阿齐沙坦在制备帕金森病防治药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体是阿齐沙坦在制备帕金森病防治药物中的应用。

背景技术：

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是临床上第二常见的神经退行性疾病。其典型病理特征为脑内黑质区域多巴胺能神经元丢失。典型临床症状包括运动迟缓、静止性震颤、肌强直和姿势步态障。近年来，随着我国人口老龄化进程的加剧，PD的发病率逐渐身高，现己成为影响老年人群生活质量的主要疾病之一，为个人、家庭和社会造成了沉重的负担。目前针对PD的常用治疗药物以抗胆碱药物及多巴胺能药物为主，其只能改善PD的临床症状，并不能完全阻止或逆转该病的进展。此外，上述药物存在一定的副作用，患者耐受性一般。因此，探索新的靶点并依此开发安全且有效的PD防治药物，一直是本领域的研究热点。

肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)是体内最为重要的体液调节系统。其主要效应肽血管紧张素II(angiotensin II，Ang II)通过作用于其特异性受体AT1R，参与水电解质、血压及细胞/器官功能的调节。新近研究表明，相对于健康对照，PD患者脑内黑质区域的Ang II水平及AT1R表达显著升高。此外，向大鼠脑内黑质区域输注Ang II可造成多巴胺能神经元丢失，并导致PD典型的行为学症状。上述证据表明，Ang II可能通过作用于AT1R参与PD的病理进程，而使用AT1R拮抗剂对抗Ang II的生理活性可能对PD的病理进程产生保护作用。

作为一种安全且有效的新型沙坦类AT1R拮抗剂，阿齐沙坦(Azilsartan)于2011年被美国FDA批准用于高血压病的治疗。现有技术对阿齐沙坦的应用主要关于其降压功效，而尚未见到阿齐沙坦应用于PD治疗药物中的相关报道。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明经研究，发现了阿齐沙坦的新用途——在制备帕金森病防治药物中的应用。

本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：

本发明通过PD模型大鼠试验，首次发现口服阿齐沙坦能显著抑制脑内黑质区多巴胺能神经元凋亡，并明显改善PD典型的行为学症状，因此，阿齐沙坦可以作为治疗帕金森病的有效药物进行应用，也可以用于制备治疗PD的药物。具体应用时，可以直接将阿齐沙坦作为用于治疗帕金森病的口服药物。

具体应用时，还可以阿齐沙坦作为活性成分，与药剂学上可以接受的载体、基质或辅料混合制成口服药物。

对比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明首次揭示了阿齐沙坦可用于制备PD的防治药物的新用途，经过试验验证，该用途与阿齐沙坦本身的降压功效无关，扩大了阿齐沙坦的应用范围，并增加了PD患者用药选择的多样性。

附图说明

附图1阿齐沙坦分子式。

附图2是口服阿齐沙坦抑制PD模型大鼠脑内黑质区多巴胺能神经元凋亡的示意图，其中，A：4组大鼠脑内黑质区多巴胺能神经元存活数量的定量统计；B：4组大鼠脑内黑质区凋亡关键酶caspase-3的活性比较。每组n＝6只，组间比较采用单因素方差分析结合Tukey事后检验法；柱状图代表四组数据的均数±标准差；*相较于对照组大鼠P<0.05；#相较于PD模型大鼠P<0.05。

附图3是口服阿齐沙坦对改善PD模型大鼠的典型行为学症状效果的示意图，其中，A：4组大鼠在垂直网格实验中的移动潜伏期；B：4组大鼠在水平杠杆实验中的移动潜伏期。每组n＝6只，组间比较采用单因素方差分析结合Tukey事后检验法；柱状图代表四组数据的均数±标准差；*相较于对照组大鼠P<0.05；#相较于PD模型大鼠P<0.05。

附图4是口服阿齐沙坦对大鼠血压的影响示意图，每组n＝6只。组间比较采用单因素方差分析结合Tukey事后检验法；柱状图代表四组数据的均数±标准差。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所限定的范围。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1：阿齐沙坦对PD模型大鼠试验

(1)实验过程

实验药物：鱼藤酮(美国Sigma公司)

二甲基亚砜(美国Sigma公司)

聚乙二醇均(美国Sigma公司)

阿齐沙坦(美国MedChemexpress公司)

实验动物：雄性Lewis大鼠(体重：280-300g)购买自南京医科大学医药实验动物中心。整个研究方案经南京市第一医院动物实验伦理委员会批准。

动物分组、PD模型大鼠的构建及阿齐沙坦灌胃治疗：

雄性Lewis大鼠被随机分为如下4组：对照组、PD模型组、PD模型+阿齐沙坦组、对照+阿齐沙坦组。

使用鱼藤酮皮下慢性输注法(2.5mg/kg/d，28d)构建PD大鼠模型：将适量鱼藤酮溶于二甲基亚砜和聚乙二醇(1：1)混合液后注入微型渗透泵(型号：2ML4，美国Alzet公司；寿命：28天)中，后将微型渗透泵置于37℃生理盐水以激活。大鼠经10％水合氯醛(0.35mL/100g，腹腔注射)麻醉后，于背部正中行约1cm的切口，使用小号血管钳深入切口，充分分离皮下组织，将激活的微型渗透泵植入其中，后仔细缝合切口。28天后进行行为学评估。若出现PD典型行为学症状，则认定模型构建成功。

“PD模型+阿齐沙坦组”在接受鱼藤酮皮下慢性输注的同时，于每天上午8时-12时行阿齐沙坦灌胃治疗(混悬于生理盐水，剂量：5mg/kg/d)，治疗持续28天。“对照+阿齐沙坦组”仅接受28天的阿齐沙坦灌胃治疗，不同时接受鱼藤酮皮下慢性输注。

