本发明实施方案通常涉及纤维化治疗，并且具体涉及硫酸葡聚糖用于治疗、抑制或预防受试者的心脏纤维化的用途。
发明背景
纤维化是在修复或反应过程中在器官或组织中形成过量纤维结缔组织的过程。纤维化可以是反应性的、良性的或病态的。为了应对损伤，纤维化过程有时被称为瘢痕形成。
生理性纤维化涉及沉积结缔组织，其可以消除下面的器官或组织的结构和功能。纤维化与瘢痕形成过程类似，都涉及受刺激的细胞产生包括胶原蛋白和糖胺聚糖的结缔组织。巨噬细胞和受损组织响应于例如炎症或组织损伤而释放转化生长因子β(tgfβ)。这反过来又刺激成纤维细胞的增殖和活化，成纤维细胞沉积结缔组织。
us5,605,938公开了生物相容性阴离子聚合物(包括平均分子量约40,000至2,000,000da的硫酸葡聚糖)可以抑制纤维化、瘢痕形成和通常与手术相关的手术粘连。阴离子聚合物在纤维化损伤处局部施用，或者可以粘性液体或凝胶形式浸泡到器官或植入物上，所述粘性液体或凝胶优选还包含含有二羟苯丙氨酸(dopa)和含羟基氨基酸残基的粘附蛋白。
cn102973593公开了硫酸葡聚糖在制备用于治疗肝纤维化的药物中的用途。所述文件提到硫酸葡聚糖抑制星形胶质细胞的激活并促使巨噬细胞分泌金属蛋白酶。
发明概要
总体目标是治疗、抑制或减少受试者的心脏纤维化。
这个和其它目标由在此公开的实施方案来满足。
实施方案的一个方面涉及配制用于全身施用于受试者的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，用于治疗、抑制或预防受试者的心脏纤维化。
实施方案的另一方面涉及硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐在制造配制用于全身施用以治疗、抑制或预防受试者心脏纤维化的药物中的用途。
实施方案的另一方面涉及治疗、抑制或预防受试者心脏纤维化的方法。所述方法包含向受试者全身施用硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐。
图式简单说明
结合附图参考以下描述，可以最好地理解实施方案及其进一步的目的和优点，其中：
图1示出了间质性纤维化程度的估计。间质性纤维化的相对面积显示与对照组1m相比，硫酸葡聚糖组2m中的心肌梗塞诱导的间质性纤维化的显著抑制(根据单因素方差分析，随后的邦弗朗尼(bonferroni)事后比较，**p<0.01)。
图2a-2d是来自对照组1m的两只动物和来自硫酸葡聚糖组2m的两只动物的纤维化等级的图片。
实施方式
本发明实施方案大体上涉及纤维化治疗，并且具体涉及硫酸葡聚糖用于治疗、抑制或预防受试者的心脏纤维化的用途。
实施方案基于以下发现：全身施用的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐能够减少受试者中不希望的纤维化形成，特别是减少或抑制局部缺血组织，特别是局部缺血性心脏组织中的这种纤维化形成。
纤维化疾病包括可能影响受试者体内不同器官和组织的多种医学病况。这些医学病况的特征在于编码基质蛋白的基因表达升高，并且由此产生的纤维化破坏了受影响的器官或组织的正常结构，最终导致其功能障碍或衰竭。
实施方案在治疗、抑制或预防纤维化疾病的不利作用方面能够通过减少心脏或心脏组织中形成的纤维化的量来治疗、抑制或预防心脏纤维化。因此，实施方案的硫酸葡聚糖能够治疗、抑制或预防有害或致伤的心脏纤维化。
因此，实施方案的一个方面涉及配制用于向受试者全身施用的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，用于治疗、抑制或预防受试者的心脏纤维化。
根据美国专利第5,605,938号，全身递送的硫酸葡聚糖可以显著减少有害的纤维化形成，这是非常令人惊讶的。这一专利文献公开了局部施用硫酸葡聚糖可以抑制尤其与各种植入物的植入有关的纤维化和瘢痕形成。其中据推测，硫酸葡聚糖聚合物的负电荷涉及抑制植入部位处的各种细胞的侵入。为了使这种负电荷具有细胞侵入抑制效果，硫酸葡聚糖需要在所需部位局部施用。因此，在美国专利5,605,938中有利地用硫酸葡聚糖包覆植入物。
这里给出的实验数据表明，实施方案的硫酸葡聚糖可以全身施用，即不在目标部位局部施用，并且仍然发挥其期望的抗纤维化作用。
配制硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐用于向受试者全身施用。在一个实施方案中，将硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐配制成用于肠胃外施用作为全身施用的实例，以在受试者中实现全身作用。
