本发明涉及瘤内调节疗法。更具体地，本发明涉及通过原位递送电刺激来治疗肿瘤及癌症。
发明背景
胶质母细胞瘤（glioblastoma，gbm）是成年人中最常见的原发性脑肿瘤，其具有浸润多个脑叶、脑深部核以及跨越脑中线合缝的高侵袭性的细胞。护理的标准需要最大限度的安全切除，然后进行放化疗，并且提供了12-18个月的中位生存期（1）。当涉及脑语言区时，手术可能是受限制的或不是安全可行的，因此进一步降低了肿瘤控制和患者生存期的时限。已经测试了各种形式的电疗法针对系统性癌症的效力，在用于脑肿瘤（例如gbm）的有效的应用中做出的进展较少。例如，电穿孔递送短的高压脉冲串，其在细胞膜中产生纳米级的孔。这种影响促进化学治疗剂的摄入或导致代谢的不稳定和细胞死亡。在频率为1hz、强度为1000-1750v/cm以及脉冲宽度为0.1毫秒的4个至8个脉冲产生了显著的细胞毒性，并且增强了在体外的gbm细胞中对化学治疗的敏感性（2-4）。体内研究显示，在胶质瘤团块之内递送400v的脉冲串，并且与博来霉素结合，显著地延长了动物生存期（5）。不幸的是，电穿孔的极端刺激强度在其在人类gbm患者中的使用上造成了显著的限制，特别是当肿瘤是弥漫性的或在脑语言区时（6）。
交变电场（alternatingelectricfield，aef）的应用是另一种电疗法策略，其可以在各种癌症（包括gbm）中降低细胞增殖和活力。生物学作用是频率依赖性的，并且可以在10-1000khz之间的频率处获得抗癌症的效果，超过其则有使组织加热及热损伤的风险（7，8）。aef干预带电的细胞内分子，并且从而破坏纺锤体微管组织，导致细胞因子失效和膜破裂。在脑中的有丝分裂后（即非肿瘤的）的神经细胞较少受到影响，并且aef似乎赋予一定程度的肿瘤特异性。现在美国食品药品监督局（fda）批准了在患者的颅骨间递送200hz的低强度（1-2v/cm）aef的可携带的、电池供电的装置，用于具有复发性gbm的个体的治疗，该个体已经用尽手术和放射治疗。实施了iii期临床实验以比较复发性的gbm中的aef（n=116）与医生选择的化学治疗（n=113）（9）。使用绝缘电极阵列递送aef，所述绝缘电极阵列被连接至患者的已剃发的头皮并且通过多个电缆被连接至个体可以随身携带的可携带的发生器。皮肤病学的并发症（包括过敏或刺激性皮肤炎、机械性损伤、溃疡以及皮肤感染）是常见的（28）。治疗周期为4周的时长，并且推荐不间断的疗法，一天两次的1小时休息。在组之间在总生存期或无进展的生存期上没有差异，但是亚组分析表明，当控制组的治疗方案的依从性和完成度时，aef可以产生更好的预后（10）。更多的近期数据表明，当与tmz联合时，aef还可能延长无进展的生存期和总生存期（29）。在成功的aef应用中患者的依从性也可能存在显著的挑战，因为坚持治疗是提高的总生存期的主要预测指标，其中每天使用该装置超过18小时的患者与那些使用较少的患者相比显著地存活更久。aef没有半衰期，并且需要连续的应用来维持治疗的效果。对于依从性困难的原因尚未明确，但其可能与操作方面（例如需要已剃发的头皮、皮肤病学的并发症、长期的应用）以及使用外部治疗系统的羞耻感相关。这些外部应用的aef的治疗效力也可能受到不能符合电场尺寸来最大化刺激强度及避免脱靶损伤的限制。
深部脑刺激（deepbrainstimulation，dbs；100-300hz）常被用于治疗运动障碍（例如帕金森病）并且通过可植入的导线及发生器系统而被递送。该技术需要将多触点的导线的植入靶标脑区域，通过被容纳在胸部的皮下组织中的远程访问的脉冲发生器进行控制。在脑中的dbs的影响是复杂的，并且已经被广泛地研究。通常认为，这种干预用来在疾病影响的电路之内调节电化学通信，并且从而破坏病原的神经活动（11）。在大脑内的肿瘤中关于dbs-型的疗法的治疗潜力鲜为人知。
garcia等人(2011)描述了通过将细胞或组织暴露至电场来开始在细胞内的电穿孔。garcia等人体内递送500v-625v至犬类恶性胶质瘤（30）。
美国专利号6528315描述了使用1-600v/cm、1hz频率的电场体内将核酸转移进入细胞的方法。然而该专利文件没有教导这些电场可以用于杀死肿瘤细胞。
美国专利申请公开号20050222646描述了在癌症治疗中使用电疗法。该专利申请仅描述了直流电流的使用（参见实施例1、2、4和5）。即，美国专利申请公开号20050222646没有提供与交流电流或电场相关的任何参数。根据该专利申请，该方法涉及递送3至25伏特的直流电流来杀死细胞。仅通过电压限定的对细胞死亡的影响，将根据其他参数（频率、脉冲宽度、电流等）是高度可变的。该影响也将是高度地前后关联的，因为影响组织/电极电阻/阻抗的硬件和生物因素将减轻“电压”。该专利申请没有教导什么会普遍地起作用，特别是对于影响神经系统的肿瘤。
美国专利号6366808("808")描述了基于各种电压的使用的用于治疗实体肿瘤的可植入的电方法以及装置，来以特定的方法协助降低肿瘤大小。它描述了使用20mv-500mv和100mv至10v的直流电来杀死肿瘤细胞。'808没有公开交流电刺激的使用，并且其未提及频率。进一步地，'808教导了在1分钟的治疗和1个月的治疗之间的持续时间（即并非永久或长期持续的疗法），并且该装置的描述表明了硬件的机械严格性的需求因此低于例如起搏器装置。'808还教导了通过电能的来源来递送的电疗法还涉及1至10,000个电压脉冲的应用。特别是gbm对目前疗法是高度顽抗的，并且因此其需要准备好来递送更长期的治疗来优化缓解时间或获得治愈。'808没有提及关于频率，并且也没有教导关于频率。鉴于上述，'808没有教导或暗示癌症的长期治疗。
在脑/神经系统的肿瘤管理（包括gbm管理）中电疗法的使用有显著的潜力，然而上述的这些技术具有限制了临床适用性和/或效力的显著的缺点。
技术实现要素：
迫切地需要有效的策略来治疗神经系统的肿瘤，特别是高级别的胶质瘤，例如胶质母细胞瘤（gbm）。肿瘤和癌症细胞已知易受在电化学环境中的改变的伤害，但尚未开发用于神经系统的肿瘤的直接刺激技术。在一个实施方式中，本发明提供了有力的证据来支持称作瘤内调节疗法（intratumoralmodulationtherapy，imt）的新的治疗，其使用植入的电极并且提供优于现有疗法的独特优势，其包括直接病灶靶定，用于连续的、集中的治疗，还包括可调节的刺激设置，以最大化收益并减少副作用，以及包括低维护的、隐蔽的硬件，提高自我感知和生活质量。imt可以提供直接的抗癌效益，使得个性化的基因治疗的发展成为可能，并且增强了现有疗法的效果以改善对于患有gbm和其他系统性和神经系统肿瘤的患者的预后。本发明的imt用于长期的（即永久性）植入物，以在有需要的患者中提供长期地积极的疗法。本发明的imt范例被设计用于大于10,000个电压脉冲或周期的持续的治疗递送，包括大于每小时400,000个电压脉冲或周期，或甚至更大于每小时700,000个电压脉冲或周期。
在第一实施方式中，本发明提供了用于长期地治疗患者中的神经系统和系统性肿瘤的瘤内调节疗法（imt）方法，其包括：（a）将电极长期地植入怀疑具有肿瘤细胞的患者的部位附近或之内，例如该患者的肿瘤附近或之内、或者残余的肿瘤床附近或之内，该电极具有被连接至其的电导线；以及（b）生成连续的、交流的或脉冲的电刺激，并且通过该电导线将该电刺激施加至该部位附近或之内的电极，该连续的或脉冲的电刺激被施加在避免神经振荡同步化（neuralentrainment，亦称为神经振荡-外界节律同步化）或显著的不良神经学影响或显著的不良影响的频率或解剖学位置。
在第一实施方式的imt方法的一个实施方式中，以约0.1毫安（ma）至约4安（a）施加所述持续的、交流的或脉冲的电刺激。
在第一实施方式的imt方法的另一个实施方式中，以约2ma施加所述连续的、交流的或脉冲的电刺激。
在第一实施方式的imt方法的另一个实施方式中，所述方法涉及以500hz至500khz的频率施加约+/-1-10v的电压，或以500hz至500khz的频率施加1-10v的电压。如果所述电刺激被施加在避免神经振荡同步化或显著的不良的神经学影响的位置，则所述方法涉及以50hz至500khz的频率施加约+/-1-10v的电压，或以50hz至500khz的频率施加1-10v的电压。
在第一实施方式的imt方法的另一个实施方式中，所述方法涉及以500hz至500khz的频率施加约+/-1-10v的电压，或以高于10hz至500khz的频率施加1-10v的电压。
