本发明涉及一种活性组合物在治疗偏头痛药物中的应用，属于医药技术领域，即一种治疗偏头痛药物组合物。
背景技术：
偏头痛（migraine）是最常见的原发性头痛类型的慢性神经血管性疾病。偏头痛是以头痛剧烈，或左或右，反复发作，搏动样疼痛，一般持续4～72h为特征的一种临床常见病、多发病。可伴有恶心、呕吐等症，典型的偏头痛患者有前驱症状，并有诱发因素，如情绪波动、睡眠不足、饮酒等。光、声或活动可加重头痛，安静环境中休息则可缓解头痛。流行病学调查分析，西方国家偏头痛发病率较高。在美国，偏头痛年患病率为11%，18% 的妇女和6%的男性一年至少有一次偏头痛发作。偏头痛的患病率与年龄、性别、种族、收入等因素有关。
我国偏头痛流行病学调查，按随机或选点抽样3837597人。共查出患者37808例，患病率为9852/10万，发病率为797/10万。内陆高原为我国高患病地带，中南沿海省市患病率低。男女之比为1：4。25～29岁患病率最高（1927.4/10万），10岁以下最低（42.6/10万）。北方内陆地区于夏季头痛发作频率最高，而南方地区以春季最高。
偏头痛的发病机制尚不十分清楚，传统血管学说认为，偏头痛是原发性血管疾病。颅内血管收缩引起偏头痛先兆症状，随后颅外、颅内血管扩张，血管周围组织产生血管活性多肽导致无菌性炎症导致搏动性的头痛。神经学说认为，偏头痛发作时神经功能的变化是首要的，血流量的变化是继发的。5-羟色胺（5-HT）参与头痛发生，头痛发作时，5-HT 从血小板中释出，直接作用于颅内小血管使之收缩，并附于血管壁上。当血浆5-HT 浓度下降时，作用于大动脉张力性收缩性作用消失，血管壁扩张出现头痛。5-HT 既是一种神经递质，又是一种体液介质，对神经和血管均有影响。三叉神经血管学说认为，三叉神经节损害可能是偏头痛产生的神经基础。
轻、中度偏头痛一般采用对乙酰氨基酚、萘普生、布洛芬等药物，但存在副作用大疗效不佳等缺点；中、重度偏头痛一般选用中枢性5-HT受体拮抗剂，如特异性药物麦角胺类、曲普坦类等药物，或采用止痛药如阿片类药物。特异性药物虽然效果好，但对心血管有不良影响。阿片类止痛药虽然具有很好的镇痛效果，但长期应用可至成瘾依赖性。
本发明的一种活性组合物在治疗偏头痛药物中的应用，该活性组合物能预防和治疗神经血管性偏头痛。通过检索，本发明的活性组合物具有治疗偏头痛的功效未见报道。
本发明的活性组合物中的活性成分包括：蜜环菌多糖、低分子量褐藻多糖硫酸酯、γ-氨基丁酸，辅料为麦芽糊精。
蜜环菌多糖是蜜环菌中最重要的活性成分。蜜环菌菌索中分离得到的多糖产物为D－葡萄糖、D－甘露糖、D－半乳糖、D－木糖和半乳糖醛酸；菌丝体和发酵液多糖为单一葡萄糖组成的葡聚糖；菌索和子实体多糖由葡萄糖、木糖组成。这2种单糖在菌索多糖中的摩尔比为1:14，在子实体多糖中的摩尔比为1:10。蜜环菌多糖的分子量为10000～70000。蜜环菌不同发育阶段多糖含量分别为菌丝体含9.00%，发酵液含0.87g/100ml，菌索含1.12%，子实体含2.27%。
本发明以野生蜜环菌或人工发酵蜜环菌菌丝体为原料，提取其多糖活性成分。野生蜜环菌为真菌类担子菌纲白蘑科蜜环菌属植物蜜环菌Armillaria mellea（Vahl ex Fr.）Quel. 的子实体，是一种药食兼用真菌。蜜环菌的菌丝体以菌丝和菌索两种形式存在，其中菌丝是一种肉眼看不清楚的极纤细的丝状体，在高倍显微镜下观察，菌丝为无色透明有分隔。在纯培养中的菌丝呈现白色或棕色、绒毛状，蜜环菌是由营养菌丝形成菌索的少数菌物属之一。菌索是由菌丝束组成，表面由排列紧密的菌丝组成，并角质化，对不良环境有较强的抵抗力，显示出高度的功能分化。蜜环菌是天麻生长发育过程中最重要的营养物质，具有与天麻相似的药理作用。
野生蜜环菌又称榛蘑，药材收载于《全国中草药汇编》，榛蘑性味甘，温。祛风活络，强筋健骨。用于各种腰腿痛疼，佝偻病，癫痫等症。榛蘑药材还收载于《中药大辞典》，具有祛风活络，强筋壮骨功能。治羊痫风，各种腰腿疼痛，佝偻病。
