一种肺腺癌的诊治靶标的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种肺腺癌的诊治靶标，具体的所述靶标为linc00858。

背景技术：

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。在世界范围内，肺癌的发病率明显升高，其发病率已经位于男性各种肿瘤的首位，而女性肺癌的发病率也明显增高，至今，肺癌已成为全世界癌相关性死亡的主要原因。在中国，肺癌的发病率逐年快速上升，在过去的几十年里，肺癌死亡率增加了465％，其死亡率在城市中居首位，在农村中位于第二位。在所有的肺癌中，非小细胞肺癌占75-80％，而肺腺癌是非小细胞肺癌的主要类型。尽管临床和实验肿瘤学均取得了许多新的进展，但是肺癌的预后仍不如人意，5年生存率只有约11％。造成肺癌高死亡率的主要原因是患者确诊时肿瘤细胞通常已发生了侵袭和转移，缺乏有效的治疗措施。因此，为了给肺癌患者提供有效的治疗策略，提高肺癌患者的生存率，必须积极寻找有效的早期诊断标志物。

lncrna是一类长度超过200bp核苷酸的非编码rna，有时长度可以达到100kb。很多已识别的lncrna转录自rna聚合酶ii，并含有典型的多聚腺苷酸化信号。研究显示lncrna以多种方式在基因调控中起到重要作用，主要有以下几种方式:1、lncrna作用于染色质修饰调节因子，调控染色质的形成、印记及沉默；2、lncrna作为增强子rna，参与基因活化，调控基因的表达；3、lncrna以多种方式与染色质互相结合，作为特定的生物学信号；4、lncrna诱捕调控蛋白阻止其调控功能；5、lncrna结合多种蛋白质使其形成分散的复合体，发挥特定的生物学功能；6、lncrna作为介导，参与部分生物学过程。

虽然lncrna被认为参与到细胞的生长过程、生物调节、细胞死亡及多细胞生物的生长等各项生物过程中，并被证实在细胞周期的调控，凋亡信号的传导，以及肿瘤相关基因的抑制和激活过程中发挥了巨大的作用，但是在肺癌相关的lncrna研究中，目前也仅有一种malat-1被发现。

人类对于incrna的认识才刚刚起步，目前针对lncrna的研究多数还停留在发现和寻找疾病相关性lncrna的阶段，对于lncrna在生物学过程中起到具体作用的研究还非常少。而且，由于lncrna本身并不编码蛋白质，它在生物学过程中的调控作用往往是通过调控基因的甲基化水平、染色体修饰、参与蛋白质招募、基因沉默等分子生物学调控过程来来间接实现其生物学功能，更增添了incrna研究的难度。因此，寻找肺癌相关的其他关键lncrna，并了解他们的结构特点，生物学特征，对肺腺癌的机制探究与临床治疗都具有重大的意义。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供linc00858在肺腺癌诊治中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种linc00858基因的用途，用于制备预防或治疗肺腺癌的药物组合物。

进一步，所述药物组合物包括linc00858的下调剂。所述下调剂选自：以linc00858或其转录本为靶序列、且能够抑制linc00858基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shrna(小发夹rna)、小干扰rna(sirna)、dsrna、微小rna、反义核酸，或能表达或形成所述shrna、小干扰rna、dsrna、微小rna、反义核酸的构建物。

进一步，所述的下调剂选自下组序列的sirna：seqidno.8、seqidno.9。

本发明提供了一种用于预防或治疗肺腺癌的linc00858的下调剂，所述下调剂选自下组序列的sirna：seqidno.8、seqidno.9。

本发明提供了一种用于预防或治疗肺腺癌的药物组合物，所述药物组合物含有：

上面所述的linc00858的下调剂；和

药学上可接受的载体。

本发明提供了一种linc00858基因的用途，用于筛选预防或治疗肺腺癌的潜在物质。

本发明提供了一种筛选预防或治疗肺腺癌的潜在物质的方法，所述方法包括：

用候选物质处理表达或含有linc00858基因的体系；和

检测所述体系中linc00858基因的表达；

其中，若所述候选物质可降低linc00858基因的表达或活性，(优选显著降低，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，则表明该候选物质是预防或治疗肺腺癌的潜在物质。所述体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

所述候选物质包括但不限于：针对linc00858基因或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物等。

