监管批准能够与市场上可买到的和经过监管认可的脉冲发生器的选择结合使用。
其他实施例
在本发明的实施例中，全部或大部分电流在阵列内回流。在一些实施例中，电流的引导可包括将少量电流转移到一些远程外部回流电极。适用于所描述的所有先前配置，可以使用与阵列分开的另外的远端回流电极来将所施加的一定百分比的电流进行回流，并由此改变电场的局部成型以及由此形成的转化细胞。这能够使电流通路通过局部(闭场)和远场平衡技术或二者的组合得以动态控制，-这通过建模和体外及体内测试获知。电流通路将主要在阵列的电极内返回。电流的引导可包括通过调节一些外部电流扩展的外部控制器和电路。
如图20所示，其为2d电极阵列2010进行电场聚焦的电流导引的准单极控制的示意图。电流源和电流汇2020a-d提供了对从2d电极阵列分流到一个或多个单极回流电极2030(远离目标细胞转导电场)的电流比例的控制。
图21示出了依靠阵列内的电极配置的电流导引示例。单极2110反映了传统的开场电流通路，而六极2120和准单极2130配置提供了与邻近的电极阵列相关联的电场聚焦，靶细胞群不介入主电极阵列结构内。在准单极电流导引2130的情况下，少数电流被分流到远离连续电极阵列的电极。
图22示出了滴定电场聚焦的刺激策略示例，包括电流向阵列内连续电极单极性返流，如图22所示为由电流源电极(阳极)的六边形阵列包围的中心返流电极。qmp-准单极电流控制包括对远离转导靶细胞的电极进行受控分流。hexapolar配置模型分布在一个可扩展的阵列中。
在一个实施例中，探针可以具有可切换的电极通道，使得一些通道可以用于瞬态电刺激以及用于通过隔离仪器进行记录的其他通道，以便对设备进行功能性定位(例如在cns输送的情况下从大脑区域进行记录-通常用于可植入的深度脑刺激电极阵列定位的程序)。在一个程序中可以在刺激/记录探针和闭场电穿孔模式之间多次配置该装置。
原型示例和测试结果
原型探针的细节如图17a至17c所示。原型包括套在套管中的两根绝缘电线。在套管去除了导线绝缘部分的区域中形成狭槽，以构成电极用于流体输送和电流扩散。在这个原型中，每条导线具有不同的极性，因此在一条导线上形成的电极用作阴极，在另一条导线上形成的电极用作阳极。图18显示了使用原型的测试结果。
图18显示了使用图17a至17c所示原型套管鞘线性双极电极配置实现了闭场电穿孔基因递送。这在人类胚胎肾(hek293)细胞在盖玻片上单层生长的区域中核定位绿色荧光蛋白(nlsgfp)信号是明显的。图18的a和b示出了电脉冲参数为20v时2×100ms脉冲的示例。在盐水载体溶液中的裸dna质粒(cmvp-bdnfx3flag-ires-nlsgfp)以2μg/μl，(20μl)用于细胞，基因递送探针位于细胞层的正上方。转导的细胞区域跨度大约为2mm2(箭头)。图18的c显示了对照(用基因递送探针将dna加到细胞上，但是探针上没有施加电脉冲。dna递送后进行48小时的细胞培养。使用共焦lsm在488nm激发下成像)。
图19显示了使用串联配置的线性电极阵列实现在豚鼠cns中靶向电穿孔基因递送。a显示了在四个神经元(488nm激发共聚焦灰度图像)中显示核定位绿色荧光蛋白(nlsgfp)的小脑皮层冰冻切片(50μm)。图19的b和c显示使用针对flag标签的免疫荧光双标记表达nlsgfp和重组脑源性神经营养因子(bdnf-3xflag)的神经元。实心箭头表示gfp和bdnf表达细胞-空心箭头表示2个额外的表达bdnf但nlsgfp信号未检出(c具有绿色和红色频道)的神经元。