褐藻多糖硫酸酯（Fucoidan、FPS）又名岩藻多糖，是以海带（Laminaria）、裙带菜（Undaria Pinnatifida）等褐藻为原料，经提取精制的多糖类产品。褐藻多糖硫酸酯的活性成分为L-褐藻糖-4-硫酸酯，低分子量褐藻多糖硫酸酯结构和肝素具有相似性，抗凝血作用是其一个突出的特点。在体外褐藻多糖硫酸酯以剂量依赖方式呈现抗凝活性，在体内则比得上肝素的活性。但抗凝血活性以及出血的风险比肝素小，是肝素良好的替代物。
低分子量褐藻多糖硫酸酯，具有显著的抗凝血作用，对内源性和外源性凝血途径均具有良好的抑制作用，在连续给药时能够降低血浆纤维蛋白原的含量，并能明显抑制血栓的形成，还能提高人体抗缺血能力。
褐藻多糖硫酸酯食品标准收载于SC/T 3404-2012《岩藻多糖》，标准中褐藻糖含量为≥15%，硫酸基含量为≥15%；褐藻多糖硫酸酯药品标准收载于国家药品标准YBZ00902003-2006，药品标准中褐藻糖含量为≥25%，水解硫酸基含量为≥22%。
γ-氨基丁酸（GABA）是以L-谷氨酸钠为原料经希氏乳杆菌（Lactobacillus hilgardii）发酵制成的化合物，分子式：C4H9NO2，分子量：103.12。结构式见图1
图1 γ-氨基丁酸结构式
γ-氨基丁酸（GABA）属强神经抑制性氨基酸，是一种重要的抑制性神经递质。γ-氨基丁酸通过传递各种信息而实现调节机体生理功能，具有镇静、催眠、镇痛、抗惊厥、抗癫痫、降血压、营养神经等生理作用，从而改善神经血管性偏头痛。
在治疗偏头痛过程中，重复服用阿片类止痛药物，易导致精神和身体依赖以至成瘾性。临床研究表明，中枢神经系统抑制性受体之一的γ-氨基丁酸B型（GABA-B）受体，除了具有镇痛作用外，还在药物成瘾的临床治疗中发挥重要的调节作用。
γ-氨基丁酸质量标准收载于QB/T 4587-2013《γ-氨基丁酸》和国家卫生计生委公告2009年第12号中，食用量：≤500mg/天。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种活性组合物在治疗偏头痛药物中的应用，即一种治疗偏头痛药物组合物。
本发明的另一个目的是提供治疗偏头痛活性组合物的制备方法。
本发明的技术方案是：一种治疗偏头痛药物组合物，其特征在于由以下质量百分比原料制成：蜜环菌多糖30%～60%、低分子量褐藻多糖硫酸酯3%～7%、γ-氨基丁酸8%～17%、辅料麦芽糊精15%～60%。
上述方案中：
治疗偏头痛药物组合物，由以下质量百分比原料制成：蜜环菌多糖33%～34%、低分子量褐藻多糖硫酸酯3%～4%、γ-氨基丁酸8%～9%、辅料麦芽糊精55%～56%。
治疗偏头痛药物组合物，由以下质量百分比原料制成：蜜环菌多糖60%、低分子量褐藻多糖硫酸酯7%、γ-氨基丁酸17%、辅料麦芽糊精16%。
所述的蜜环菌多糖是由蜜环菌为野生榛蘑或人工发酵培养的菌丝体提取的蜜环菌多糖。
所述的低分子量褐藻多糖硫酸酯是由海带科植物海带（Laminaria Japonica）或墨角藻属植物墨角藻（FucusvesiculosusL.）提取的褐藻多糖硫酸酯，经阿拉伯呋喃糖苷酶降解制成的低分子量褐藻多糖硫酸酯（Fucoidan、FPS），分子量（MW）应为60000～130000。
治疗偏头痛药物组合物，由以下质量百分比原料制成颗粒：蜜环菌多糖1000g、低分子量褐藻多糖硫酸酯100g、γ-氨基丁酸250g、麦芽糊精1650g，混合均匀，用14～16目尼龙筛制成湿颗粒，经50℃～60℃干燥至水分≤5.0%，装袋，每袋3g，制成1000袋。
治疗偏头痛药物组合物，由以下质量百分比原料制成片剂：蜜环菌多糖3000g、低分子量褐藻多糖硫酸酯350g、γ-氨基丁酸850g、麦芽糊精800g，混合均匀，制成16目的颗粒，压片，包装，即得。每片0.5g，制成10000片。
本发明的制备方法是这样实现的：
