利克飞龙联合氟康唑的抗真菌产品及其应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种利克飞龙联合氟康唑的抗真菌产品及其应用。

背景技术：

近年来，随着免疫力低下人群(恶性肿瘤、艾滋病、自身免疫病等患者)的增多，导管插管和器官移植等技术的开展，广谱抗生素、皮质激素和免疫抑制剂的广泛使用，真菌感染的发病率急剧上升(AJ.Antifungal agents:mode of action in yeast cells.Rev Esp Quimioter.2006,19:130-9)。白色念珠菌是临床真菌感染中常见的分离菌，它可以造成浅表感染也可以侵入体内造成系统感染。

氟康唑(fluconazole，FLC)作为安全、有效、价格低廉的抗真菌药物，对白色念珠菌有很好的疗效。但随着FLC在临床上的广泛应用，使得白色念珠菌对唑类药物的耐药性不断增高，因此寻找新的抗真菌手段迫在眉睫。

新药研究与联合用药研究均是解决真菌耐药的重要途径。但新药研究周期长，成本高，而联合用药前期投入少、效果显著，受到国内外的关注。联合用药研究包括两种抗真菌药联合和非抗真菌药与抗真菌药联合。由于抗真菌药物品种有限，且新的具有抗真菌作用的药物价格昂贵且副作用明显，使得非抗真菌药物与抗真菌药物的联合应用研究备受关注。

利克飞龙(licofelone)是一种环氧合酶(COX)、5-脂氧合酶(5-LOX)的双重抑制剂，是具有双重抗炎作用的非甾体抗炎药，与COX和LOX的活性位点都能结合，产生高效的抗炎作用，而且能够缓解、改善和克服NSAIDs对胃肠道、心血管系统和肾脏等毒性。目前，利克飞龙已经作为治疗骨关节炎的药物进入了三期临床实验(Payandemehr B.A COX/5-LOX Inhibitor Licofelone Revealed Anticonvulsant PropertiesThrough iNOS Diminution in Mice.Neurochemical research.2015,40:1819-28)。但是利克飞龙和氟康唑联用是否能抑制白色念珠菌的生长，目前尚无相关研究报道。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的提供一种利克飞龙联合氟康唑的抗真菌产品及其在治疗耐药的白色念珠菌感染中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供利克飞龙联合氟康唑在制备抗真菌产品中的用途。

优选的，联合应用时，利克飞龙与氟康唑的最低抑菌浓度分别为：16μg/ml、1μg/ml。

结果表明，大于16μg/ml利克飞龙与大于1μg/ml的氟康唑联合应用均有效。

进一步优选的，联合应用时，利克飞龙与氟康唑的浓度分别为：16-128μg/ml、1-64μg/ml。

所述真菌为耐药白色念珠菌。

本发明的第二方面，提供一种抗真菌的药物组合物。该药物组合物包含利克飞龙和氟康唑。

上述药物组合物中，利克飞龙的浓度大于或等于16μg/ml，氟康唑的浓度大于或等于1μg/ml。

优选的，上述药物组合物中，利克飞龙的浓度为16-128μg/ml，氟康唑的浓度为1-64μg/ml。

进一步优选的，上述药物组合物中，利克飞龙的浓度为16μg/ml，氟康唑的浓度为1μg/ml。

所述真菌为耐药白色念珠菌。

抗菌药物联用在体外或动物体内可表现为“无关”、“相加”、“协同”和“拮抗”四种作用，对于不同类的药物联用，由于药物的作用机制和作用方式不同，很有可能会增加毒性或因诱导灭活酶的产生或竞争同一靶位而出现拮抗作用；而且，同一类药物不一定都具有相同的作用，如头孢菌素类，一代头孢主要抗革兰氏阳性菌，三、四代头孢菌素主要抗革兰氏阴性菌，并且只有部分的三代头孢品种与四代头孢才具有抗铜绿假单胞菌的作用，因此，对于抗菌药物的联用而言，其联合使用后的抗菌效果具有极大的不可预测性。

为克服白色念珠菌对氟康唑药物的耐药性，经过广泛的深入研究，本发明的发明人意外的发现，作为非抗真菌的药物，利克飞龙单用浓度小于128μg/ml时，对白色念珠菌的作用很弱或甚至没有，只有在高于128μg/ml浓度下才会对白色念珠菌产生抑菌作用；而将利克飞龙与氟康唑联用时，呈现出强大的协同抗真菌作用。