在大约10秒钟内向小脑皮质的蚓部区域用基因盒(cmvp-bdnfx3flag-ires-nlsgfp)快速注射10μl裸露的cdna质粒(2μg/μl)，然后将8电极阵列插入注射通道5mm，并使用串联电极配置(2x100ms15v脉冲，900ms间隔)进行电穿孔；存活3天。图19的d&e分别显示电穿孔基因递送后在豚鼠中脑的中脑导水管灰质区域内的神经元的nlsgfp(绿色荧光)和重叠的bdnf(具有alexa594nm激发二级抗体提供红色免疫荧光信号的抗flag一级抗体)表达(50μm冷冻切片)。在本实验中，使用经由27g针头的微型驱动器(microdrive)，在立体定向控制下，经由下丘将质粒dna(2μg/μl)注入中脑7mm(10μl，500nl/min)。然后撤回dna注射针并插入电极阵列进行电穿孔，如a-c所示。电极阵列由一行8个直径为350μm的铂环组成，间距为300μm；四个相邻的电极组成了阳极，另外四个在15v时作为阴极组成2x100ms脉冲。
如以上测试结果所示，本发明的实施例可以提供可预测的基因递送结果。本发明提供了一类新型的医疗装置，其在作为用于生成聚焦电场的一次性单次使用接口的预期临床应用中起作用，以用于生物组织内细胞的靶向电穿孔。电场成型电穿孔的应用是一类新型基因递送平台，其围绕“拨号”式控制来使表达盒对“何处”以及“多少”细胞进行转化。
该系统的实施方案使剂型“拨号”局部基因递送至组织内的一小群(策略性)细胞，例如耳蜗内层的细胞，或在大脑的规定区域中的神经元组。在一些实施例中，该接口是不可植入的一次性装置，并且通过独立电源的外部连接供电。所述接口含有dna溶液递送能力，如微流体通道，或从水凝胶或其他洗脱基质扩散，或涂布。
这种电穿孔系统的一个优点是该探针是一种不可植入的装置，可以作为植入式仿生学的补充，例如人工耳蜗植入物和脑植入物如深部脑刺激电极阵列；或者可以充当急性治疗装置，将独立的定向基因递送至目标组织；或者提供其他治疗分子的定向递送，所述递送包括控制性瞬时穿透局部细胞区域，而该区域是药物递送的靶标。
在一些实施例中，电穿孔探针是不可植入的，而是插入目标区域中通过不连续的电脉冲序列对目标分子进行急性递送。这使探针的材料和结构类型具有更大的灵活性，因为这些材料不需要长期或重复使用。此外，探针不需要符合植入物的规定或长期安全性和功效要求。
作为一次性使用的消耗品，目的是实现对可扩展阵列周围的转导组织体积的“拨号”式控制以用于定向分子递送，这是仿生植入程序的附件，也作为一个独立的治疗，如针对中枢神经系统疾病的局部基因治疗。
电极通常可以由导电聚合物制成，并且接口的物理性质使得其可以匹配插入目标组织或器官所需的物理配置。
可以将阵列设计成不可植入的，因此，在egd-p装置中，不是通常用在仿生阵列中的铂电极，优选的材料可以是水凝胶、导电和非导电聚合物和复合材料。探针在尺寸和电极布局(线性，2d或3d)方面可以扩展，并且电极在阵列中以固定配置连接并驱动(联动)在一起，或者由相关的控制器和驱动器外部联动，以灵活地聚焦局部电场。
“闭场”电穿孔使用裸dna实现基因递送的靶向可控，这是其他过程无法实现的。例如，用这种基于微域阵列的电穿孔可实现基因递送的时空控制，可以通过以谷氨酸脱羧酶(gad65)dna构建体靶向丘脑下核神经化学调节的基因治疗来提供可能的帕金森病病毒载体改良治疗。裸dna基因盒的电穿孔相对于其他基因递送技术也具有明显的优势，因为与脂转染或病毒载体，特别是腺病毒相比炎症反应小，并且质粒dna379盒的大小相对不受约束。
本发明的实施方案可用于用裸dna诱导受控细胞转化-在局部基因递送中具有“拨号”式的可预测性并实现基因构建体的表达。基因表达位点和程度的控制是安全有效的基因治疗方法中的关键要素，尤其是脑部疾病治疗，其需要特定的部位进行治疗。