血压测量：

本发明使用采用无创尾动脉血压测量仪(型号：BP-2000，美国Visitech公司)于造模/治疗开始第28天上午8时-10时对大鼠的血压进行测量，每次测量3次，取平均值。

多巴胺能神经元染色：

治疗结束后，各组大鼠经10％水合氯醛(0.35mL/100g，腹腔注射)麻醉，固定并开胸，使用生理盐水经左心耳灌注，直至肝脏变白后迅速断头取脑。参照大鼠定位图谱，取前囟正后方5.0-5.2毫米处黑质脑组织，浸于40g/L多聚甲醛中4℃固定24小时，后经脱水、脱敏、浸蜡包埋成蜡块。使用石蜡切片机连续做冠状切片，每张组织切片厚4微米，使用PBS洗3次。滴加正常非免疫动物血清室温下封闭5分钟；之后滴加经1：500稀释的酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)多克隆一抗，置4℃冰箱过夜孵育；取出后经PBS洗3次，滴加生物素标记的二抗，室温下孵育5分钟；PBS洗3次，滴加新鲜配制的DAB溶液。然后使用去离子水终止显色，脱水，使用中性树脂胶封片，于光学显微镜下观察并计数。呈棕黑色深染的神经元为TH阳性神经元。

Caspase-3活性测定：

治疗结束后，各组大鼠经10％水合氯醛(0.35mL/100g，腹腔注射)深度麻醉，迅速断头取脑，挖取黑质区域组织置于组织裂解液中，超声细胞破碎仪4℃匀浆，离心机3000rpm于4℃离心15min，收集上清液，利用比色检测试剂盒对caspase-3活性进行测定。

行为学实验：

垂直网格实验：将大鼠的双侧前后爪挂在一宽25.5cm、高44cm的垂直网格上(网格间距1cm)，将大鼠头朝上置于金属网格中央，使之与地面垂直且趾爪均抓住金属网格，用秒表记录大鼠从静止状态至其任意一爪移动时所需的时间，记为移动潜伏期。最大潜伏期设为120s；

水平杠杆实验：将大鼠两只前爪放置于一离地面9cm高的水平杠杆上，用秒表记录大鼠双爪在水平杠杆上的停留时间，记为潜伏期。最大潜伏期设为120s。

数据分析与统计：

本发明采用SPSS17.0统计软件进行实验数据分析。数据均以均数±标准差标示。组间比较采用单因素方差分析结合Tukey事后检验法(双侧检验)。P<0.05认为有统计学差异。

(2)实验结果分析

具体实验数据统计详见附图2～4。

1)口服阿齐沙坦可抑制PD模型大鼠脑内黑质区多巴胺能神经元凋亡。

如附图2的图A所示，PD模型大鼠脑内黑质区多巴胺能神经元存活数量相对于对照组大鼠显著减少，而口服阿齐沙坦可显著抑制PD模型大鼠脑内黑质区多巴胺能神经元死亡。

如附图2的图B所示，PD模型大鼠脑内黑质区caspase-3的活性显著增高，而口服阿齐沙坦可显著降低PD模型大鼠脑内黑质区caspase-3的活性。

与对照组相比，PD模型大鼠脑内黑质区TH阳性神经元数明显减少，其差异具统计学意义(P<0.05)，提示该区域内多巴胺神经元的丢失。此外，与对照组相比，PD模型大鼠脑内黑质区凋亡关键酶caspase-3的活性显著升高，其差异具统计学意义(P<0.05)，提示该区域内多巴胺神经元的丢失与凋亡密切相关。而口服阿齐沙坦能显著逆转PD模型大鼠脑内黑质区TH阳性神经元的减少，其差异均具有显著性(P<0.05)。此外，阿齐沙坦能显著降低PD大鼠脑内黑质区caspase-3活性，其差异均具有显著性(P<0.05)。值得一提的是，阿齐沙坦自身对脑内黑质区TH阳性神经元的数量无明显影响(P>0.05)。上述结果表明，口服阿齐沙坦可抑制PD模型大鼠脑内黑质区多巴胺能神经元凋亡。

2)口服阿齐沙坦可改善PD模型大鼠的典型行为学症状。

如附图3的图A所示，在垂直网络实验中，PD模型大鼠移动潜伏期相对于对照组大鼠显著延长，而口服阿齐沙坦可显著降低PD模型大鼠移动潜伏期。

如附图3的图B所示，在水平杠杆实验中，PD模型大鼠移动潜伏期相对于对照组大鼠显著延长，而口服阿齐沙坦可显著降低PD模型大鼠移动潜伏期。

在垂直网格实验及水平杠杆实验中，PD模型大鼠表现出典型行为学症状：具体表现为移动潜伏期相较对照组显著延长，其差异具有统计学意义(P<0.05)。而给予阿齐沙坦治疗后，PD模型大鼠在上述两种实验中的移动潜伏期明显缩短，差异具有统计学意义(P<0.05)。值得一提的是，阿齐沙坦自身对移动潜伏期无明显影响(P>0.05)。上述结果表明，口服阿齐沙坦可改善PD模型大鼠的典型行为学症状。

3)口服阿齐沙坦对PD模型大鼠的血压无显著影响。

如附图4所示，造模药物鱼藤酮与治疗药物阿齐沙坦对大鼠的血压无显著影响。

本发明使用采用无创尾动脉血压测量仪于造模/治疗开始第28天上午8时～10时对大鼠的血压进行测量，每次测量3次，取平均值。可见口服阿齐沙坦对大鼠的血压无显著影响(P>0.05)。上述结果表明，阿齐沙坦对PD的防治作用与其本身的降压功效无关。