肠胃外施用途径的实例包括静脉内(i.v.)施用、动脉内施用、肌内施用、脑内施用、脑室内施用、鞘内施用和皮下(s.c.)施用。
在一个实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐优选配制成静脉(i.v.)或皮下(s.c.)施用于受试者。因此，i.v.和s.c.施用是硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的全身施用的优选实例。
已知口服硫酸葡聚糖可诱导小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠的结肠炎和肠纤维化。因此，如本文所用的全身施用优选不包括硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的口服。在一个具体实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的全身施用是除口服以外的全身施用，优选不是肠内施用。
在一个实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐被配制成注射水溶液，优选配制成i.v.或s.c.注射水溶液。因此，实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐优选配制成具有选择的溶剂或赋形剂的注射水溶液。溶剂有利地是含水溶剂，特别是缓冲溶液。这种缓冲溶液的非限制性实例是柠檬酸缓冲液，如柠檬酸单水合物(cam)缓冲液或磷酸盐缓冲液。例如，可以将实施方案的硫酸葡聚糖溶解在生理盐水(如0.9％nacl生理盐水)中，然后任选用75mmcam缓冲并使用氢氧化钠将ph调节至约5.9。非缓冲溶液也是可能的，包括注射水溶液，如生理盐水，即nacl(aq)。此外，如果需要缓冲溶液，那么可以使用除cam和磷酸盐缓冲液之外的其它缓冲系统。
硫酸葡聚糖优选是所谓的低分子量硫酸葡聚糖。
在下文中，提及硫酸葡聚糖的(平均)分子量和硫含量也适用于硫酸葡聚糖的任何药学上可接受的盐。因此，硫酸葡聚糖的药学上可接受的盐优选具有如以下实施方案中所讨论的平均分子量和硫含量。
硫酸葡聚糖是一种硫酸化多糖，尤其是一种硫酸化葡聚糖，即由许多葡萄糖分子组成的多糖。如本文所定义的平均分子量指示单独的硫酸化多糖可能具有不同于这一平均分子量的分子量，但是所述平均分子量表示硫酸化多糖的平均分子量。这进一步意味着硫酸葡聚糖样品将在这个平均分子量附近具有分子量的自然分布。
硫酸葡聚糖的平均分子量(mw)通常使用间接方法如凝胶排阻/穿透色谱法、光散射或粘度来测定。使用这种间接方法测定平均分子量将取决于许多因素，包括柱和洗脱液的选择、流速、校准程序等。
平均分子量(mw)：
在一个实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐优选具有等于或低于40000da，更优选等于或低于20000da，尤其等于或低于10000da的平均分子量。
分子量超过10000da的硫酸葡聚糖与具有较低平均分子量的硫酸葡聚糖相比通常具有较低的效果比毒性特征。这意味着与具有优选范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖分子相比，对于较大的硫酸葡聚糖分子(>10000da)，可以安全施用于受试者的硫酸葡聚糖的最大剂量较低。因此，当将硫酸葡聚糖全身施用于受试者体内时，这种较大的硫酸葡聚糖分子在临床应用中不太合适。
在一个实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的平均分子量在2000至10000da的范围内。在另一个实施方案中，平均分子量在2500至10000da的范围内。在一个特别优选的实施方案中，平均分子量在3000至10000da的范围内。
在一个任选但优选的实施方案中，小于40％的硫酸葡聚糖分子的分子量低于3000da，优选小于35％，如小于30％或小于25％的硫酸葡聚糖分子的分子量低于3000da。另外或替代地，小于20％的硫酸葡聚糖分子的分子量超过10000da，优选小于15％，如小于10％或小于5％的硫酸葡聚糖分子的分子量超过10000da。因此，在一个具体实施方案中，硫酸葡聚糖在平均分子量附近具有相当窄的分子量分布。
在一个具体实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的平均分子量在3500至9500da的范围内，如在3500至8000da的范围内。