本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以对本发明进行修改。
在接下来的权利要求中以及在本发明的前述描述中，除了由于表达的语言或必要的暗示而在上下文中另外要求外，词语“包括”或变形体例如“包含”或“含有”以包含的含义使用，例如，指明所述特征的存在，但不排除在本发明的各种实施例中存在或添加其他特征。
应该理解的是，如果在此涉及任何现有技术的出版物，这样的参考不构成承认该出版物构成澳大利亚或任何其他国家的本领域公知常识的一部分。
实施例1：体外hek293细胞单层模型
在这个例子中，，发明人通过微电极阵列(例如耳蜗植入物阵列)与蔗糖载体一起使用，显示了高效的电穿孔和dna电转移。将编码gfp报告分子的质粒dna(约2μg/μl)的蔗糖载体(10％，ph调节至7.3)应用在放单层hek293细胞的盖玻片上。相对于使用生理盐水溶液(tris缓冲盐水和普通生理盐水(0.9％nacl))，在一样的电流下，由于阵列中联动电极上的电流分布而在电极上产生的电压的测量值增加了10倍。这导致了编码gfp报告分子的质粒达到高效的局部基因电转移，这由电穿孔后18小时的荧光显微镜检测。相反，在相同电流下，盐水载体的电转移可忽略不计。当用恒定电压进行电穿孔时，使用蔗糖载体也有明显的优点，即达到设定电压所需的电流减少。
本发明对于最小化使用仿生阵列获得有效基因递送所需的电流是重要的，因为基因电转移依赖于电极阵列附近的局部电场强度，并且与蔗糖载体一起的恒定电流(而非恒定电压)将使最小的电荷传递有最大的基因递送效率，从而将潜在的毒性最小化。在这种电流调节配置下，每个电脉冲所需的电流减少，等同于当(铂)电极的法拉第容量超量时，由介质与水的电化学相互作用引起的有毒产物直接减少。这包括在电极表面的电解作用，导致水分解为氧气和氢气，以及由于氧化还原反应和直接热量反应而产生的其他毒剂。
其他参考使用蔗糖作为电穿孔和基因电转移的dna载体的考虑因素是蔗糖的相对静止是保护性的，因此在电压经调节的基因递送下可缓冲瞬时移植的细胞中的渗透压。在没有仔细分析电流输送的情况下，这里发现的蔗糖的微分效应在电压相关模式下是检测不到的。然而仿生阵列的闭场电穿孔的有效基因转移的关键因素是局部化的电场强度。在这个区域中，与电流输送一起使用的蔗糖载体，能够在较少的电荷传送下为基因递送提供必要的场强。这里所提到的用于闭场基因电转移的仿生阵列由两个或多个亚毫米间距的亚毫米电极阵列组成，以偶联的方式使电场能够聚焦在阵列附近。
实施例2：体内豚鼠耳蜗dna电转移实例
在这个实施例中，在异氟烷麻醉的豚鼠中进行耳蜗造口术，并将编码gfp报告分子(2ug/ul)的质粒dna溶液注入耳蜗，使用平衡至ph7.3的10％蔗糖作为载体。之前报道的使用盐水载体溶液电阻约850欧姆，而使用蔗糖载体溶液则将阵列电阻增加十倍到约8.5千欧姆。这些结果是使用八节点仿生阵列实现的，其将连接在一起的4个相邻阳极和四个相邻的阴极的“串联”配置在一起。基因电转移用1ma的3×100ms脉冲的恒定电流进行。这产生了约12伏的电极电压，足以通过鼓阶中内层间充质细胞(liningscalamedia)建立gfp报告子的表达。相比之下，用生理盐水(0.9％)作为载体获得的电压是1.2伏，低于报道的基因递送阈值。类似地，在另外的实验中用2ma施加电流6.65千欧姆实现了gfp的表达，其引发出了～25v的电压。这是与此仿生阵列使用生理盐水约2.5v相比。
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