在第一实施方式的imt方法的另一个实施方式中，所述方法涉及以500hz或以上施加1-10v。
在第一实施方式的imt方法的另一个实施方式中，所述方法涉及以200khz的频率施加约+/-1-2v的电压。
在第一实施方式的imt方法的另一个实施方式中，所述方法涉及以频率为130hz的方波施加约4v的电压。
在第一实施方式的imt方法的另一个实施方式中，以超过10khz的频率施加连续的或脉冲的电刺激。
在第一实施方式的imt方法的另一个实施方式中，所述电刺激是脉冲的电流，并且所述方法涉及施加脉冲宽度小于100μs的电压脉冲。
在第一实施方式的imt方法的另一个实施方式中，所述电刺激是脉冲的电流，并且所述方法涉及施加超过10,000个电压脉冲。
在第一实施方式的imt方法的另一个实施方式中，步骤（a）包含：将单个电极长期地植入所述肿瘤或所述部位之内，并且植入瘤外电极。
在第一实施方式的imt方法的另一个实施方式中，将所述瘤外电极植入患者的帽状腱膜下（subgaleal）或硬膜下（subdural）空间中。
在第一实施方式的imt方法的另一个实施方式中，步骤（a）包含：将多个电极（即超过一个电极）长期地植入所述肿瘤或所述部位之内或所述肿瘤或所述部位周围。
在第一实施方式的imt方法的另一个实施方式中，所述方法进一步包含将遗传物质递送至所述肿瘤。在一个方面中，所述遗传物质与一个或多个基因的表达相关。在另一个方面中，所述遗传物质与以下中的一个或多个的抑制相关：基因表达和/或基因功能、细胞增殖、细胞迁移、抗凋亡机制、辐射抗性和药物抗性。在另一个方面中，所述遗传物质是sirna或mirna。
在根据前述的imt方法的实施方式中的任一个的一个实施方式中，所述方法包含用治疗剂（例如化学治疗）和/或辐射治疗患者。在此实施方式的一个方面中，该治疗剂是替莫唑胺（temozolomide）。
在根据前述的imt方法的实施方式中的任一个的一个实施方式中，所述肿瘤是神经的或躯体的（somatic）系统组织的胶质或非胶质肿瘤。
在第二实施方式中，本发明提供了将遗传物质转移至或促进遗传物质转移至肿瘤或癌症细胞的方法，该方法包括：（a）将至少一个电极置于该肿瘤或癌症细胞附近，该至少一个电极具有连接至其的电导线；（b）生成电刺激，并且通过该电导线将该刺激施加至该肿瘤或癌症细胞附近的该电极；以及（c）将遗传物质递送至经该电刺激处理的该肿瘤或癌症细胞，从而促进被递送的遗传物质转移至该肿瘤或癌症细胞。在此实施方式的一个方面中，可以将该电极长期地置于该肿瘤细胞或癌症细胞附近。在此方法的一个方面中，该方法是体内或体外的。在此实施方式的一个方面中，该电刺激被施加在避免神经振荡同步化或显著的不良的神经学影响的频率或解剖学位置。
在第三实施方式中，本发明提供了在患者中治疗肿瘤或癌症的方法，其包括：（a）将至少一个电极植入肿瘤或疑似具有肿瘤或癌症细胞的患者的部位附近或之内，该至少一个电极具有连接至其的电导线；（b）生成电刺激，并且通过该电导线将该电刺激施加至该肿瘤或该部位附近的电极；以及（c）在该电刺激期间，将与以下中的一个或多个的抑制相关的遗传物质递送至该肿瘤或该部位：基因表达、基因功能、细胞增殖、细胞迁移、抗凋亡机制、辐射抗性和药物抗性，其中电刺激和遗传物质的组合对于肿瘤治疗的协同效应实质上大于单独采用电刺激和遗传物质每一个的效果。在此实施方式的一个方面中，该电刺激被施加在避免神经振荡同步化或显著的不良的神经学影响的频率或解剖学位置。
在所述第二和第三实施方式的一个实施方式中，所述电刺激是连续的交流电流、连续的交流电场、脉冲的电流或脉冲的电场。
在所述第二和第三实施方式的另一个实施方式中，以约0.1毫安（ma）至约4安（a）施加所述电刺激。
在所述第二和第三实施方式的另一个实施方式中，以约2ma施加所述电刺激。
在所述第二和第三实施方式的另一个实施方式中，所述方法涉以50hz至500khz的频率施加约1-10v的电压，或以50hz至500khz的频率施加约+/-1-10v的电压。
在所述第二和第三实施方式的imt方法的另一个实施方式中，所述方法涉及以50hz至500khz的频率施加约+/-1-10v的电压，或以超过10khz至500khz的频率施加1-10v的电压。
在所述第二和第三实施方式的imt方法的另一个实施方式中，所述方法涉及以50-200hz施加1-10v。
在所述第二和第三实施方式的另一个实施方式中，所述方法涉及以200khz的频率施加约+/-1-2v的电压。
在所述第二和第三实施方式的另一个实施方式中，所述方法涉及以130hz的频率施加约4v的电压。
在所述第二和第三实施方式的另一个实施方式中，以超过10khz的频率施加所述电刺激。
在所述第二和第三实施方式的另一个实施方式中，所述刺激是脉冲的电磁刺激，并且所述方法涉及施加脉冲宽度小于100μs的电压脉冲。
在所述第二和第三实施方式的另一个实施方式中，所述刺激是脉冲刺激，并且所述方法涉及施加超过10,000个电压脉冲或周期。
在所述第二实施方式的另一个实施方式中，步骤（a）包含：将单个电极植入肿瘤中、或肿瘤或肿瘤床或预期的肿瘤涉及的具有肿瘤细胞的区域周围，并且植入瘤外电极。
在所述第二实施方式的另一个实施方式中，步骤（a）包含：将多个电极植入肿瘤中、或肿瘤、肿瘤床或预期的肿瘤涉及的区域周围。
在所述第二和第三实施方式的另一实施方式中，所述遗传物质与一个或多个基因的表达相关。在一个方面，所述遗传物质与以下中的的一个或多个的抑制相关：基因表达和/或基因功能、细胞增殖、抗凋亡机制、辐射抗性和药物抗性。
在所述第二和第三实施方式的另一实施方式中，所述遗传物质是sirna或mirna。
在所述第二和第三实施方式的另一实施方式中，所述方法进一步包含：用治疗剂（包括化学疗法）和/或辐射治疗该患者。在此实施方式的一个方面，所述治疗剂是替莫唑胺。
在所述第二和第三实施方式的另一实施方式中，所述肿瘤或癌症细胞是神经或躯体的肿瘤或癌症细胞的胶质或非胶质细胞。
在所述第二和第三实施方式的另一实施方式中，在步骤（a）之前，所述方法包含：提供装置，所述装置包括至少一个电极，以递送所述电刺激，所述装置还包括一个或多个参比电极，其被植入递送所述电刺激的所述至少一个电极附近。在此实施方式的一个方面，所述装置进一步包括套管，通过其递送所述遗传物质或治疗剂。
在本发明的另一个实施方式中，怀疑具有肿瘤或癌症细胞的所述部位包括残余的肿瘤床。
在本发明的另一个实施方式中，所述肿瘤或肿瘤细胞是影响神经或躯体肿瘤细胞的胶质或非胶质的肿瘤细胞。
在本发明的另一个实施方式中，用于在患者中治疗肿瘤或癌症的方法，包括：（a）将至少一个电极植入肿瘤或怀疑具有肿瘤或癌症细胞的患者的部位附近或之内，该至少一个电极具有连接至其的电导线；（b）生成连续的交替的或脉冲的电刺激，并且通过该电导线将该电刺激施加至该肿瘤或该部位附近或之内的该至少一个电极；以及（c）在电刺激期间，用治疗剂、辐射、或同时用治疗剂和辐射治疗患者，其中该电刺激与该治疗剂、辐射、或同时用的治疗剂和辐射的组合对于肿瘤治疗的协同效应实质上大于单独采用该电刺激、治疗剂、辐射、或同时用的治疗剂和辐射每一个的效果。
在另一个实施方式中，本发明是可植入的装置，其包括：（a）中空管，其容纳递送生物材料的套管；（b）递送电刺激的电极；以及（c）参比电极。
在另一个实施方式中，本发明是可植入的装置，其包括：（a）递送电刺激的电极，以及（b）参比电极。
在另一个实施方式中，本发明是可植入的装置，其包括：（a）中空管，其容纳递送生物材料的套管；（b）递送电刺激的电极；（c）参比电极；（d）刺激发生器；以及（e）必要的连接线路和硬件。
在另一个实施方式中，本发明是可植入的装置，其包括：（a）递送电刺激的电极，（b）参比电极，（c）刺激发生器，以及（d）必要的连接线路和硬件。