1．蜜环菌多糖制备
1.1 蜜环菌子实体多糖的制备：按上述质量比的20倍量称取蜜环菌子实体，清洗后60℃干燥，粉碎成1mm左右的粗粉，料液比为1：20，温度100℃，加水回流提取2次，第一次为3小时，第二次为2小时；合并提取液，真空浓缩成相对密度1.10～1.20（室温）的清膏；清膏用3～4倍量95%（质量分数）乙醇沉淀24小时；取沉淀物，用无水乙醇洗涤3次，再用4倍量（质量分数）≥80℃热水溶解，放冷至40℃～50℃时，加入1%～3%（质量比）的木瓜蛋白酶，保温酶解4～5小时；按多糖水溶液：氯仿：正丁醇为25：4：1的比例加入氯仿/正丁醇混合溶液，搅拌30min，以3000r/min离心；取澄清液，浓缩成稠膏，60℃以下真空干燥，粉碎成细粉，即得蜜环菌子实体多糖。
1.2 蜜环菌菌丝体多糖的制备：按上述质量比的10倍量取蜜环菌菌丝体，清洗后60℃干燥，料液比为1：5，温度90℃～100℃，加水回流提取2次，第一次为2小时，第二次为1小时；合并提取液，真空浓缩成相对密度1.10～1.20（室温）的清膏；清膏用3～4倍量95%（质量分数）乙醇沉淀24小时；取沉淀物，用无水乙醇洗涤3次，再用4倍量（质量分数）≥80℃热水溶解，放冷至40℃～50℃时，加入1%～3%（质量比）的木瓜蛋白酶，保温酶解4～5小时；按多糖水溶液：氯仿：正丁醇为25：4：1的比例加入氯仿/正丁醇混合溶液，搅拌30min，以3000r/min离心；取澄清液，浓缩成稠膏，60℃以下真空干燥，粉碎成细粉，即得蜜环菌菌丝体多糖。
2．低分子量褐藻多糖硫酸酯的制备
按上述质量比的1.2～1.5倍称取海带或墨角藻提取的褐藻多糖硫酸酯，按1.5%～3.0%比例溶解于水中，100℃杀菌20～30min；褐藻多糖硫酸酯水溶液降温至60℃～70℃时，按1%～3%的比例加入阿拉伯呋喃糖苷酶，最适pH≤7，最适反应温度60℃，反应时间4～5h，对褐藻多糖硫酸酯进行降解；真空浓缩，浓缩液加乙醇至75%，收集沉淀物，干燥，粉碎，即得低分子量褐藻多糖硫酸酯，其分子量（MW）应为60000～130000。
3．γ-氨基丁酸选择来源于L-谷氨酸钠为原料经希氏乳杆菌（Lactobacillus hilgardii）发酵而制成的γ-氨基丁酸。γ-氨基丁酸含量≥20％，水分≤10％，灰分≤18％。
4．本发明的活性组合物颗粒剂的制备：分别称取蜜环菌多糖1000g、低分子量褐藻多糖硫酸酯100g、γ-氨基丁酸250g、麦芽糊精1650g，混合均匀，用14～16目尼龙筛制成湿颗粒，经50℃～60℃干燥至水分≤5.0%（质量比），装袋，每袋3g，制成1000袋。
5．本发明的活性组合物片剂的制备：分别称取蜜环菌多糖3000g、低分子量褐藻多糖硫酸酯350g、γ-氨基丁酸850g、麦芽糊精800g，混合均匀，制成16目的颗粒，压片，包装，即得。每片0.5g，制成10000片。
本发明的活性组合物具有预防和治疗偏头痛的功能。
本发明的优点是：1、以食品的活性成分为原料，采用的是药食同源物质，食用安全，预防和治疗效果好，适合偏头痛人群长期服用，携带方便。2、本发明组合物治疗组对单胺类递质水平均明显改善，明显升高脑组织5-HT、NE、DA，说明本发明组合物能营养机体有关神经元，促使其控制的神经传递物质生成增多，从而改善偏头痛症状。NE的变化与模型组比较有明显的改善作用。本发明组合物对硝酸甘油所致的偏头痛大鼠具有预防性治疗作用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
1．蜜环菌多糖制备