在另一个具体实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的平均分子量在4500至7500da的范围内。
在另一个具体实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的平均分子量在4500至5500da的范围内。
因此，在目前优选的实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的平均分子量优选为约5000da或至少基本上接近5000da，如5000±500da，例如5000±400da，优选5000±300da或5000±200da，如5000±100da。因此，在一个实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的平均分子量是4.5kda、4.6kda、4.7kda、4.8kda、4.9kda、5.0kda、5.1kda、5.2kda、5.3kda、5.4kda或5.5kda。
在一个具体实施方案中，如上所示的硫酸葡聚糖或其药学上的盐的平均分子量是平均mw，并且优选通过凝胶排阻/穿透色谱法、尺寸排阻色谱法、光散射或基于粘度的方法测定。
在一个具体实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐平均包含约5个或略高于5个葡萄糖单元，并且每个葡萄糖单元的平均硫酸根数目为至少2.0，如至少2.5。
硫酸葡聚糖是葡聚糖的聚阴离子衍生物并含有硫。实施方案中硫酸葡聚糖的平均硫含量优选为15至20％，更优选约17％，通常对应于每个葡糖基残基约或至少两个硫酸根基团。在一个具体实施方案中，硫酸葡聚糖的硫含量优选等于或至少接近相应葡聚糖分子的最大可能的硫含量。
在一个具体实施方案中，实施方案的硫酸葡聚糖通过核磁共振(nmr)光谱法测量的数均分子量(mn)在1850和2000da的区间内。
在另一个具体实施方案中，实施方案的硫酸葡聚糖平均具有5.1个葡萄糖单元，并且每个葡萄糖单元的平均硫酸根数为2.6至2.7，通常使得通过核磁共振(nmr)光谱法测量的数均分子量(mn)在1850至2000da的区间内。
数均分子量(mn)：
wo2016/076780中描述了可以根据实施方案使用的硫酸葡聚糖或其药学上的盐。
根据实施方案的硫酸葡聚糖可以作为硫酸葡聚糖的药学上可接受的盐提供。这样的药学上可接受的盐包括例如硫酸葡聚糖的钠盐或钾盐。
用于实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的合适的剂量范围可以根据受试者的大小和体重、受试者的治疗条件和其它考虑因素而变化。特别对于人类受试者，可能的剂量范围可以是1μg/kg至150mg/kg体重，优选10μg/kg至100mg/kg体重。
在优选实施方案中，将硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐配制成以0.05至50mg/kg受试者体重，优选0.05或0.1至40mg/kg受试者体重，更优选0.05或0.1至30mg/kg或0.1至25mg/kg或0.1至15mg/kg或0.1至10mg/kg受试者体重范围内的剂量全身施用。
实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的全身施用优选在可能以其它方式引起受试者的纤维化和特别是有害纤维化的事件或病况发生之后尽可能快地开始。例如，纤维化常常在造成受试者局部缺血或心血管疾病的损伤或其它病况之后发生。在这种情况下，优选在检测或诊断造成局部缺血或心血管疾病的损伤或其它病况之后，尽快进行硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的全身施用。
硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的全身施用不一定限于治疗目前的医学病况，而且可以替代地或另外用于预防。换句话说，实施方案中的硫酸葡聚糖可以全身性地施用于将经历可能引起或诱发心脏纤维化的医疗程序(如手术)的受试者。
实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐可以在单次施用时全身施用，如以单次快速浓注的形式施用。这一推注剂量可以相当快速地注射给患者，但是随着时间推移适宜输注，使得硫酸葡聚糖溶液在几分钟的时间内输注给患者，例如5至10分钟或更长时间。