在另一个实施方式中，本发明涉及电刺激联合遗传物质、治疗剂、或遗传物质和治疗剂在肿瘤的治疗中的协同使用。在本发明的一个方面中，所述协同使用包括在第一、第二及第三实施方式中描述的参数，包括：（a）其中所述电刺激是连续的交流电或脉冲电，（b）其中以约0.1毫安（ma）至约4安（a）施加所述电刺激，（c）其中以约2ma施加所述电刺激，（d）其中所述方法涉及以50hz至500khz的频率施加约1-10v的电压或以50hz至500khz的频率施加约+/-1-10v的电压或以50-200hz施加1-10v的电压，（e）其中所述方法涉及以200hz的频率施加约+/-1-2v电压，（f）其中所述方法涉及以130hz的频率施加约4v的电压，（g）其中以超过10khz的频率施加所述电刺激，（h）其中所述电刺激是脉冲电并且所述方法涉及施加脉冲宽度小于100μs的电压脉冲，（i）其中所述电刺激是脉冲电并且该方法涉及施加超过10,000个电压脉冲，（j）其中所述遗传物质与以下中的一个或多个的抑制相关：基因表达、基因功能、细胞增殖、细胞迁移、抗凋亡机制、辐射抗性和药物抗性，（k）其中所述遗传物质是sirna或mirna，（l）其中所述应用进一步包含使用治疗剂，（m）其中所述治疗剂是替莫唑胺，（n）其中所述肿瘤或肿瘤细胞是影响神经或躯体肿瘤细胞的胶质或非胶质的肿瘤细胞。
在前述的实施方式中的任一个的另一个实施方式中，所述电极是绝缘的。
附图说明
以下附图阐明了本发明的各个方面以及优选的和替代的实施方式。
图1.体外imt模型。小图a：体外imt模型的示意图。小图b和c：用96小时的假条件（小图b）或imt（小图c）处理并且用膜不透性染料（台盼蓝）染色的患者的gbm原代细胞的明场显微镜学（x20）照片。还使用光谱mtt（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴盐（蓝色）染料）分析评价细胞活性，如小图d（假处理细胞）和e（imt处理细胞）的细胞培养物图像所示。小图f：柱状图示出了用假条件或imt处理24小时或96小时的3名患者的原代gbm细胞制品中的平均细胞活力（平均值+标准偏差）。（星号；p<0.05）。
图2.示出了假处理（小图a）或用imt处理3天（小图b）并且在暴露至台酚蓝活性染料后用明场显微镜（x20）成像的胚胎大鼠神经元培养物的照片。小图c为柱状图，其示出了通过mtt分光光度试验测量的每一组中的相对活力。
图3.imt介导的凋亡与gbm细胞中半胱天冬酶-3的激活（裂解的半胱天冬酶-3）相关。小图a和b：用激活的半胱天冬酶-3（染红色）进行免疫标记并且用细胞核染料dapi（染蓝色）进行复染的假（a）处理和imt-处理（b）的患者gbm原代细胞的共聚焦成像（x63放大）。图c是代表性的免疫印记，其显示确认了免疫组化数据。
图4.a-d：代表性的流式分析散点图，其示出了在所示的处理的72小时后，凋亡和死亡的患者gbm细胞分别的膜联蛋白和碘化丙啶（pi）标记。对每个处理条件分析了约30,000个细胞。注意到相比于用假处理或单独处理观察到的凋亡细胞和死亡细胞，使用imt和tmz的联合产生的凋亡细胞（膜联蛋白-阳性）和死细胞（膜联蛋白和pi-阳性）的部分明显升高。使用来自3名不同患者的原代gbm细胞重复三次这些研究。在用pi和膜联蛋白标记的gbm流式分析中的imt和tmz联合的潜在的抗肿瘤效果显示，相比于假条件（左上图a）、或单独用imt（左下图c）或tmz（右上图b）处理，使用imt+tmz联合疗法（右下方图d）导致死亡的gbm细胞或凋亡gbm细胞（分别在右上和右下象限）明显升高。
图5.小图a：流式分析数据的柱状图，示出了在所示的处理后活的细胞以及凋亡/死亡的gbm细胞的百分比。单个星号表明在所有组之内的活的细胞和凋亡/死的细胞的百分比的显著性差异(p<0.05,anova)。两个星号表明在活或凋亡/死的部分与从未处理的细胞获取各个值之间的显著差异(p<0.05,anova)。小图b：测量了在对照、单个tmz或imt制剂以及共存的imt和tmz处理后的gbm细胞活性的mtt（替莫唑胺）试验的柱状图。相对于未处理的细胞将相对值进行标准化。单个星号表明了与假处理的值有显著差异。两个星号表明了所示的治疗组之间有显著差异(p<0.05,anova)。对于流式分析和mtt研究两者，处理的持续时间是72小时，并且所示的每一个测量都代表了对于来自3个患者的原代gbm细胞的平均值+标准偏差。
图6.小图a：使用源于手术肿瘤标本的原代gbm细胞的代表性的免疫印迹。小图b和c代表了在来自3个患者的gbm细胞中hsp27（小图b）和hsp90（小图c）水平的平均光密度值。所示的值代表了平均值+标准偏差。单个星号表明了与在假条件下测量的蛋白质表达相比有显著差异；两个星号表明在所示的处理组之间的蛋白表达中有显著性差异(p<0.05,anova).。od，光密度。
图7.柱状图示出了在胶质母细胞瘤（gbm）中热休克蛋白27（hsp27）基因沉默的瘤内调节治疗（imt）增强的杀肿瘤的作用。imt佐剂增强了在患者gbm细胞中的靶定hsp27敲除的抗肿瘤作用。个体的测量示出了在所示的处理48小时后的正常的mtt活力。单独的imt就产生了gbm活力的明显的损失，使用hsp27-特异性的sirna而非对照sirna使其强烈增强。显著性差异：*与假处理组相比，**在所示的处理组之间(p<0.05,anova)。使用来自三个不同患者中的原代gbm细胞重复三次评估样品，并且由平均值±标准偏差表示。tr，转染试剂。
图8.小图a-d是gbm培养物的照片，a：假处理，b：imt，c：tmz以及d：imt+tmz。替莫唑胺（tmz）与imt一起增强了gbm细胞死亡。
图9.a：在假条件下的gbm培养物的照片；b：在imt处理下的gbm培养物的照片；c：示出了定量tunel细胞的柱状图。使用假条件（a）很少见到tunel-阳性的gbm细胞，但在使用imt（b）后却有很多。
图10.a：动物在其居住笼内接受imt的照片。使用波形发生器（图片顶部）递送该疗法，该波形发生器通过换向器被连接至留置的脑电极，其始终允许动物自由运动。b：套管电极构造的照片。c：小图a的动物的更近的照片。
图11.a-b：容纳有在纹状体中的双侧gbm肿瘤的被摘除的大鼠脑部的照片。imt植入物已经被双侧地放置（现已移除）但仅在右侧被激活。注意到imt介导的右侧半球体积与左侧相比减少。小图b示出了图b的同一大脑，其具有用于尺寸校准的覆盖网格。
图12.a：被转导以稳定地表达萤火虫荧光素酶的、被植入费舍尔（fischer）大鼠的纹状体的f98gbm细胞的体内生物发光成像（bli）。b：通过小图a的大鼠的肿瘤（箭头）的嘴部（顶部）至尾部的苏木精染色的脑切片。这些数据是在植入含有40,000个f98gbm细胞的2μldmem的纹状体沉积物之后4天获得的，并且证明在这个模型中产生的侵袭性肿瘤形成。
图13.a：在费舍尔大鼠中通过纹状体f98gbm肿瘤（箭头）的苏木精染色的脑切片的照片，以及在处死和取脑之前获得的肿瘤（箭头）的相应的冠状（b）、轴向（c）和矢状（d）t2加权mr图像。
图14.用假条件（即不刺激）或imt处理7日（200khz,+/-2v）的成年费舍尔大鼠的脑部图像。小图a和b示出了在所示的处理后不同的11日龄肿瘤。小图a中的肿瘤使用绝缘的电极进行处理，该电极不发射电流而是建立局部的电场。小图b中的肿瘤用未绝缘的电极进行处理，以递送电流至gbm。小图c：具有植入的双侧imt构建体但没有肿瘤细胞的对照动物的大脑的图像。星号表示所有假手术组织和处理组织中的硬件缺陷。imt对正常脑组织产生没有明显的损伤。imt似乎选择性地靶定正在分裂的肿瘤细胞（dividingneoplasticcell）。小图b中的比例尺也适用于小图a和c。
图15.图a-d：在另外四只费舍尔大鼠中通过双侧gbm肿瘤的脑切片图像。在两侧上植入imt硬件，但仅在箭头所示的一侧上激活。在这些动物中imt处理的肿瘤明显地小于在假处理的对照中的肿瘤。
图16.在费舍尔大鼠纹状体中植入体内f98gbm模型电极，并且gbm肿瘤在两侧生长。a：大鼠的纹状体的左侧是假手术组（即没有刺激）。b：在大鼠纹状体的右侧上的imt处理。c：在假手术侧（没有看见红色染色）半胱天冬酶-3激活（染红色）。d：在imt-处理的肿瘤侧半胱天冬酶-3激活（染红色）。e：ct定位图像示出了具有在f98gbm肿瘤中的单侧电极的另一只大鼠准备放射治疗。f：可以与imt组合使用以治疗gbm肿瘤的放射剂量计划的图像。
图17.imt增强了在患者的gbm细胞中的sirna摄取。a-d：示出了在不存在imt（a，c）和存在imt（b，d）的情况下使用常规脂质基的方法48小时、荧光标记sirna转染的共聚焦图像。注意到同时接受imt的gbm细胞中sirna信号显著增加。下面的图示出了上面的各个图像，其具有dapi核染色覆盖。
