本发明涉及一种具有预防组织粘连功能的异种脱细胞神经移植物及其制备方法，属于生物医用材料领域。
背景技术：
周围神经损伤可能造成机体感觉和运动功能的部分或全部丧失，从而严重影响机体的功能行使和病患的生活质量。周围神经缺损的修复，尤其是长距离缺损的修复，一直是临床上较为棘手的难题。目前最常用的方法是利用自体神经移植来桥接断端以修复损伤，虽然修复效果良好，但存在诸如来源有限、导致二次创伤及易形成供区神经瘤等缺点，极大限制了其临床应用。近年来发展起来的神经导管类修复材料，虽具有一定的周围神经缺损修复效果，但由于其内部一般为中空结构，无法有效引导细胞的迁移和增殖，因此对于长距离缺损修复无能为力。
目前在临床上应用的同种异体脱细胞神经保留了天然神经内部的微结构，可用于修复长距离周围神经损伤，但由于受供体来源限制导致价格昂贵，患者可接受度较差。异种脱细胞神经同样有着接近人周围神经的网架微结构，材料本身所保留的成分有引导或诱导组织再生的能力，同时具备来源广泛、免疫原性低的特点，因此在用于构建组织工程神经以修复周围神经缺损方面具有明显的优势。
在周围神经损伤及修复过程中，粘连的形成具有普遍性。上述脱细胞神经移植物在植入体内后，虽然能修复神经缺损部位，但同时，必定会促使成纤维细胞大量增生，分泌大量胶原纤维，形成瘢痕、粘连，不利于神经之间的衔接，影响手术效果，有时还可导致严重的术后并发症。因此，临床上长期需要一种能有效预防组织粘连、可修复长距离缺损同时来源广泛、价格低廉的脱细胞神经移植物。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种可有效预防组织粘连的异种脱细胞神经移植物及其制备方法；本发明通过冻干工艺将获得的异种脱细胞神经移植物外部增加防粘连高分子层，以期在用于外科手术中修复周围神经缺损的同时，防止组织粘连的发生，加快神经修复和神经传导的重建。
本发明所提供的预防组织粘连的异种脱细胞神经移植物，由异种脱细胞神经移植物和附着于其表面的防粘连高分子层组成；
所述异种脱细胞神经移植物为健康哺乳动物的离体周围神经经脱细胞处理得到的细胞外基质，所述脱细胞处理可在常规工艺条件下进行。
所述预防组织粘连的异种脱细胞神经移植物中，所述防粘连高分子层的厚度可为0.01～1.0mm，具体可为0.3～1.0mm、0.5～1.0mm、0.7～1.0mm、0.3mm、0.5mm、0.7mm或1.0mm。
所述预防组织粘连的异种脱细胞神经移植物中，所述防粘连高分子层由亲水性高分子制成；
所述亲水性高分子为透明质酸钠、硫酸软骨素、羧甲基纤维素、氧化再生纤维素、羟乙丙纤维素、羧甲基淀粉、羧甲基壳聚糖、羟丁基壳聚糖、羧甲基甲壳质、海藻酸和胶原蛋白等中的一种或几种；
所述亲水性高分子的重均分子量可为100～3000KDa，。具体可为300～700KDa、300KDa、400KDa、500KDa或700KDa。
本发明预防组织粘连的异种脱细胞神经移植物中的防粘连高分子层包覆在异种脱细胞神经移植物的表面，具有多孔海绵状结构，且结合牢固、分布均匀。
本发明还进一步提供了所述预防组织粘连的异种脱细胞神经移植物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将所述异种脱细胞神经移植物浸渍于所述亲水性高分子的水溶液中；
(2)所述浸渍步骤结束，取出所述异种脱细胞神经移植物并依次经冷冻干燥和灭菌处理即得所述预防组织粘连的异种脱细胞神经移植物。
上述的制备方法中，所述亲水性高分子的水溶液中所述亲水性高分子的质量百分含量可为0.1％～10％，具体可为1％～2.5％、1％、1.5％、2％或2.5％。
上述的制备方法中，步骤(1)中，所述浸渍的时间可为1分钟～20分钟，具体可为10～20分钟、10分钟、15分钟或20分钟，以使所述异种脱细胞神经移植物表面及内部完全浸润。
上述的制备方法中，步骤(2)中，所述冷冻干燥之前所述方法还包括预冻的步骤；
所述预冻的温度可为-10℃～-45℃，具体可为-10℃～-40℃、-10℃、-20℃、-30℃或-40℃，时间可为1小时～12小时，具体可为3～6小时、3小时、4小时或6小时；