或者，实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐可以在治疗期间以多个(即至少两个)时刻全身施用。因此，实施方案的硫酸葡聚糖可以每天一次或多次，每周一次或多次，每月一次或多次全身施用，作为说明性实例。
在一个具体实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐被配制用于一周多次(如2-5次，优选3次)，持续连续多周(如连续至少2-5，优选连续至少3周)的全身施用。
在一个实施方案中，可以在引起受试者的有害纤维化的事件或病况之后尽可能快地，如在上述缺血事件或心脏梗塞之后尽可能快地开始硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的全身施用。或者，全身施用可以在引起有害纤维化的事件或病况之后的时间段开始。这样延迟全身施用的原因是纤维化过程通常在引起纤维化的事件或病况后需要一段时间。例如，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的全身施用可以在引起受试者的有害纤维化的事件或病况后的第一周或一周内开始。
在一个实施方案中，受试者是哺乳动物受试者，优选灵长类动物，更优选人类受试者。尽管实施方案特别涉及治疗、抑制或预防人类受试者的心脏纤维化，但是实施方案也可以或替代地用于兽医应用。动物受试者的非限制性实例包括灵长类动物、猫、狗、猪、马、小鼠、大鼠。
在一个实施方案中，受试者患有引起心脏纤维化的疾病、病况或病症，特别是不利的、有害的或损伤性纤维化。这种不利的、有害的或损伤性纤维化引起受影响的器官或组织的正常结构的破坏，最终导致其功能障碍和衰竭。这意味着不利的、有害的或损伤性纤维化是纤维组织过量沉积的病理状态或病理性纤维化，其将对发生纤维化的器官或组织具有负面和有害作用。
因此，在一个实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐用于治疗、抑制或预防导致器官或组织中的功能障碍的受试者的心脏或心脏组织中纤维组织过量沉积的病理性纤维化。
在一个具体实施方案中，引起纤维化的疾病、病况或病症选自由以下各项组成的组：心内膜心肌纤维化、心肌梗塞后纤维化或心房纤维化。
因此，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐用于治疗、抑制或预防任何上述疾病、病况或病症的纤维化成分。因此，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐本身并不一定治疗、抑制或预防疾病、病况或病症，而是减少纤维化过程并由此减少由疾病、病况或病症导致的纤维化组织的量。
在一个实施方案中，施用配制用于全身施用的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐治疗、抑制或预防患有心脏纤维化的受试者的心脏纤维化。
细胞外基质(纤维结缔组织)的病理累积是糖尿病患者和非糖尿病患者心脏衰竭(chf)的关键因素，导致心室壁逐渐变硬并丧失心脏收缩性。心脏衰竭是全球性的健康问题，最常见于早先有心肌梗塞(mi)的患者。由于纤维化，在梗塞心肌和非梗塞心肌中所见的心脏重塑被认为是出现心室功能受损的主要决定因素，从而导致预后不良。
因此，纤维化可以例如心内膜心肌纤维化、心肌梗塞后纤维化或心房纤维化的形式出现在心脏(心脏纤维化)中。纤维化通常在心肌缺血部位发生，这在心脏壁硬化、收缩性丧失和心脏重塑方面可能具有严重和负面的后果。
在一个实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐用于治疗、抑制或预防患有心肌梗塞或心脏中另一种局部缺血症状(例如心肌缺血)的受试者的心脏纤维化。
在一个具体实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐用于治疗、抑制或预防受试者心脏梗塞区域的间质性纤维化。
如本文所示的实验数据显示硫酸葡聚糖在心肌梗塞模型中具有抗纤维化作用。硫酸葡聚糖使得心脏纤维化显著减少，并且特别是在测试受试者的梗塞区域中显著减少间质纤维化。
还可能发生与受试者心脏或心脏组织移植有关的纤维化。因此，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐可以全身施用于将要经受或最近已经受心脏或心脏组织移植的受试者。这种移植的心脏组织的非限制性实例包括心脏瓣膜等。
硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐还可以全身施用于与受试者的心脏中或与受试者的心脏相关联地植入如起搏器、支架、假体的医疗装置相关的受试者。因此，植入医疗装置后也可能发生病理性心脏纤维化。