图18.imt增强了在患者gbm细胞中的靶定的基因沉默。来自3个患者的肿瘤的原代gbm细胞（gbm1、gbm2和gbm3）的免疫印迹分析。在原代gbm细胞中hsp27sirna48小时的转染生成了适度的靶向敲除，同时使用的imt将其明显地增强。使用与或不与imt一起进行的对照sirna没有观察到在hsp27中的降低，并且使用任何所述处理都没有改变非-靶定hsp90表达（未示出），表明了imt-sirna处理的靶向特异性。
图19.imt提高了在gbm细胞中的不能渗透细胞的物质的摄取。在含有膜不通透性染料碘化丙啶（pi，红色荧光）的培养基中活的患者gbm细胞的时间推移视频荧光图像。
图20.用各种对照处理（小图a-e和g）、hsp27sirna处理（小图h）、仅imt处理（小图f）或联合hsp27sirna/imt疗法（小图i）的源于患者的gbm细胞培养物的图像。用蓝色活性染料mtt对细胞进行染色。
图21.图a：使用源于3个手术肿瘤标本的原代gbm细胞的代表性的免疫印迹分析。hsp27sirna转染生成了适当靶向敲除，同时使用的imt将其明显地增强。假条件、imt以及对照sirna在降低hsp27水平中是无效的。另一个促进肿瘤的hsp（hsp90）的水平不受靶定的hsp27和疗法的影响。图b和c：在来自3名患者的gbm细胞中的hsp27（b）和hsp90（c）的平均光密度值确认了强烈并且特异性的hsp27敲除，共同施用的imt将其显著地增强。任何处理条件都不明显地影响hsp90水平。所示的值代表了平均值+标准偏差。单个星号表明了与在假条件下测量的蛋白表达之间有显著性差异，两个星号表明了在所示的处理组之间在蛋白表达中有显著性差异(p<0.05,anova)。
图22.流式分析数据示出了在所示的处理后活的和凋亡/死亡的gbm细胞的百分比。在所有组内的活的细胞和凋亡/死亡的细胞的百分比之间有显著性差异(单个星号，anovap<0.05)。然而，注意到相比于其他组，tmz+imt组逆转了活的细胞和凋亡/死细胞的主要比例。两个星号表明在活的部分或凋亡/死亡部分与从未处理的细胞取得的代表值之间有显著性差异(p<0.05,anova)。每一个处理条件被重复分析四次，每次运行使用了约30,000个gbm细胞。治疗的持续时间为72小时，并且所示的每一次测量都代表了来自3名患者的原代gbm细胞的平均值+标准偏差。tmz，替莫唑胺。
图23.高频率（200khz）imt激活了在gbm细胞中的半胱天冬酶-3。如图所示为用假条件或imt（+/-2v,200khz）条件处理72h小时的源于患者的gbm细胞制品的免疫印迹研究。在imt期间完整的半胱天冬酶-3的水平明显地降低，并且对应于在激活（切割的）形式（诱导凋亡的标志）中的增加。
发明详述
定义
除非另有定义，否则本文所使用的的所有技术和科学的术语具有如本发明所属领域的普通技术人员中的一员通常理解的相同含义。同样，除非另有说明，否则除了在权利要求之内，“或”的使用包括“和”并且反之亦然。非限制的术语不被解释为限制，除非明确地说明或上下文中另有清楚地表明（例如，“包括”、“具有”、和“包含”通常表示“包括但不限于”）。在权利要求中包括的单数形式例如“一个”、“一种”和“所述”包括复数的指代，除非另有明确地说明。为了帮助理解和准备本发明，提供了以下的说明性的、非限制性的例子。
“有效量”指能够在被治疗的对象中产生医学上所期望的结果的组合物的量。可以单独地执行或与其他药物或疗法联合执行本发明的方法。
“对象”是指具有或可能发展肿瘤的人类或非人类哺乳动物。
术语“治疗”意为逆转、最小化、减轻、大体上抑制肿瘤的进程，或预防肿瘤的形成或复发。
概述
在肿瘤影响的脑部区域递送电刺激（包括交流电）的可植入的装置可以利用已知的gbm细胞的电敏性，同时提供用于对象患者的靶定的、持续的和可滴定的疗法。在脑内递送的电刺激要求脉冲设置符合临床神经调节策略（参见下文），而非高电压、细胞消融或电穿孔电流。在脑内递送的长期电刺激要求避免破坏正常的神经学功能或产生致残的神经学症状（例如疼痛、运动收缩、感觉改变等）。通过将治疗集中在肿瘤和本质上为病理性的神经系统的肿瘤影响的区域（中枢神经系统或外周神经系统），可以避免不良的神经学效应。此外，在神经振荡同步化的范围之外（例如>500hz）的刺激频率的使用，也将限制治疗诱导的副作用。当被应用至治疗肿瘤疾病时，本发明的方法被称为瘤内调节疗法或imt。imt在肿瘤（包括神经和躯体系统组织的肿瘤）的管理中是新颖的。本发明也可以用于防止肿瘤形成或复发。
本发明的imt方法可以包含各种构成、数量、尺寸及构形的绝缘的或非绝缘的刺激或参比电极的使用，以生成基于电压的、基于电流的或基于电场的imt参数。
方法
在一个实施方式中，本发明提供了在对象中治疗肿瘤的方法。该方法可以包括：将电极置于该肿瘤附近或之内，并且使用该电极递送电刺激至该肿瘤。在一个实施方式中，该刺激可以是连续的电流或脉冲的电流。也可以将该电极置于残余的肿瘤床（即手术地移除了肿瘤的部位）附近或之内，从而预防肿瘤复发。
imt可能需要将电极手术地置于目标肿瘤或残余的肿瘤床附近、邻近、或之内，所述肿瘤包括神经系统的肿瘤、或躯体系统组织肿瘤（例如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、黑素瘤、肝癌、结肠癌、胰腺癌等），通过远程访问的脉冲发生器进行控制，该脉冲发生器可以被容纳在胸部的皮下组织或它可以是外部的脉冲发生器（即非植入的）。该脉冲发生器可以生成连续的电流（包括交流电或直流电）或脉冲的电流。电流可以由幅度（伏特）、电流（安培）、频率（hz）以及脉冲宽度（微秒）进行表征。优选地，该脉冲发生器可以生成避免神经振荡同步化的频率。
典型的imt导线可以是绝缘的导线，其包含绝缘的或非绝缘的电极，其可以由铂/铱组成并且沿着该导线长度间隔数毫米。可以在目标肿瘤或区域中植入一条或多条导线，以提供原位低剂量的连续刺激；和/或在颅外组织平面中植入。该导线被连接至脉冲发生器（pulsegenerator，pg），其用作控制器和电源。该pg通常包括电池和用于与外部编程装置遥测通信的电路，该编程装置用于调节或“调谐”该imt导线的刺激参数，该参数可以包括刺激频率、幅度、脉冲宽度（或波长）、以及接触配置（即，从在导线上可用的电极中选择哪些电极进行使用，以及在两个或更多电极是有效的情况下，选择每一个的相对极性）。可以在植入手术期间初始地设置这些参数，并且然后可以在手术后在门诊诊所或在医生的办公室进一步微调，以将治疗的效益最大化并且将不需要的刺激诱导的副作用最小化。
在一个实施方式中，用于肿瘤的慢性治疗的imt系统可以包括脉冲发生器、治疗电极、参比电极以及将该治疗电极和该参比电极连接至该脉冲发生器的电导线。
该脉冲发生器可以是可植入的装置，其产生避免神经振荡同步化的频率，即500hz或更高的频率。如果将该可植入装置置于神经系统（外周和中枢）的不会易感于从治疗引起神经振荡同步化或引起不良症状的位置，则可以使用低于500hz的频率，例如50hz或以上，包括130hz和200hz。
在本发明的一个实施方式中，可以以约0.1毫安（ma）至约4安（a）施加所述连续的或脉冲的刺激，包括其间的任意的ma或a，例如0.2ma、0.3ma、0.4ma、0.5ma、0.6ma、0.7ma、0.8ma、0.9ma、1ma、1.5ma、2ma、2.5ma、3ma、3.5ma、4ma、4.5ma、5ma等以及1a、1.5a、2a、2.5a、3a、3.5a。因此，在另一个实施方式中，以约2ma施加所述脉冲的或连续的刺激。如果所述pg产生直流电流，则所述pg可以包括转换器或将直流电流转换为交流电流的装置。
可以以50hz至500hz频率、以约+/-1-10v、或其任意组合施加所述连续的交流电流或脉冲电流。例如，连续的交流电流可以是+/-1-2v、频率为200khz的正弦波，或者其可以是+/-4v、频率为130hz。该频率的范围也可以是超过10khz至500khz。
在本发明的一个实施方式中，所述pg产生脉冲电流，可以将其以约0.1毫安（ma）至约4安（a）施加，包括其间的任意ma或a，例如2ma。
优选地，在本发明的方法中使用的频率不会产生神经振荡-外界节律同步化。可以使用500hz或更高的频率以避免神经振荡-外界节律同步化。
可以以约1-10v、50hz至200khz的频率或其任意组合施加所述脉冲电流。例如，所述脉冲电流可以是1-2v、频率为200khz，或者它可以是4v、频率为130hz的方波。