本发明定量评价了利克飞龙与氟康唑的联合抗真菌作用，分析了其对氟康唑的增敏效果，并进行了静态与动态的系统评价。

两种药物联用的浓度会影响两者的相互作用，本发明采用耐药白色念珠菌细胞进行研究，利用液体定量法，测定氟康唑与利克飞龙联合用药时最低有效浓度，并以FICI法选择最佳药物组合浓度及评价药物联合用药的作用；本发明还采用时间-杀菌曲线法评价药物联用动态抗真菌作用。

本发明的有益效果：

本发明为临床提供了联合用药作为治疗耐药真菌感染的治疗方案。另外，环氧合酶/脂氧合酶双效抑制剂对氟康唑的增效作用，揭示其协同作用机制可能与细胞内前列腺素E有关，为研究抗真菌药物作用的新靶点提供思路。

本发明表明，氟康唑与利克飞龙联用时，可以产生协同抗真菌作用。对抗氟康唑耐药的白色念珠菌菌株(MIC_FLC>512μg/ml)时，16μg/ml的利克飞龙可以使氟康唑的最低抑菌浓度从512降到1μg/ml，浓度再增大，效果更强。

本发明表明，破坏细胞内前列腺素E合成可能是联合抗真菌作用的机制，为新药的开发及老药新用提供可能的研究方向。

本发明表明，利克飞龙可明显增强氟康唑抗真菌作用，并且降低FLC的最低有效浓度，减少抗真菌药物的用药量，从而降低药物的不良反应的发生。

附图说明

图1为氟康唑联合利克飞龙对抗CA10作用三维效果图(X轴：FLC浓度；Y轴：利克飞龙浓度；Z轴：各浓度组合下的ΔE值)；

图2为氟康唑联合利克飞龙对抗CA16作用三维效果图(X轴：FLC浓度；Y轴：利克飞龙浓度；Z轴：各浓度组合下的ΔE值)；

图3为氟康唑联合利克飞龙对抗CA10的时间-杀菌曲线；

图4为氟康唑联合利克飞龙对抗CA16的时间-杀菌曲线。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述实施例说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1：氟康唑与利克飞龙联合抗真菌作用测定

1.材料

1.1药品与试剂

氟康唑(fluconazole，FLC)，山东诚创医药科技发展有限公司；

利克飞龙(licofelone)，上海铂法姆医药科技有限公司；

科玛嘉念珠菌显色培养基，郑州博赛生物工程有限公司；

TTC-沙保罗琼脂，杭州天和微生物试剂有限公司；

氢氧化钠，国营山东单县有机化工厂，批号940420；

磷酸二氢钾，上海新宝精细化工厂，批号200602132；

二甲基亚砜(DMSO)，天津市广成化学试剂有限公司；

RPMI 1640原料药粉，美国GIBCO公司；

3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)，济南朋远生物技术有限公司；

甲萘醌(Menadione)，美国Sigma公司；

XTT(二甲氧唑黄)，南京旋光科技有限公司；

乳酸林格氏液(复方氯化钠溶液)，山东鲁抗辰欣药业有限公司；

丙酮，上海振兴化工一厂，批号200209510；

XTT(3,3'-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠)-甲萘醌溶液的配制：取XTT粉末0.0500g，溶解于100ml已灭菌的林格氏液配成0.5mg/ml的溶液，用0.22μm滤膜滤过灭菌；加入10μl的10mmol/L的甲萘醌丙酮溶液(取甲萘醌0.0860g溶解于5ml丙酮)，使其终浓度为1μmol/L，摇匀，2℃～8℃避光保存。

药物溶液：氟康唑用无菌蒸馏水溶解，其他药物用二甲基亚砜溶解，分别配成2560μg/ml的储备液，过滤(0.22μm)分装。所有药液于-20℃冰箱保存，备用。

PBS(磷酸盐缓冲液)：用北京鼎国昌盛生物技术有限公司的PBS磷酸盐缓冲剂(粉剂)，小包装一袋溶于1L蒸馏水中，即配成0.01M，PH7.4的PBS磷酸盐缓冲液，121℃高温高压湿热灭菌20min，冷却备用。