所述冷冻干燥的温度为-10℃～-45℃，具体可为-10℃～-30℃、-10℃、-50℃、-20℃或-30℃，时间可为6小时～12小时，具体可为6小时～10小时、6小时、8小时或10小时。
经所述预冷和冷冻干燥，将所述亲水性高分子包覆于所述异种脱细胞神经移植物的表面，具有多孔海绵状结构，且结合牢固、分布均匀。在植入体内后，该防粘连高分子层可转变为凝胶层附着在脱细胞神经表面，可以有效将修复部位与周围组织有效隔离，使神经再生的微循环从周围环境中独立出来，避免神经轴突错误生长及周围增殖的瘢痕组织侵入。所采用的亲水性高分子为可降解天然高分子，具备促进血纤蛋白溶解、促进间皮细胞增生、促进伤口愈合、抑制成纤维细胞生长和增殖等作用，是理想的防粘连材料。将天然高分子制备成多孔海绵结构附着于表面，使异种脱细胞神经移植物具有良好的预防组织粘连功能。
上述的制备方法中，步骤(2)中，所述灭菌处理采用下述1)-2)中任一种方式：
1)环氧乙烷灭菌
2)钴-60或电子束辐照灭菌，辐照剂量可为10～15Kgy，具体可为12～15Kgy、12Kgy、13Kgy或15Kgy；
上述灭菌方式可以降低对所得产物的降解性能的破坏。
上述方法制备得到的预防组织粘连的异种脱细胞神经移植物也属于本发明的保护范围，其可应用于周围神经缺损的修复中。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明防粘连异种脱细胞神经移植物，来源广泛、价格低廉，同时无免疫原性、生物相容性好、使用安全；完整保留了周围神经细胞外基质的微结构，为神经轴突再生、恢复神经传导功能提供天然的管道支架和营养环境。
(2)防粘连高分子层通过浸渍溶液的方法与异种脱细胞神经相结合，并通过冷冻干燥的方法成型，二者之间结合牢固。操作简单灵活，并且可通过改变高分子浓度、浸渍时间、冻干参数来调节高分子层的厚度和孔隙率，进而控制防粘连高分子层的形态结构。
(3)防粘连高分子层在植入体内后可转变为凝胶层附着在脱细胞神经表面，能够很好地起到防止异种脱细胞神经与周围组织粘连的作用。
(4)防粘连高分子层的组成为可降解的天然亲水性高分子，无毒、无刺激、生物相容性好。其中，透明质酸钠、羧甲基壳聚糖、羧甲基甲壳质、羧甲基纤维素除促进组织修复外，还能抑制成纤维细胞生长和增殖。通过成分的优选，可以增强神经修复和防粘连的效果。
(5)异种脱细胞神经经过冷冻干燥处理后水分含量极低，性能稳定，可以实现无保护液、室温下保存。内部浸渍的高分子溶液经冷冻干燥形成的网络结构具有支撑作用，能够维持脱细胞神经原有的骨架结构。
附图说明
图1是本发明预防组织粘连的异种脱细胞神经移植物的结构示意图，其中1表示异种脱细胞神经，2表示多孔天然高分子防粘连海绵层。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的异种脱细胞神经移植物是按照如下方法制备的：
取健康哺乳动物周围神经，利用中国发明专利申请CN106139250A中公开的脱细胞工艺处理后，即得到异种脱细胞神经移植物。
实施例1：
1、室温下，将2g透明质酸钠(重均分子量为30万)加入100mL纯化水中，磁力搅拌8h至其完全溶解，得到质量分数为2％的透明质酸钠水溶液。
2、将异种脱细胞神经移植物整体浸入上述透明质酸钠水溶液中，浸渍时间为10分钟，使脱细胞神经表面及内部充分浸润溶液。
3、将浸渍有透明质酸钠溶液的异种脱细胞神经移植物取出，-10℃预冻6小时，之后在-20℃下冷冻干燥10h。
4、将冻干产物进行钴-60辐照灭菌(辐照剂量为13KGy)，无菌封装，即得到含有透明质酸钠的防粘连异种脱细胞神经移植物产品，其示意图如图1所示。
本实施例制备的产品中，附着于异种脱细胞神经移植物表面的透明质酸钠层的厚度为0.3mm。
实施例2：
1、室温下，将1g羧甲基壳聚糖(重均分子量为70万)加入100mL纯化水中，磁力搅拌4h至其完全溶解，得到质量分数为1％的羧甲基壳聚糖水溶液。
2、将异种脱细胞神经移植物整体浸入上述羧甲基壳聚糖水溶液中，浸渍时间20分钟，使脱细胞神经表面及内部充分浸润溶液。