所述imt方法可以涉及施加脉冲宽度小于100μs的电压脉冲。周期（在脉冲或脉冲间隔之间的间歇）可以小于1秒。在另一实施方式中，所述周期可以小于500毫秒。在另一个实施方式中，所述周期可以小于20毫秒。在另一实施方式中，对于高频率所述周期可以是5微秒，并且对于低频率imt其小于20毫秒。在低频率，所述周期可以小于10毫秒或小于8毫秒或小于7毫秒。应当理解的是，当所述周期小于比如10毫秒，则此周期包括在整数之间的任意范围，例如9.9、9.8、9.7、9.6、9.5、9.4、9.3、9.2、9.1、9、8.9、8.8等毫秒。
所述imt方法可以涉及施加超过10,000个电压脉冲。本发明所述imt可以用于永久植入，以在有需要的患者中提供长期有效的治疗。
imt可以诱导gbm细胞系（源于患者的gbm细胞以及在f98大鼠gbm肿瘤中的细胞）的半胱天冬酶的激活以及凋亡死亡。有丝分裂期后的神经元示出了使用imt没有显著的活性的损失，这与在增殖的肿瘤细胞上的选择性作用一致。imt还产生了gbm细胞对tmz化学疗法的急剧的敏化（图1-8）。在未基因筛选的标本中取得的治疗效果中没有较大差异，表明imt的机制独立于肿瘤分子图谱。
使用imt的电-基因（electro-gene）疗法
在另一个实施方式中，本发明提供了将遗传物质转移至肿瘤/癌症细胞的方法，所述方法可以包括：（a）将电极置于该肿瘤/癌症细胞附近，该电极具有被连接至其的电导线；（b）生成电刺激，并且通过该电导线将该刺激施加至该癌症细胞附近的该电极；以及（c）将遗传物质递送至用连续的交流或脉冲的电刺激处理的该肿瘤细胞。
所述电刺激可以是连续的电流或脉冲电流。
在本发明的一个实施方式中，可以以约0.1毫安（ma）至约4安（a）施加所述电流，包括在其间的任意的ma或a。因此，在另一个实施方式中，以大体上2ma施加所述电流。
可以以约+/-1-10v、50hz至200khz的频率或其任意组合施加连续的交流刺激。例如，连续的交流电流可以是+/-1-2v、频率为200khz的正弦波，或它可以是+/-4v、频率为130hz。
可以以约1-10v、50hz至200khz的频率或其任意组合施加直流电流或脉冲电流。例如，该电流可以是1-2v、频率为200khz，或者它可以是4v、频率为130hz的方波。另一个例子可以施加1-10v、50-200hz。另一个例子可以施加超过10khz至200khz的频率。
所述方法可以涉及施加脉冲宽度小于100μs的脉冲电压。所述方法涉及施加超过10,000个电压脉冲。
对于大多数新确定的gbm的分子靶标难以获得特异性的抑制剂，然而，小干扰rna（sirna）对于减少特异性的基因的表达是高度有效的并且提供显著的临床前景。不幸地，较差的细胞摄取仍然是对实践应用的障碍，因为这些分子不能轻易穿过细胞膜（12）。基于脂质的载体可能是有问题的，由于核内体易受免疫刺激的影响，其效能和摄取会发生变化。电场已经被使用了数十年来增强进入肿瘤细胞的大分子或带电分子的摄取。长的持续时间/低强度的脉冲驱动带电分子穿过细胞膜的迁移（即电泳），而短的持续时间/高强度刺激产生了亲水的孔，带电物质可以通过该孔（即电穿孔）(13,14)。在gbm中的imt-型刺激既没有描述电泳也没有描述电穿孔。由于热休克蛋白hsp27在癌症细胞增殖、迁移、抗凋亡机制及药物抗性上的作用，所以选择热休克蛋白hsp27作为原型的靶标用于imt-相关的研究(15-17)。其他的热休克蛋白也涉及肿瘤促进活性，包括治疗抵抗性机制(22,23)。正如许多这些蛋白质，已知没有选择性的天然或合成的蛋白质抑制剂，并且它们的表达或功能的靶向干扰需要基因沉默策略。在治疗抵抗性的gbm细胞系中，sirna介导的hsp27抑制降低了活力并且产生了强大放化疗敏感性(18-20)。相同的强大效果难以在源于患者的标本中实现。然而，通过同时的imt，在几乎每一个被暴露的细胞中的细胞质的sirna中实现了大幅度的增加（图9），并且这与hsp27蛋白水平的强大敲除及imt介导的gbm细胞死亡的增强作用相关（图10、11）。这些结果表明，imt有力地促进了治疗的遗传物质的摄取，以在患者的gbm细胞中产生特异性和强大的反应。
表1提供了可以用于实施本发明的示例性的（即非限制性的）具体参数和参数的范围，其用于本发明的imt方法或将遗传物质转移进细胞的方法。
表1
下面的具体实施例应被解释为仅仅是说明性的，而不以任何方式限制本发明的其余部分。在没有进一步的阐述的情况下，应当相信本领域的技术人员可以基于这里给出的描述充分利用本发明。所引用的所有出版物通过引用方式并入本文。下面指出的任何机制都不以任何方式限制本发明要求保护的范围。
实施例1-体外imt模型
1.材料和方法
gbm组织制备和细胞培养物
本研究由西安大略大学（universityofwesternontario）的研究伦理委员会同意(approval#17290)。在手术切除时获取gbm标本，并且立即将其放置入含有0.5%胎牛血清(fbs;lifetechnologies,burlington,on,canada)的磷酸盐缓冲生理盐水（pbs）中。冲洗、消化该组织，然后过滤通过100-μm细胞过滤器。然后将样品进行离心并且重悬在补充有10%fbs、1%非必需氨基酸和1%青霉素/链霉素(lifetechnologies)的dulbecco改良的eagle培养基(dmem;wisentbioproducts,st.bruno,pq,canada)中，然后铺板至35-mm平皿30min，以使血细胞分离。然后将上层细胞悬浮液转移至24孔板的新鲜地预包被有10μg/ml多聚-l-赖氨酸(trevigeninc.,gaithersburg,md,usa)的两个孔，然后在37°c、5%co2进行孵育。以接近80%的汇合度传代培养物，并且使用含有0.53mm乙二胺四乙酸(edta;wisent)的0.25%胰蛋白酶1:2分离培养物。一周更换两次培养基。使用来自第4代至12代的培养物的gbm细胞进行所有试验。
在37°c、5%co2的加湿的气氛中将人类ln229gbm细胞(atcc,manassas,va,usa)维持在补充有10%fbs、1%非必须氨基酸和1%青霉素/链霉素(lifetechnologies)的dmem中。使用0.25%胰蛋白酶-edta(wisent)每2-3天将该细胞传代。在对数生长期，在处理之前24h将细胞接种在6-孔板的35mm孔中的维持培养基中。
胚胎大鼠神经元培养物
此方案符合加拿大动物保护委员会的标准，并且被西安大略大学动物使用附属委员批准(approval#2014-016)。在原代神经元培养物（n=3）中执行imt，以测定它在有丝分裂后的神经细胞上的效果。由于原代人类神经元不易获得，在从胚胎大鼠脑部分离的制品进行这些研究。通过颈椎脱臼处死怀孕的雌性wistar大鼠(charlesriver,montreal,pq,canada)用于e18胚胎的手术移除。提取来自每个胚胎的皮质，并且置于含有1.8mlhank平衡盐溶液（hbss;wisent）的14ml的圆锥管中，然后在室温4000xg离心1min。吸出hbss，并加入1.8ml含有5mlhbss、6μlmgso4(1m)和2ml胰蛋白酶(sigmaaldrich,st.louis,mo,usa)的溶液a。将该管充分混合，确保神经元能够自由流动，并且在37°c将其置于自动旋转器中25分钟。在旋转后，将3.6ml的含有7mlhbss、8μlmgso4(1m)、175μldnasel(10mg/ml)和112μl胰蛋白酶抑制剂（100μg/ml;rochelifesciences,indianapolis,in,usa）的溶液b加入至圆锥管并且混合2分钟，在室温4000xg离心5min，在其后吸出hbss。最后，将6ml的含有20mlhbss、48μlmgso4(1m)、1.3mldnasel(10mg/ml)以及1ml胰蛋白酶抑制剂(100μg/ml)的溶液c加入至生成的细胞团块(roche)。将这些细胞转移至50mlfalcon管，然后加入另外6ml的溶液c。将细胞滴定、在4000xg离心5分钟，然后吸出上清液。将细胞团块重悬在36ml的含有96%的神经基础培养基(wisent)、2%b27补充物、0.8%n2补充物、0.5%青霉素/链霉素、0.25%谷氨酰胺(lifetechnologies)、以及0.1%两性霉素b溶液(sigmaaldrich)的神经基础平板培养基中。用血细胞计对细胞进行计数，以0.5x106个细胞/孔的密度铺板在包被有7%的多聚-l-鸟氨酸(sigmaaldrich)的35mm孔中，并且保持在37°c、5%co2的培养箱中。在培养的第三天更换培养基，然后为这些孔装配imt装置（参见下文）用于假条件或imt条件递送72h。