RPMI(Roswell Park Memorial Institute)1640液体培养液：取RPMI 1640(含L-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠)粉末2.08g，加入10％葡萄糖溶液40ml(含糖终浓度2％)及MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)粉6.906g，加蒸馏水至200ml，混合均匀后在22℃用1mol/L的NaOH溶液调pH为7.0±0.1，临用前用0.22μm混合纤维膜过滤灭菌。

1.2仪器

1.3实验菌株

质控菌株：白念珠菌ATCC10231，山东大学药理教研室惠赠；

实验菌株：省立医院、千佛山医院临床分离的白色念珠菌；

菌株鉴定：实验菌株在科玛嘉念珠菌显色培养基35℃下培养48小时，菌落呈绿色或翠绿色所有菌株，再经山东省疾病预防控制中心微生物研究室以标准微生物学方法鉴定为白色念珠菌。得到的白色念珠菌菌株分别编号为：CA4、CA8、CA10和CA16，根据药敏性试验结果，CA10和CA16为对氟康唑耐药的菌株，CA4、CA8为对氟康唑敏感的菌株。

菌液制备：-20℃下保存的白色念珠菌室温下解冻，接种到TTC-沙保罗琼脂培养基上，35℃培养24～48h，取发育良好的单一菌落再次接种，35℃培养24h，以保证菌株处于生长期。选取若干单个较大菌落，PBS配制成菌悬液，经涡旋器振荡均匀后以中国细菌浊度标准管比浊，调整样品管与标准管浊度一致，此时白色念珠菌的菌浓度约为4.5×10⁶CFU/ml，系列稀释即得到工作菌液，并以活菌计数进行浓度验证。

2.内容与方法

2.1氟康唑与利克飞龙的联合抗真菌作用测定

2.1.1微量稀释法

根据CLSI M27-A3方案的棋盘法，以RPMI-1640液体培养基稀释药液使其成为4倍工作浓度，筛选利克飞龙和氟康唑浓度应用范围，即利克飞龙的终浓度分别为128～2μg/ml，氟康唑为64～0.125μg/ml。按浓度从低到高的顺序吸取唑类药液50μl，分别加入96孔平板的第2～12列，按浓度从低到高的顺序吸取利克飞龙药液50μl，分别加入96孔平板的第G～A行，除A12外各孔再分别加100μl菌液，其余不足200μl的孔用RPMI-1640培养液补足。其中H1为生长对照，只含菌液不含药物，A12为空白对照，只含药液不含菌液。将96孔平板置35℃恒温培养箱中培养24h后，用XTT负载后以酶标仪测定并记录结果。所有实验重复三次。

2.1.2时间-杀菌曲线法

将浓度为2560μg/ml的氟康唑和利克飞龙药物储备液以RPMI 1640液体培养基10倍稀释成工作浓度。

取TTC-沙保罗琼脂培养基上传代两次的实验菌株(CA10)，挑取单个较大菌落，以PBS制成菌悬液，采用中国细菌浊度标准进行比浊，当标准管与样品管浓度一致时，菌液初始浓度约为4.5×10⁶CFU/ml，以RPMI-1640稀释菌液为10倍工作浓度，并通过活菌计数法进行浓度验证。

取上述制备的药液500μl加入到相应试管内，再加入RPMI 1640液体培养基至液体总体积为4.5ml；此时取按上述方法制备的菌液500μl加入到此4.5ml含(或不含)药物的培养基内，震荡混匀。本实验分为四组，即：生长对照组(不加药)、利克飞龙药物单用组、氟康唑单用组、利克飞龙与氟康唑联合用药组，共4个体系。每个体系总体积为5ml，体系内氟康唑和利克飞龙的终浓度分别为1μg/ml和16μg/ml，体系内菌液终浓度约为4.5×10³CFU/ml。将制备完毕的体系于35℃静置培养，于药物作用的第0、6、12、24、36、48h的时间点取样测定。

2.2评价方法与结果判定

2.2.1 LA理论

Loewe additivity(LA)理论的基本思想认为药物不可能和它本身发生相互作用，因此将药物单用或联用产生相同药效的浓度(等效位点)进行比较。其分析方法分数抑菌浓度指数法(fractional inhibitory concentration index,FICI)，表述如下：