1.1 蜜环菌子实体多糖的制备：按上述质量比的20倍量称取蜜环菌子实体，清洗后60℃干燥，粉碎成1mm左右的粗粉，料液比为1：20，温度100℃，加水回流提取2次，第一次为3小时，第二次为2小时；合并提取液，真空浓缩成相对密度1.10～1.20（室温）的清膏；清膏用3～4倍量95%（质量分数）乙醇沉淀24小时；取沉淀物，用无水乙醇洗涤3次，再用4倍量（质量分数）≥80℃热水溶解，放冷至40℃～50℃时，加入1%～3%（质量比）的木瓜蛋白酶，保温酶解4～5小时；按多糖水溶液：氯仿：正丁醇为25：4：1的比例加入氯仿/正丁醇混合溶液，搅拌30min，以3000r/min离心；取澄清液，浓缩成稠膏，60℃以下真空干燥，粉碎成细粉，即得蜜环菌子实体多糖。
1.2 蜜环菌菌丝体多糖的制备：按上述质量比的10倍量取蜜环菌菌丝体，清洗后60℃干燥，料液比为1：5，温度90℃～100℃，加水回流提取2次，第一次为2小时，第二次为1小时；合并提取液，真空浓缩成相对密度1.10～1.20（室温）的清膏；清膏用3～4倍量95%（质量分数）乙醇沉淀24小时；取沉淀物，用无水乙醇洗涤3次，再用4倍量（质量分数）≥80℃热水溶解，放冷至40℃～50℃时，加入1%～3%（质量比）的木瓜蛋白酶，保温酶解4～5小时；按多糖水溶液：氯仿：正丁醇为25：4：1的比例加入氯仿/正丁醇混合溶液，搅拌30min，以3000r/min离心；取澄清液，浓缩成稠膏，60℃以下真空干燥，粉碎成细粉，即得蜜环菌菌丝体多糖。
实施例2
低分子量褐藻多糖硫酸酯的制备：取海带或墨角藻提取的褐藻多糖硫酸酯，按1.5%～3.0%比例溶解于水中，100℃杀菌20～30min；褐藻多糖硫酸酯水溶液降温至60℃～70℃时，按1%～3%的比例加入阿拉伯呋喃糖苷酶，最适pH≤7，最适反应温度60℃，反应时间4～5h，对褐藻多糖硫酸酯进行降解；真空浓缩，浓缩液加乙醇至75%，收集沉淀物，干燥，粉碎，即得低分子量褐藻多糖硫酸酯，其分子量（MW）应为60000～130000。
实施例3
本发明的活性组合物颗粒剂的制备：分别称取蜜环菌多糖1000g、低分子量褐藻多糖硫酸酯100g、γ-氨基丁酸250g、麦芽糊精1650g，混合均匀，用14～16目尼龙筛制成湿颗粒，经50℃～60℃干燥至水分≤5.0%（质量比），装袋，每袋3g，制成1000袋。
实施例4
本发明的活性组合物片剂的制备：分别称取蜜环菌多糖3000g、低分子量褐藻多糖硫酸酯350g、γ-氨基丁酸850g、麦芽糊精800g，混合均匀，制成16目的颗粒，压片，包装，即得。每片0.5g，制成10000片。
实验例1．按实施例1制备的活性成分蜜环菌多糖，照分光光度法测定多糖含量：
1.1 试剂和对照品
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T 6682中的蒸馏水。
1.1.1 硫酸（H2SO4），ρ=1.84g/mL
1.1.2 无水乙醇（C2H6O）
1.1.3 苯酚（C6H6O），重蒸馏
1.1.4 葡萄糖（C6H12O6），使用前于105℃恒温烘干至恒重。
1.1.5 80%苯酚溶液：称取80g苯酚于100mL烧杯中，加水溶解，定容至100mL后转至棕色瓶中，置4℃冰箱中避光贮存。
1.1.6 5%苯酚：吸取苯酚5mL溶液（1.1.5），溶于75ml水中，混匀，现用现配。
1.1.6 100mg/L标准葡萄糖溶液：准确称量0.1000g葡萄糖（1.1.4）于100ml烧杯中，加水溶解，定容至1000ml容量瓶中，摇匀，至4℃冰箱密塞贮存。
1.2 仪器设备及装置
1.2.1 可见光分光光度计
1.2.2 分析天平，感量0.001g
1.2.3 离心机
1.3 操作步骤
1.3.1 试样制备
称取0.5g～1.0g样品，精确到0. 001g，置于50mL具塞离心管内。用5mL水浸润样品，缓慢加人20mL无水乙醇，同时使用涡旋振荡器振摇，使混合均匀，置超声提取器中超声提取30min。提取结束后，于4 000r/ min离心10min，弃去上清液。不溶物用10mL80%乙醇溶液（质量比）洗涤、离心。用水将上述不溶物转移入圆底烧瓶，加人50mL蒸馏水，装上磨口的空气冷凝管，于沸水浴中提取2h。冷却至室温，过滤，将上清液转移至100mL容量瓶中，残渣洗涤2次～3次，洗涤液转至容量瓶中，加水定容。此溶液为样品测定液。