体外imt模型
体外imt模型是由申请人的实验室开发的，并且由标准刻度的35mm孔组成，该孔配有中央刺激电极和外周带状电极，以使用通常具有低压（<10v）和较宽范围的频率和波形的参数递送长期刺激。在此研究中使用的参数为4v、130hz以及2v、200hz。在一个模型中，使用放置在细胞场中央的1.3mm的阴极电极递送imt，在外周具有阳极电极（图1a）。电极由临床级铂或铂/铱合金组成，由波形发生器产生方波或正弦波并且持续地递送。已经测试了imt处理的各种持续时间，并且发现72小时对于培养的gbm细胞是可行并且有效的，并且将其应用至此研究的体外组分。imt实验与一系列对照条件平行运行。此工作证明了低频率或高频率参数的imt的强大肿瘤杀伤作用，以及当与tmz联合时治疗效果的明显的增强作用（图1-7）。
将gbm细胞（在2ml的维持dmem中的2x105个细胞）转移至在标准6孔板中的35mm孔，并且在处理前使gbm细胞能够生长至~70%的汇合度。临床级的铂基参比带状电极（ad-tech,racine,wl,usa）围绕外周，以及刺激电极(medtronicltd.,brampton,on,canada)在孔的中心。将电极连接至波形发生器组，以产生4伏特的单相、方波脉冲，脉冲宽度为90μsec、频率为130hz。此设置处于在用于运动障碍的症状（例如帕金森病）的临床神经调节治疗中通常使用的范围之内(11)。对照孔（即假处理）装有电极，但不递送电流。使用在24-96h之间的处理持续时间，以有足够时间可以用于抗肿瘤效果而避免一旦开始imt后更换培养基的需要。因此，贴壁和漂浮的所有完整的gbm细胞都有助于下述的活性测量。将用化疗处理的gbm细胞与含有替莫唑胺(50μμ，sigmaaldrich)的dmem铺板在装有imt装置的35mm孔中，并且接受72h的同时进行的imt或假条件。50μμ替莫唑胺浓度反映了与gbm治疗的辅助阶段中的150mg/m2的体内血浆浓度对应的临床上相关的水平（24）。
同时进行的imt和hsp27敲除
将原代人类患者gbm细胞（在2ml维持dmem中的1×105个细胞）接种进装备了imt系统的35mm孔，并且使其可以生长至~70%汇合度。使用jetprime™转染试剂(polyplustransfection,newyork,ny,usa)，使用靶定人类hsp27mrna的sirna(50nm)或相等浓度的非特异性的对照sirna(sirnauniversalnegativecontrol,sigmaaldrich)转染细胞(18)。用在2ml含有10%fbs的dmem中的210μljetprime-sirna复合物替换培养基。将被转染的细胞在37°c、5%co2中孵育48h。在imt-sirna条件下，在转染时开始imt并且维持整个48h，在其后评估靶定敲除的范围以及gbm的细胞活力。
细胞活力测试
使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑鎓（mtt）光谱分析(sigmaaldrich)评估细胞活力。该比色分析测量由线粒体琥珀酸脱氢酶引起的黄色mtt还原成不可溶的深紫色甲瓒（formosan）产物。在紧接着上述的gbm细胞处理后，加入mtt(80μl,5mg/ml)至35mm孔中，然后在37°c湿润的5%co2下孵育3小时。然后通过在室温加入600μl的二甲基亚砜15min，将细胞溶解以释放紫色的甲瓒产物。使用酶联免疫吸附测定平板读数器(fisherscientific,nepean,on,canada)测量吸光度。使用在570nm的光密度值评估细胞活力，在每一个孔中测定在655nm的参考值。
台酚蓝排除法被用作细胞活性的确认性、定性测量。简单来说，对每个1ml培养基加入0.1ml的0.4%台酚蓝溶液(lonza,walkersville,md,usa)，并且然后将细胞在室温下孵育2min。使用装有infinity1-3科学补充金属氧化半导体相机的moticae31倒置显微镜(lumeneracorp.,ottawa,on,canada)获得细胞明场图像。
流式细胞术
根据制造商的说明书，含碘化丙啶的膜联蛋白v凋亡检测试剂盒(pi;biolegend,sandiego,ca,usa)被用于测定凋亡细胞和死细胞。使用运行facsdiva软件的bectondickinsonlsriisorp流式细胞仪(bdbiosciences,mississauga,on,canada)分析细胞部分。细胞首先在前向散射（fsc-）对侧向散射（ssc-）特征上进行门控，然后使用连续门控fsc-区域对fsc-宽度和ssc-区域对ssc-宽度图表排除双重峰。然后用象限门计算膜联蛋白v+/pi-、膜联蛋白v+/pi+、膜联蛋白v-/pi+以及膜联蛋白v-/pi-的群体。每个样品以5,000个事件每秒的最大事件率获取约30,000个单细胞。使用flowjov9.6.3(treestar,inc.,ashland,or,usa)分析数据。
免疫印迹分析
在补充有sigmafast™蛋白酶抑制剂混合物(1:10)的裂解缓冲液(50mmtrishci,150mmnacl,1%nonidetp40,ph7.4)中收集细胞，在冰上孵育15分钟然后进行超声(sigmaaldrich)。将细胞裂解物离心，然后收集蛋白上清液。在10%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上分离20微克的每个蛋白提取物，并且将其电泳地转移至immun-blot®膜(bio-radlaboratoriesltd.,mississauga,on,canada)。将膜封闭，然后用初级抗体hsp27(1:1000),hsp90(1:800)、或激活的半胱天冬酶-3(1:500;emdmilliporecorp.,billerica,ma.,usa)在4°c孵育过夜。
将膜洗涤，然后用辣根过氧化物酶结合的次级抗体(1:3,000;bio-rad)在室温孵育1小时。使用增强的化学发光和探测系统成像仪(gehealthcarebiosciences,piscataway,nj,usa)使过氧化物酶活性可视化。然后使膜成条带状，封闭，用抗β-肌动蛋白抗体(1:5,000;abeaminc,toronto,on,canada)重新探测，以评估蛋白上样量。
激活的半胱天冬酶-3的免疫荧光标记及共聚焦显微分析
将gbm细胞铺板在12mm圆形载玻片上(vwrinternational,mississauga,on,canada)，然后在处理后24h进行收集。将细胞洗涤、固定在4%多聚甲醛中并将其渗透化，然后用1%的牛血清清蛋白(emdmilliporecorp.)封闭，并且用激活的半胱天冬酶-3的初级兔抗(1:100,emdmilliporecorp.)在4°c孵育过夜。然后将细胞洗涤，然后用alexafluor®546山羊抗兔igg次级抗体(1:200;lifetechnologies)室温孵育1h，并且用4'-6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi;lifetechnologies)复染以使细胞核可视化。不带初级抗体地并行处理对照的载玻片。使用具有zeiss63×na1.4油浸镜头的zeisslsm-510meta激光扫描显微镜、适合的滤光镜以及aim软件使细胞成像。
统计分析
使用student'st检验或单向方差分析（anova），然后分别进行newman-keuls事后分析，进行成对比较和多重比较(sigmastat,systatsoftwareinc.,sanjose,ca,usa)。所有数据都以平均值±标准差表示，在p<0.05时比较被认为是显著的。
2.结果
imt诱导gbm细胞死亡