实施方案的另一个方面涉及硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的用途，其用于制造配制用于全身施用以治疗、抑制或预防受试者心脏纤维化的药物。
实施方案的另一方面涉及治疗、抑制或预防受试者心脏纤维化的方法。所述方法包含向受试者全身施用硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐。
实验
心肌梗塞模型中硫酸葡聚糖的抗纤维化作用的评价
本研究评估了硫酸葡聚糖在心肌梗塞(mi)的大鼠模型中抑制或减少纤维化的作用。
材料和方法
大鼠心肌梗塞模型包括左冠状动脉通过壁内缝合永久结扎。手术造成血流阻塞，继而导致严重的缺血性损伤和心壁梗塞。
在研究开始时(第0天)，从以色列harlan实验室获得总共120只平均体重为178g的雌性sd大鼠。动物随意喂食市售啮齿动物饲料(tekladcertifiedglobal18％蛋白质饲料)。动物可以自由饮用从市政供应获得的高压灭菌和酸化饮用水(ph值在2.5和3.5之间)。将动物饲养在标准的实验室条件下，具有足够新鲜空气供应(最少15次换气/小时)的空气调节和过滤(hepaf6/6)。将动物保持在气候受控的环境中，温度范围为20-24℃，rh范围为30-70％，12小时光照和12小时黑暗循环。
将平均分子量在5-7kda范围内的硫酸葡聚糖溶解在0.9％nacl(生理盐水)(梯瓦制药工业有限公司(tevapharmaceuticalindustriesltd))中，以15mg/kg或3mg/kg的剂量皮下注射。
在手术当天，将动物用90mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪的组合麻醉，并对动物进行插管和机械通气。为了诱导mi，在麻醉下，通过左侧开胸手术打开大鼠胸部，取出心包，并通过壁内缝合永久性阻塞左冠状动脉近端(《循环(circulation)》2008,117:1388-1396)。手术后两小时，所有处理组中的每只动物根据表1皮下注射硫酸葡聚糖或生理盐水媒剂。
表1–组分配
在mi诱导后的第36天，通过co2吸入处死大鼠并收集心脏再将其固定在缓冲的福尔马林溶液中。使用标准组织学程序进行常规石蜡包埋。
使用马森三色染色(masson’strichrome)进行纤维化评估。将心脏横向切成5块石蜡包埋的切片。在lika切片机上进行5μm的5个石蜡切片。所有切片根据标准马森三色方案染色。胶原纤维染成蓝色，细胞核染成黑色，背景染成红色。在计算机成像系统中观察切片并使用imagej程序标记和计算梗塞面积。对于每只动物，分析包括一个含有结扎的五个连续切片，并将每个心脏的所有切片的平均值作为一个值进行统计学分析。
通过两因素方差分析对重复测量进行统计学分析，随后进行邦弗朗尼事后检验。
心脏纤维化分析的结果
在通过马森三色染色染色的心脏切片中手动估算梗塞边缘区域的间质性纤维化。以左心室总面积的百分比形式计算间质性纤维化面积。对于每只大鼠，分析五个横截面。梗塞边缘区的间质性纤维化程度如图1所示。
与对照媒剂处理组1m(22.7±1.9％)相比，硫酸葡聚糖处理组2m的间质性纤维化程度显著降低(11.9±0.9％)。其它硫酸葡聚糖处理组3m-5m的间质性纤维化程度也降低，但差异不显著。
硫酸葡聚糖的作用似乎主要是在mi后出现纤维化的时期。因此，包含在3周期间用硫酸葡聚糖处理的处理组2m显著减少了纤维化，而在其它组(3m-5m)中较短处理的效果不太明显。这似乎与心肌梗塞大鼠模型中纤维化的发病机理一致(《美国病理学杂志(americanjournalofpathology)》1995,147(2):325-338)。这篇文章公开了梗塞心脏组织中的纤维化过程与皮肤伤口中的纤维化和心脏的非梗塞区域受到不同地调节。
图2a-2d是来自1m组的两只动物(图2a和2b)和来自2m组的两只动物(图2c和2d)的纤维化等级的图片。染成蓝色的纤维化区域在图中用箭头指示。
结果借此表明，与媒剂对照处理组相比，硫酸葡聚糖处理在梗塞后五周显著减少了纤维化。因此，硫酸葡聚糖能够减少心肌梗塞后的纤维形成。
上述实施方案应被理解为本发明的一些说明性实例。本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以对实施方案进行各种修改、组合和改变。具体而言，在技术上可能的情况下，不同实施方案中的不同部分解决方案可以其它配置进行组合。然而，本发明的范围由所附权利要求限定。