1.3.2 标准曲线
分别吸取0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、1.0mL的标准葡萄糖溶液（1.1.6）置20mL具塞试管中，用蒸馏水补至1.0mL，向试液中加入1.0mL苯酚溶液（1.1.5），然后快速加入5.0mL硫酸（于液面垂直加入，勿接触试管壁，以便与反应液充分混合），静置10min，使用涡旋振荡器使反应液充分混合，然后将试管放置于30℃水浴中反应20min，在490nm处测定吸光度，以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，制定标准曲线。
1.4 测定
吸取1.00mL样品溶液于20mL具塞试管中，按1.3.1至1.3.2步骤操作，测定吸光度。同时做空白试验。
1.5 结果计算
样品中多糖含量以质量分数w计，单位以克每百克（g/100g）表示，按公式（1）计算：
式中：
m1：从标准曲线上查得样品测定液中含糖量，单位为微克（μg）；
V1：样品定容体积，单位为毫升（mL）；
V2：比色测定时所移取样品测定液的体积，单位为毫升（mL）；
m2：样品质量，单位为克（g）；
0.9：葡萄糖换算成葡聚糖的校正系数。
计算结果保留至小数点后两位。
本品蜜环菌多糖（以葡萄糖计）不得低于30g/100g。
实验例2．按实施例2制备的活性成分低分子量褐藻多糖硫酸酯，照分光光度法、高效液相色谱法、分子排阻色谱法测定褐藻糖含量、硫酸基含量和分子量与分子量分布：
2.1 褐藻糖含量测定
（1）对照品溶液的制备：取经五氧化二磷减压干燥的褐藻糖约10mg，精密称定，加少量水溶解，溶液转移至100ml 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
（2）标准曲线的制备：精密吸取对照品溶液 0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、0.90ml，置比色管中，分别加水至1.0ml，冰水浴中加入87%硫酸溶液4.5ml，摇匀；1分钟后，在沸水浴中准确加热10分钟，迅速冷却至室温，加3%半胱氨酸盐酸盐溶液0.1ml，摇匀，静置90分钟。照分光光度法（中国药典2015年版四部通则0401）测定，分别在427nm和396nm的波长处测定吸光度。以吸光度之差为纵坐标，以对照品量为横坐标，绘制标准曲线。
（3）测定法：取经五氧化二磷干燥的本品约0.1g，精密称定，加水溶解，滤过，滤液转移至100ml 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。取0.2ml置比色管中，照标准曲线制备方法， 自“加水至1.0ml”起，同法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中相当于褐藻糖的 含量。
本品以干燥品计，含褐藻糖不得少于25％（质量比）。
2.2 硫酸基含量测定：照高效液相色谱法（中国药典2015版四部通则0512）测定。
（1）色谱条件与系统适用性试验：AJS－10型阴离子色谱柱；以碳酸氢钠－碳酸钠溶液（取0.2mol/L碳酸氢钠溶液和0.2mol/L碳酸钠溶液各10ml，再用水稀释至1000ml）为流动相；以 ASCD-100型抑制电导池为检测器。理论板数按硫酸根计算应不低于3500。
（2）对照品溶液的制备：取于105℃干燥2小时的硫酸钾约907mg（相当于硫酸根500mg），精密称定，置1000ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备溶液。精密吸取对照品储备溶液2ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液标准曲线的制备精密吸取对照品溶液10ml、15ml、20ml，置25ml量瓶中，分别加水稀释至刻度，摇匀，精密吸取10µl，注入离子色谱仪，测定。以硫酸根的量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。