用96小时的假条件（图1b）或imt（图1c）处理ln229gbm细胞和来自三个患者的原发性肿瘤的gbm细胞，然后用不可透过膜的染料台酚蓝进行染色。注意到相比于假条件（图1b），在imt处理的制品中细胞密度降低、大量的核固缩及台酚蓝摄取（图1c）。在假（图1d）和imt处理的（图1e）细胞中也使用光谱mtt试验评估了细胞活力。假培养物（图1d）用mtt染紫色，并且延伸到大部分的培养孔。相反，imt处理的制剂（图1e）展现了明显地减弱、散落的染色，与大量的gbm细胞死亡一致。图1f的柱状图示出了在用假条件或imt处理24小时或96小时的3个患者原代gbm细胞中的平均细胞活力（平均值+标准差）。注意到在两个时间点的用imt处理的活力显著减少（星号；p<0.05）。
相比于对gbm细胞的影响，在大鼠的有丝分裂后的神经元的形态学或活力中imt不产生明显的改变。用假条件（图2a）或imt（图2b）处理胚胎大鼠神经元培养物3天，然后在暴露至台酚蓝活力染料后用明场显微镜（x20）成像。在这些细胞中imt后没有识别出显著的标记或形态学改变。图2c的柱状图示出了通过光谱mtt实验测量的在每组中的相对活力（平均值+标准差）。对于imt发现神经元活力没有降低（相对的mtt值：假=0.63±0.00；imt=0.64±0.02；p=0.36；图2c）。
用imt处理的gbm细胞中的凋亡和增强的化疗效果
通过免疫标记激活的半胱天冬酶-3（一种凋亡标记物）以及流式细胞术测定凋亡和细胞死亡标记物（分别为膜联蛋白和pi），评估imt介导的gbm细胞死亡的机制。
imt稳定和强大地增加在永生化的和患者原代gbm细胞中的激活的半胱天冬酶-3的细胞水平，这与imt处理的gbm细胞的固缩的形态学以及凋亡死亡的指示一致（图3）。
在来自三个患者标本的原代gbm细胞上重复三次执行流式细胞术（对于每个患者标本每个处理条件~30,000个细胞），以测定凋亡标记物膜联蛋白以及不能透过膜的染料pi的摄取（图4和5a）。注意到在图4中相对于假处理或单独处理，使用imt与tmz联合的凋亡（膜联蛋白-阳性）细胞以及死(膜联蛋白及pi-阳性)细胞的部分明显升高。图4流式细胞术散点图示出了死细胞（右上象限）、凋亡细胞（右下象限）以及活细胞（左下象限）。图4的流式细胞术散点图显示，在假imt治疗（a）下5.4%的细胞是死的，2%是凋亡的以及92.1%是活的；在tmz（b）下，9.4%的细胞是死的，14.1%是凋亡的以及76.1%是活的；在imt（c）下21.2%的细胞是死的，23.3%是凋亡的及54.5%是活的；而在tmz+imt两者处理下（d），16%的细胞是死的，58%.3%是凋亡的以及25.2%是活的。凋亡（膜联蛋白+）和死(膜联蛋白+和pi+)gbm细胞显著地从未处理（5.7±2.5%）以及假条件（5.9±2.8%）上升至单一处理替莫唑胺(16.9±7.4%)或imt(28.5±14.9%)，以及最后上升至替莫唑胺和imt联合处理(52.4±21.8%)。定量代谢mtt试验的结果进一步确认了每个处理方法的有害后果以及在降低原代gbm细胞活力上imt与替莫唑胺联合的提高益处（图5b）。作为单独处理，通过mtt代谢测量，imt(相对于未处理的细胞的活力为52.2±4.8%)比替莫唑胺(69.7±11.8%活力)显著地更有效。与单独处理相比，imt与替莫唑胺联合产生了进一步显著的gbm细胞死亡(29.1±3.2%活力；图5b)。在永生化的ln229gbm细胞中产生了可比较的效果（数据未示出）。
imt增强了在gbm中sirna-介导的基因敲除的效力
通过疏水的遗传物质穿过脂质膜的较差的摄取，阻碍了在原代的患者来源的gbm细胞中的基因沉默方法。此研究测试了imt是否可以与hsp27sirna协同起作用，以增强在细胞中sirna的摄取和生物利用度或通过损害细胞质分裂和抗凋亡机制的第二种方式。在此例子中，选择促肿瘤的分子伴侣hsp27作为治疗的靶标。hsp27sirna转染产生了适度的靶向敲除，同时使用imt明显地加强了该敲除（图6a）。假条件、imt以及对照sirna在降低hsp27水平上是无效的（图6a-c）。在来自3名患者的gbm细胞中图6bhsp27和图6chsp90水平的平均光密度值确认了hsp27的强大且特异性的敲除，imt的共同施用显著地增强了该敲除。hsp90水平没有被任何的处理条件显著地影响。所示的值代表平均值加(+号)标准差。单个星号表明与在假条件下测量的蛋白表达相比的显著性差异，双星号表明在所示的处理组之间在蛋白表达中的显著性差异(p<0.05,anova)。od,光密度。
在患者的gbm细胞中的hsp27的期望的表达没有被对照或imt条件显著地影响。相反，使用阳离子聚合物的hsp27-特异的sirna的非病毒转染（50nm），导致了在hsp27水平中的恰当的降低，同时使用imt显著及一致地增强了该降低（图6a）。使用从三名患者获得的gbm细胞，重复三次执行免疫印记分析的光密度定量，并且确认了在假处理的细胞[0.40±0.08正常的光密度(od)]、对照sirna-处理的(0.46±0.05od)、imt-处理的(0.45±0.08od)、或联合imt与对照sirna处理的细胞(0.43±0.09od)之间的hsp27表达水平中没有显著性的改变。相反，单独用hsp27sirna转染gbm细胞(0.27±0.04od)或imt与hsp27sirna联合(0.07±0.02od)，展示了在hsp27水平的显著降低分别为32.5%和82.5%（图6b）。使用hsp27sirna或imt加hsp27sirna处理，在hsp90（一种相关的应激反应分子伴侣）的表达中没有降低，进一步支持了基因靶定方法和抗肿瘤效果的特异性（图6c）。用mtt定量在患者标本中的gbm细胞活力，并且如在前述系列一样，证明了在单独的imt后的的值显著降低(60.3±7.7%相对于未处理细胞的活力)。单独的hsp27sirna还产生了显著的细胞毒性效果（70.3±5.4%活力）。与单独的imt(57.1±8.8%活力)相比，imt和对照sirna的联合没有进一步降低细胞活力；然而，imt与共存的hspsirna在gbm细胞死亡中产生了强大并且显著的增加(35.9±12.8%活力；也参见图7)。
在gbm佐剂中的hsp27基因沉默的imt增强的杀肿瘤作用
参考图7，imt增强了在患者的gbm细胞中的靶定hsp27敲除的杀肿瘤作用。单个测量示出了在所示的处理48小时后的正常的mtt活力。单独的imt产生了gbm活力的明显降低，通过hsp27-特异的sirna而非对照sirna将其强烈地增强。单个星号表明了与假处理组相比的显著性差异。图7的双星号表明了在所示的处理组之间的显著性差异(p<0.05,anova)。使用来自3个不同的gbm患者的原代gbm细胞重复三次评估样品，并且示出为平均值+标准差。tr，转染试剂。
参考图20，注意到在对照条件（图a-e）下的gbm细胞的相似的密度和外观，但单独用hspsirna（图h）或imt（图f）导致明显的损失。通过hsp27sirna和imt结合（图i），该抗肿瘤的益处显著地加强。
该例子示出了imt与sirna处理联合的协同效应。相比单独采取的每个处理，imt与sirna的联合实质上更有效。
实施例2
此实施例补充了在图4-8、17、18及20中所示的结果，以证明使用高频imt（200khz）的基因靶标疗法的协同增强以及当与tmz联合时高频imt（200khz）的协同增强。
高频（200khz）增强在gbm中增强基因疗法
选择促肿瘤的分子伴侣hsp27作为治疗的靶标。图21a是使用源自3个手术的肿瘤标本的原代gbm细胞的代表性的免疫印迹分析。hsp27sirna产生了适当的靶标敲除，同时进行的imt（200khz）将其明显地增强。假条件、imt和sirna在降低hsp27水平中是无效的。另一个肿瘤促进的hsp（hsp90）的水平未被靶定的hsp27和疗法影响。在来自3名患者的gbm细胞中的图21bhsp27和图21hsp90水平的平均光密度值，确认了hsp27的强大及特异性的敲除，在200khz的imt的共同施用将其显著地增强。hsp90水平没有被任何的治疗条件显著地影响。所示的值代表平均值+标准差。单个星号表明与在假条件下测量的蛋白表达相比的显著性差异；两个星号表明在所示的处理组之间的蛋白表达的显著性差异(p<0.05,anova)。
与tmz联合的高频imt（200khz）对于患者gbm细胞的定量效应
图22示出的流式细胞术数据示出了在所示的处理之后活和凋亡/死亡gbm细胞的百分比。在所有群组之内，活细胞和凋亡/死亡细胞的百分比之间存在显著性差异(单个星号,anovap<0.05)。然而，注意到与其他组相比，tmz+imt组逆转了活的细胞和凋亡/死亡细胞的主要比例。双星号表示在活的部分或凋亡/死亡的部分与从未处理的细胞获取的各个值之间的显著性差异(p<0.05,anova)。每次运行使用约30,000个gbm细胞重复四次分析每个处理条件。处理的持续时间为72小时，并且所示的每个测量代表来自3名患者的原代gbm细胞的平均值+标准差。tmz，替莫唑胺。