本发明提供了一种linc00858基因的用途，用于制备诊断肺腺癌的产品。

进一步，所述产品包括芯片、制剂、或试剂盒。

进一步，所述芯片包括特异性识别linc00858的探针；所述试剂盒包括特异性扩增linc00858的引物或特异性识别linc00858的探针或芯片。

较佳的，所述的特异性扩增linc00858基因的引物是引物对，序列如seqidno.2和seqidno.3所示。

附图说明

图1是利用qpcr检测linc00858基因在肺腺癌组织中的表达情况图；

图2是利用qpcr检测linc00858在肺腺癌细胞中的转染情况图；

图3是用cck-8法检测linc00858基因对肺腺癌细胞增殖的影响图；

图4是用流式细胞仪检测linc00858基因对肺腺癌细胞凋亡的影响图；

图5是利用transwell小室检测linc00858对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响图；其中图a是linc00858对肺腺癌细胞迁移的影响图；图b是linc00858对肺腺癌细胞侵袭的影响图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量方法，采用目前覆盖数据库最广的lncrna芯片，检测肺腺癌标本中lncrna在肿瘤组织和癌旁组织的表达，发现其中具有明显表达差异的lncrna片段，探讨其与肺腺癌的发生之间的关系，从而为肺腺癌的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了肺腺癌中linc00858显著性上调。实验证明，通过降低linc00858的表达水平，能够有效地抑制肺腺癌细胞的生长和侵袭，提示检测linc00858基因的表达水平可成为肝癌早期诊断的辅助诊断指标之一，干扰linc00858基因表达可成为肺腺癌治疗的新途径。

linc00858基因

linc00858是位于人10号染色体长臂2区上，一种代表性的人linc00858基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。本发明中的linc00858包括野生型、突变型或其片段。

本发明的人linc00858核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的靶标基因的任何特定变体的基因表达进行定量。如果当核酸或其片段与其它核酸(或其互补链)最佳比对时(具有适当的核苷酸插入或缺失)，在至少大约60％的核苷酸碱基、通常至少大约70％、更通常至少大约80％、优选至少大约90％、及更优选至少大约95-98％核苷酸碱基中存在核苷酸序列相同性，则这两个序列是“基本同源的”(或者基本相似的)。

或者，当核酸或其片段与另一核酸(或其互补链)、一条链或其互补序列在选择性杂交条件下杂交时，则其间存在基本同源或(相同性)。当杂交比特异性整体丧失发生更具选择性时，存在杂交选择性。典型地，当在至少大约14个核苷酸的一段序列存在至少大约55％相同性、优选至少大约65％、更优选至少大约75％及最优选至少大约90％相同性时，发生选择性杂交。如本文所述，同源对比的长度可以是较长的序列节段，在某些实施方案中通常为至少大约20个核苷酸，更通常为至少大约24个核苷酸，典型为至少大约28个核苷酸，更典型为至少大约32个核苷酸，及优选至少大约36或更多个核苷酸。

因此，本发明的多核苷酸与seqidno.1优选具有至少75％、更优选至少85％、更优选至少90％同源性。更优选地，存在至少95％、更优选至少98％同源性。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

下调剂和药物组合物

基于本发明人的发现，本发明提供了一种linc00858的下调剂的用途，用于制备抑制肺腺癌的药物组合物。如本文所用，所述的linc00858的下调剂包括但不限于抑制剂、拮抗剂、阻滞剂、阻断剂、核酸抑制物等。

所述的linc00858的下调剂是指任何可下调linc00858基因的表达、或抑制linc00858基因的转录的物质，这些物质作为对于下调linc00858有用的物质，可用于预防或治疗肺腺癌。

作为本发明的一种优选方式，所述linc00858的下调剂是一种linc00858特异性的小干扰rna分子。如本文所用，所述的“小干扰rna”是指一种短片段双链rna分子，能够以同源互补序列的mrna为靶目标降解特定的mrna，这个过程就是rna干扰(rnainterference)过程。小干扰rna可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链rna复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链rna复合物。

在筛选有效的sirna序列时，本发明人通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种sirna序列，并将它们分别通过转染试剂转染肺腺癌细胞系进行验证，选出干扰效果最佳的sirna，它们分别具有seqidno.8、seqidno.9所示的序列，进一步地在细胞水平实验，结果证明对于细胞试验而言抑制效率非常高。