（3）测定法：取本品内容物约0.1g，精密称定，置10ml安瓿中，加1mol/L盐酸8ml，封管，在105℃水解4小时，冷却至室温，开管，滤过，滤液置100ml量瓶中，以少量水洗涤滤纸与滤器，洗液与滤液合并，加水稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密吸取供试品溶液10µl，注入离子色谱仪，测定，以标准曲线法计算，即得。
本品以干燥品计，含硫酸基不得少于22％（质量比）。
2.3 分子量与分子量分布
照分子排阻色谱法（中国药典2015年版四部通则0514）测定。
（1）色谱条件及系统适应性试验：测多糖专用凝胶柱（Shodx OHPaK SB-804HQ）；以 0.71％硫酸钠溶液为流动相（内含0.02％叠氮化钠）；柱温35℃；流速为每分钟0.5ml；示差折光检测器。称取葡聚糖P-5和葡聚糖P-800适量，分别用流动相制成每1ml含5mg的溶液，取20μL注入液相色谱仪，测得保留时间tT和tO；供试品溶液和对照品溶液色谱图中的保留时间tR 均应在tT和tO之间。理论板数按葡聚糖P-5峰计算应不小于3000。
（2）对照品溶液：取已知分子量的8个系列葡聚糖对照品，加流动相制成每1ml含5mg的 溶液，振摇，室温放置过夜，既得。
（3）供试品溶液：取本品适量，加流动相制成每1ml含5mg的溶液，室温放置过夜，用0.45um的滤膜过滤，取续滤液，即得。
（4）测定法：取上述各对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，用GPC软件计算出回归方程。取供试品溶液20μl，同法测定，用GPC软件计算供试品的重均分子量及分子 量分布。
本品重均分子量（MW）应为60000～130000，10％大分子部分重均分子量不得大于 750000。
实验例3．按实施例3、实施例4制成的治疗偏头痛的活性组合物，经分光光度法测定蜜环菌多糖含量：
（1）样品处理：
a. 样品提取：称取样品2.0g，置于100mL容量瓶中，加水80mL，于沸水浴上加热2小时，冷却至室温后补加水至刻度，混匀后过滤，弃去初滤液，收集余下滤液供沉淀多糖。
b. 沉淀粗多糖：准确吸取（a）项终初滤液5.0mL，置于50mL离心管中，加入无水乙醇20mL，混匀5min后，以3000r/min离心5min，弃去上清液。残渣用80%（体积分数）乙醇溶液数毫升洗涤，离心后弃上清液，反复操作3～4次。残渣用水溶解并定容至5.0mL，混匀后，供沉淀葡聚糖。
c. 沉淀葡聚糖：准确吸取（b）项终溶液2.0mL置于20mL离心管中，加入100g/L氢氧化钠溶液2.0mL铜试剂溶液2.0mL，沸水浴中煮沸2min，冷却，以3000r/min离心5min，弃去上清液。残渣用洗涤液数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复操作3次，残渣用10%（体积分数）硫酸溶液2.0mL溶解并转移至50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。此溶液为样品测试溶液。
（2）标准曲线绘制：准确称取葡聚糖标准使用液0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL（相当于葡聚糖0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg）分别置于25mL比色管中，准确补充水至2.0mL，加入50g/L苯酚溶液1.0mL，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10.0mL，于旋转混匀器上小心混匀，置沸水浴中煮沸2min，冷却后用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。以葡聚糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