3、将浸渍有羧甲基壳聚糖溶液的异种脱细胞神经移植物取出，-30℃预冻3小时，之后-15℃下冷冻干燥6h。
4、将冻干产物进行环氧乙烷灭菌，无菌封装，即得到含有羧甲基壳聚糖的防粘连异种脱细胞神经移植物，其示意图如图1所示。
本实施例制备的产品中，附着于异种脱细胞神经移植物表面的羧甲基壳聚糖层的厚度为0.5mm。
实施例3：
1、室温下，将1.5g羧甲基纤维素(重均分子量为50万)加入100mL纯化水中，磁力搅拌6h至其完全溶解，得到质量分数为1.5％的羧甲基纤维素水溶液。
2、将异种脱细胞神经移植物整体浸入上述羧甲基纤维素水溶液中，浸渍时间15分钟，使脱细胞神经表面及内部充分浸润溶液。
3、将浸渍有羧甲基纤维素溶液的异种脱细胞神经移植物取出，-20℃预冻4小时，之后-10℃下冷冻干燥6h。
4、将冻干产物进行电子束辐照灭菌(辐照剂量为15KGy)，无菌封装，即得到含有羧甲基纤维素的防粘连异种脱细胞神经移植物产品，其示意图如图1所示。
本实施例制备的产品中，附着于异种脱细胞神经移植物表面的羧甲基纤维素层的厚度为0.7mm。
实施例4：
1、室温下，将2.5g羧甲基淀粉(重均分子量为40万)加入100mL纯化水中，磁力搅拌6h至其完全溶解，得到质量分数为2.5％的羧甲基纤维素水溶液。
2、将异种脱细胞神经移植物整体浸入上述羧甲基淀粉水溶液中，浸渍时间15分钟，使脱细胞神经表面及内部充分浸润溶液。
3、将浸渍有羧甲基淀粉溶液的异种脱细胞神经移植物取出，-40℃预冻4小时，之后-30℃下冷冻干燥6h。
4、将冻干产物进行钴-60辐照灭菌(辐照剂量为12KGy)，无菌封装，即得到含有羧甲基淀粉的防粘连异种脱细胞神经移植物产品，其示意图如图1所示。
本实施例制备的产品中，附着于异种脱细胞神经移植物表面的羧甲基淀粉层的厚度为1.0mm。
实施例5：
选用健康成年犬为实验动物，以右腿坐骨神经为缺损模型，缺损距离为3cm。以实施例2制备得到的产品为实验品，分为防粘连脱细胞神经修复组(A组)、自体神经移植组(B组)、神经缺损对照组(C组)，分别进行暴露术部、桥接神经和缝合。术后1个月、2个月和4个月，分三个时间点对三组实验动物进行观察，大体观察坐骨神经及周围组织，根据神经与周围组织形态学观察整体粘连程度评级分类，进行统计评价。并在对坐骨神经行电生理检查后，对坐骨神经组织于光镜及透射电镜下观察。
术后三组实验犬均存活，进食、饮水均正常，无感染。6天左右实验犬患侧伤口基本愈合，三组实验犬实验侧下肢坐骨神经切断后，均渐出现手术侧足部红肿、溃疡的发生及跋行。2个月后A组和B组运动功能均有不同程度的恢复，A组的足部溃疡明显较组愈合快。术后4个月，C组实验犬神经再生修复效果不佳，足部及小腿长期红肿、溃疡不愈合，A组和B组实验犬神经功能开始恢复，小腿肌肉肌力部分恢复，右后肢能够站立，A组运动功能恢复明显好于B组。经解剖观察，B组神经与周围组织粘连重，神经活动度差，取材点神经已经与周围肌肉组组织完全粘合，分离困难；A组修复段神经与周围组织界限清楚，有少量细丝样粘连，粘连组织较易分离，神经活动不受限，表面包裹的防粘连高分子植入体内后所形成的凝胶层在神经上包裹较好，材料与周围肌肉组织很容易分离，没有明显的粘连迹象。术后A组坐骨神经诱发电位的波幅的恢复率比B组较高，且差异有显著性意义。经组织学切片观察，A组再生纤维排列较整齐，神经内无明显结缔组织增生，B组的神经外高分子层较厚，成纤维细胞和大量纤维组织形成，缺损处结缔组织增生明显。
由上述实验结果可以看出，本发明防粘连异种脱细胞神经移植物具有良好的组织相容性，在用于实验犬坐骨神经缺损的修复时具有良好的促再生效果，并且能够有效预防神经与周围组织发生粘连。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限制。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或改进，凡是在本发明的精神和原则的前提下所作的任何变化和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。