实施例3-体内imt模型
在此研究中使用了f98大鼠gbm模型。简单来说，f98细胞源于在费舍尔大鼠中的退行性神经胶质瘤，并且当其被植入同源宿主脑部时产生具有gbm特性的治疗抵抗的脑肿瘤（21）。成年雄性大鼠经历双侧进入纹状体的商用套管/电极联合的立体定向植入。该mri-兼容性装置允许在生长肿瘤的中心的f98细胞和sirna的灌注，同时使用imt。参比电极穿过颈部皮肤以方便使用。通过换向器将imt电缆悬浮，从而动物可以在处理期间在它的居住笼内自由地移动（参见图10）。
成年费舍尔大鼠经历双侧进入纹状体的f98肿瘤细胞的立体定向植入。在脑部内的肿瘤生长4天后，使用频率为200khz及幅度为+/-2v的imt处理一侧7天。对侧的肿瘤装备了电极硬件，但不接受处理（即假处理）。在图10a和10c所示是在它的居住笼内接受imt的代表性动物。参照图10，使用通过换向器802连接至留置的脑电极的波形发生器801递送此治疗，该换向器始终允许动物自由运动。将套管电极结构803双侧地植入纹状体。只有被治疗的肿瘤接受imt；另一侧被植入相同的硬件但不被治疗。结构803由脑套管804和相邻的脑电极805组成，f98细胞通过脑套管被植入（虚线箭头），脑电极用于在gbm电场的中心（短的实心箭头）之内递送imt。参比电极806（长的实心箭头）被植入颈部软组织中。参比电极不限于颈部软组织，并且它也可以植入其他部位，例如腋下或硬膜下空间或适合肿瘤治疗的其他部位。图10c是经历imt的对象的近视图。动物在治疗期间没有显示持续不适、医学并发症、神经缺陷或癫痫发作的迹象。
imt降低整体脑肿瘤质量
图11是提取的在纹状体中容纳有双侧gbm肿瘤的大鼠脑部的照片。已经将imt植入物双侧地放置（现已移除），但仅在右侧激活。注意到imt介导的右侧半球体积与左侧相比减少。图11b所示的图像示出了用覆盖网格进行尺寸校准的图11a的相同脑部图。
在f98gbm模型中的体内生物发光成像（bli）
将被转导来稳定地表达萤火虫荧光素酶的f98gbm细胞植入费舍尔大鼠的纹状体中。图12a示出了bli肿瘤信号，图12b示出了通过肿瘤（箭头）的嘴部（顶部）至尾部苏木精染色的脑切片。这些数据是在植入含有40,000个f98gbm细胞的2μldmem的纹状体沉积物之后4天获得的，并且证明了在该模型中产生的侵袭性肿瘤发生。
图13b-d中所示的t2加权mri提供了肿瘤的准确三维描绘（箭头），适合于体积分析，并且相关的脑水肿在肿瘤周围显示为更明亮的信号。在这个项目中，mri研究补充bli和免疫组织学来评估肿瘤对imt的反应。
体内的imt的抗肿瘤作用
图14包括通过用假条件（即非刺激）或imt(200khz,+/-2v)处理7天的成年费舍尔大鼠的脑部的代表性图像。将2μl含有40,000个f98gbm细胞的dmem注射入双侧纹状体，4天之后开始imt治疗。因此图14a和14b示出了在所示的处理之后11天龄的肿瘤。图14a和图14b是容纳有用imt或假条件递送1周的双侧的gbm肿瘤的脑部的两个例子。在图a中使用的电极用entellan®绝缘。在图b中使用的电极是非绝缘的。注意到被治疗的肿瘤相对于假的对照肿瘤的显著减弱，imt有效地降低了gbm细胞通过脑的生长和扩散。图14c代表了具有植入的双侧imt结构但没有肿瘤细胞，其揭示了相对于假的对照条件imt对正常脑组织不产生明显的损伤。在图14c中的星号表明了在所有假治疗或治疗的组织中被注意的硬件缺陷。在b中的比例尺适用于图14a-c。
体内imt的治疗益处
图15a-d示出了通过在另外四只费舍尔大鼠中的双侧gbm肿瘤的脑切片。将imt硬件植入两侧，但仅激活通过箭头指示的一侧。在这四只另外的动物中的imt处理的肿瘤明显地小于假处理的对照。
参照图16，在费舍尔大鼠纹状体中植入体内f98gbm模型电极，并且gbm肿瘤在双侧生长。左侧是假处理（即没有刺激）并且示出了强大的肿瘤生长（在图16a中由箭头标记）。相反地，在右侧上的imt在肿瘤体积中产生了明显的降低（箭头，图16b）。不足的半胱天冬酶-3激活（染红色）出现在假处理侧（图16c），而imt-处理的肿瘤被红色强烈标记（图16d）。ct定位扫描示出了具有在f98gbm肿瘤中的单侧电极的另一只大鼠正在准备放射治疗（图16e）。在图16中示出了可以与imt组合使用来治疗gbm肿瘤的放射剂量计划。
实施例4-imt增强的转染的机制
体外和体内研究显示，用imt处理的gbm细胞经历半胱天冬酶-激活的凋亡，然而不渗透性染料的细胞摄取也显示了膜破坏（图3和16）。这些发现可能反映坏死性死亡，细胞凋亡后的膜变性，或通过内吞作用、电泳或电穿孔促进染料吸收。为了解决这个问题，用imt处理原代患者gbm细胞，并且对其进行以下研究。活细胞成像：这些研究评估暴露于imt的活gbm细胞中膜完整性的急性变化。使用奥林巴斯fluoviewtmfv1000共聚焦显微镜，在假阴性或imt条件下使细胞成像1-3小时，以证明imt介导的碘化丙啶（一种膜不可渗透的荧光分子）的摄取（图19）。图19a：没有imt，图19b-i：分别在13、26、39、52、65、78、91和104秒之后的imt。
参照图19，在基线（图a，即无imt），细胞没有实质的荧光信号；在培养条件下正常时，仅在偶尔的退化细胞中观察到摄取。随着imt（+/-2vac，200khz）开始，从gbm细胞的核（图19的小图i中的小窄箭头）和细胞质（图19的小图i中的大粗体箭头）隔室发出的信号缓慢地、渐进地增强。图19的图像说明imt增加了膜不透性试剂通过细胞核和细胞质包膜的细胞摄取。
实施例5-使用f98gbm模型的体内imt增强的转染
这些实验评估了与标准的放化疗一起或不一起进行的imt介导的转染的体内效力。如前所述，手术后1周开始连续imt。7个动物组（10只动物/组）用于低频和高频imt刺激参数，双侧纹状体gbm；一侧用于假对照。选择组的大小以充分调节动物间的可变性，考虑到由于意想不到的问题/死亡而造成的潜在损失，并在3年的研究窗口内完成。imt单独进行（组1），与靶向hsp27或hsp70的单个试剂sirna一起进行（组2,3），与双重sirna疗法一起进行（组4），或与先前的sirna选项和放化疗处理一起进行（组5-7）。在imt治疗的第1天和第4天的通过图10b所示的套管803递送sirna（50μm于2μlpbs中）。双sirna疗法使用2μl的总体积，每个sirna的浓度调节至50nm。替莫唑胺（tmz）剂量为18mg/kgi.p.，临床相当于200mg/m2/天（24-25）；辐射剂量为30gy，分2次。f98细胞对12-18gy之间的体外辐射剂量有反应（26），在使用60gy的f98模型中发生放射性坏死（27）。本研究中的体内rt剂量落入这些值之间以诱导抗肿瘤作用而不发生放射性坏死。在治疗过程之前和之后，使用9.4tmri系统进行头颅成像。如果出现严重的神经损害迹象，则在治疗结束时或更早时对动物进行安乐死。大脑切片进行组织学染色和免疫细胞化学。定量肿瘤体积，评估增殖指数（mib1）、细胞凋亡（激活的半胱天冬酶-3和tunel）和hsp27/70表达。使用少量动物（n=5）来评估在imt缺失和存在下递送至肿瘤的荧光标记的对照sirna的体内分布。
确定在gbm中imt诱导的细胞死亡和imt增强转染的机制，使得能够在转换成临床设置之前可以最大限度地利用这些效应。
高频（200khz）imt激活gbm细胞中的半胱天冬酶-3。如图23所示是用72小时假或imt（+/-2v，200khz）条件处理的源自3名患者的gbm细胞制剂的免疫印迹研究。在imt期间完整的半胱天冬酶-3的水平显著降低，并对应于在激活（切割的）形式（诱导凋亡的标志）中的增加。
以上公开内容总体上描述了本发明。当情况可能暗示或提供便利时，考虑形式的变化和等同物的替换。尽管在此使用了特定的术语，但是这些术语意在描述性的意思，而不是为了限制的目的。本发明的其他变化和修改是可能的。因为这样的修改或变化被认为是在由所附权利要求限定的本发明的范围内。
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