（3）样品测定：准确吸取样品测定液2.OmL，置于25mL比色管中，加人50g/L苯酚溶液1.OmL，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10.OmL于旋转混匀器上小心混匀，置沸水浴中煮沸2min，冷却至室温，用分光光度计在485nm波长处，以试剂空白为参比，1cm比色皿测定吸光度值。从标准曲线上查出葡聚糖含量，计算样品中粗多糖含量，同时做样品空白实验。
本发明活性组合物颗粒剂，每袋含蜜环菌多糖（以葡聚糖计）≥200mg；本发明活性组合物片剂，每片含蜜环菌多糖（以葡聚糖计）≥60mg。
实验例4．对实施例3所述的治疗偏头痛的活性组合物进行动物试验如下：
1．材料与仪器
1.1 动物
雄性豚鼠，体重230～260g，由吉林大学实验动物中心提供，单笼饲养，自然光照，自然通风，自由进食水。
1.2 药物
本发明活性组合物颗粒剂，规格：3g/袋；天麻素胶囊（昆明制药集团股份有限公司生产），批准文号：H20013044，规格：50mg/粒。硝酸甘油注射液（四环药业股份有限公司生产），批号20150501，规格：5mg/mL。
1.3 仪器
电化学检测器（HPLC，5600A，Esa，USA）；Sigma 3K15 通用台式冷冻离心机； PHSJ-3F数字式pH计（上海雷磁仪器厂）。
2．实验方法
将实验动物随机分为空白组、模型组、本发明活性组合物治疗组、天麻素胶囊治疗组，每组10只。造模前每组预防性给药5d，均为灌胃给药；本发明活性组合物按治疗剂量给药为0.5g/kg体重；天麻素胶囊给药剂量为14mg/kg体重。模型组与假手术组除注入等量的生理盐水外，其它处理与各组相同。
除空白对照组外，其余各组动物于第5天治疗后皮下注射硝酸甘油注射液10mg/kg，对实验性偏头痛动物造模。以出现双耳发红、前肢频繁挠头、爬笼次数增多等提示模型动物头部不适的症状为造模成功的指标。
观察大鼠造模后耳红出现和消失的时间；从造模之时起观察大鼠造模后在每一时间段挠头的次数；挠头出现时间以大鼠出现连续挠头次数达5次以上为标志，消失时间以一个时间段 中大鼠挠头次数少于5次并出现倦怠、疲乏的表现为标志。
观察大鼠行为评价结束后，将动物断头处死，取脑，迅速分离脑干，称重，放入预先编号的冻存管中，快速置于液氦中储存，备用。采用高效液相（电化学法）测定大鼠脑内5-羟色胺（5-HT)、 5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）、多巴胺（DA）及去甲肾上腺素（NE）等单胺类神经递质的含量。实验结果见表1～表3。
实验发现，本发明组合物治疗组和天麻素胶囊治疗组对偏头痛大鼠耳红、挠头等行为均具有干预作用，能明显升高大鼠脑组织中5-羟色胺、多巴胺及去甲肾上腺素的含量。模型组脑内神经递质NE、5-HT含量明显下降，DA含量变化不大，说明偏头痛发作与脑干某些神经细胞分泌功能下降有关。本发明组合物治疗组对单胺类递质水平均明显改善，明显升高脑组织5-HT、NE、DA，说明本发明组合物能营养机体有关神经元，促使其控制的神经传递物质生成增多，从而改善偏头痛症状。NE的变化与模型组比较有明显的改善作用。
本发明组合物能预防偏头痛发作，这种作用可能与调节机体单胺类神经递质的释放和代谢机制得以恢复，进而改善脑及血管的功能障碍有关。
综上所述，本发明组合物对硝酸甘油所致的偏头痛大鼠具有预防性治疗作用，其作用机制与脑内神经递质5-HT、DA、NE密切相关。