ΣFIC＝FIC_A+FIC_B＝C_A/MIC_A+C_B/MIC_B

MIC_A和MIC_B分别是药物A和B单用时的最小抑菌浓度，C_A与C_B为两药联用时达到相同药效时各自的浓度。FICI＞4为拮抗作用，FICI在0.5与4之间为相加或无关作用，FICI≤0.5定义为协同作用。

2.2.2 XTT法(二甲氧唑黄比色法)

在取样时间点将各体系在蜗旋振荡器上混匀，吸取100μl某体系内的菌悬液加入到96孔平底培养板内，在以100μl无菌RPMI 1640液体培养基为空白对照的情况下，再分别向每个加样后的孔内加入100μl配制好的XTT-甲萘醌溶液，培养板在35℃下避光培养2小时，酶标仪设置单孔空白，在492nm处测各孔的OD值，每个体系做三组，取平均值记录结果，试验重复3次。

3.结果

3.1氟康唑与非抗菌药物的联合抗真菌作用结果

3.1.1氟康唑与非抗菌药物联合的最低有效菌浓度

各孔中真菌生长百分数的计算方法为：

真菌生长百分数＝(各孔OD值-空白对照孔OD值)/生长对照孔OD值

按上述公式计算平板中各孔真菌生长百分数，取能够抑制真菌生长80％的最低联用药物浓度为判读终点，如果真菌生长率不恰好等于20％，取与之最接近的药物联合孔为判读终点。

氟康唑与利克飞龙的联合抗真菌作用，对敏感株来说不明显，多为无关，而对耐药株，则呈现强协同作用。其中耐药株CA10平板中的生长百分数实验结果如表1所示；耐药株CA16平板中的生长百分数实验结果如表2所示。

表.1.用棋盘表示氟康唑与利克飞龙的联合用药抗耐药白色念珠菌CA10生长百分率(以FICI法换算的药物最佳作用组合用灰色标出)。

表.2.用棋盘表示氟康唑与利克飞龙的联合用药抗耐药白色念珠菌CA16生长百分率(以FICI法换算的药物最佳作用组合用灰色标出)。

3.1.2 FICI法评价FLC/利克飞龙的协同作用

三次重复性实验所得结果见表3。由测定结果可见，利克飞龙与氟康唑联合应用时，对耐药白色念珠菌的作用FICI均<0.5，呈现协同作用。而对敏感白色念珠菌的FICI值则在0.5和1之间，呈现无关作用。

表3以FICI法评氟康唑/利克飞龙联合用药抗真菌作用

3.1.3时间杀菌曲线法评价氟康唑/利克飞龙协同作用结果

将各个时间点联合抗真菌作用的结果连接成曲线，可观察联合用药后的动态作用效果，如图1、2所示：在4.5×10³的菌液中在6h之前加药组和对照组OD值的变化不大，与对照组相比，6h之后含有氟康唑的各组开始出现生长延迟，其中氟康唑/利克飞龙联用组处理的真菌生长延迟更明显。与对照组相比，各药物作用组在24h对真菌的抑制效果最好，最终效果随着时间慢慢变弱。

4.结论

面对临床应用中抗真菌药物较少且出现耐药现象的现状，研制新型的抗真菌药物是解决这一问题的途径之一，同时通过联合用药的方式来增加真菌对药物的敏感性也是一种较好的选择。利克飞龙作为环氧合酶/脂氧合酶双效抑制剂高浓度单用时有一定的抗真菌作用，当与FLC联用对抗耐药白色念珠菌时，利克飞龙能显著降低FLC的MIC值，表现强协同作用。但是利克飞龙与氟康唑联用对非白色念珠菌和敏感的白色念珠菌几乎无作用。现有研究表明环氧合酶抑制剂单用或与氟康唑联用都具有一定的抗真菌作用，该抗真菌作用与抑制前列腺素E的合成有密切关系。作为环氧合酶/脂氧合酶双效抑制剂的利克飞龙与FLC的协同作用机制是否也与影响了前列腺素E合成有关，有待进一步研究。本发明表明FLC和利克飞龙联合治疗耐药的白色念珠菌感染在临床上有一定的应用前景。

上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。