作为本发明的一种可选方式，所述的linc00858的下调剂也可以是一种“小发夹rna(smallhairpinrna，shrna)”，其是能够形成发夹结构的非编码小rna分子，小发夹rna能够通过rna干扰途径来抑制基因的表达。如上述，shrna可以由双链dna模板来表达。双链dna模板被插进一个载体，例如质粒或病毒载体，然后在体外或体内连接到一个启动子进行表达。shrna在真核细胞内dicer酶的作用下，可被切割成小干扰rna分子，从而进入rnai途径。“shrna表达载体”是指一些本领域常规用于构建shrna结构的质粒，通常该质粒上存在“间隔序列”以及位于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列，从而人们可以将shrna(或类似物)相应的dna序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列，该dna序列转录后的rna可形成shrna(shorthairpin)结构。所述的“shrna表达载体”目前已经完全可以通过商购的途径购买获得，例如一些病毒载体。

本发明的核酸抑制物如sirna可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链rna之后进行制备。sirna等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

药物组合物

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的所述的linc00858的下调剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于抑制肺腺癌。任何前述的linc00858的下调剂均可用于组合物的制备。

如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。下调剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的linc00858基因的下调剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞(宿主细胞)转染试剂。

本发明可以采用用本领域熟知的多种方法来将所述的下调剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。

优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将linc00858的下调剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带linc00858的下调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或sirna或shrna)递送到靶点上，并使之表达活性的linc00858下调剂，具体情况需视所述的下调剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

术语“宿主细胞”可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho、cos、或293细胞的动物细胞等。

用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

本发明中的药物组合物包括linc00858的下调剂、和/或与所述下调剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

本发明的药物组合物还可与其他治疗肺腺癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

本发明的药物组合物还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

药物筛选

本发明提供了一种筛选预防或治疗肺腺癌药物的方法，即：

在实验组中，向细胞培养体系中加入待测化合物，并测定linc00858的表达水平；在对照组中，向同样的培养体系中不加入待测化合物，并测定linc00858的表达水平；其中，如果实验组中linc00858的表达水平大于对照组，则说明该候选化合物为linc00858的下调剂。

在本发明中，所述的方法还包括：对上面步骤获得的候选化合物进一步测试其抑制肝癌的效果，若测试化合物对肺腺癌有显著的抑制效果，则说明该化合物为预防或治疗肺腺癌的潜在物质。

芯片、试剂盒

本发明的所述的lncrna芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于linc00858所示的部分或全部序列。

具体地，可根据本发明所述的lncrna，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

本发明中针对linc00858基因的寡核苷酸探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

本发明中所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如包括但不限于塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。

所述的linc00858芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dt串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的lncrna芯片。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测linc00858的表达。优选的，所述的制剂或试剂盒中还含有用于标记rna样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取rna、pcr、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

本发明中，术语“样本”以其最广泛的含义使用。在一种含义中，意在包括从任何来源获得的标本或培养物，以及生物和环境样本。生物样本可获自动物(包括人)并涵盖液体、固体、组织和气体。生物样本包括血液制品，诸如血浆、血清等。然而，此类样本不应解释为限制适用于本发明的样本类型。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与肺腺癌相关的基因标志物

1、样品收集

各收集8例肺腺癌癌旁组织和肺腺癌组织样本。肺腺癌肿瘤组织标本取材部位为主要肿瘤区域，位于肿瘤肿块中外1/3与正常组织交接处，排除肿瘤中心明显坏死、钙化部分以及肿瘤外围正常肺组织；癌旁正常肺组织标本取自肿瘤边缘5cm以上的部位，肉眼观察无明显变化。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、rna样品的制备(利用e.z.n.a.mirnakit进行操作)

在研钵中导入液氮，取上述获得的组织放入研钵中，在液氮中剪碎并研磨成粉末，剪碎后投入液氮中并研磨至粉末状，随后转入玻璃匀浆器中；组织匀浆在玻璃匀浆器中加入trizol试剂，在冰上研磨组织。将匀浆后组织匀浆液转入无rna酶的ep管中，室温下静置5min。按照试剂盒中的说明书提取分离rna。具体如下：

1)rna的分离：

在ep管中加入0.2ml氯仿，盖紧ep管盖，手动剧烈振荡15s，使其充分混匀。室温下孵化5min。然后在4℃下以14000g离心15min。离心后样品分为三层，rna存在于上层水相中。

2)rna沉淀

将分离得的水相取450μl移至新的无rna酶的ep管中，按照1:1的比例加入450μl异丙醇，上下颠倒混匀后在室温下孵化10min，4℃14000g离心10min。

3)rna洗脱

离心后小心移去上清，加入1ml75％乙醇(灭酶处理，现用现配并在冰上预冷)冲洗rna，随后4℃7500g离心5min。

4)rna再溶解

小心移去洗涤之后的上清，在超净工作台中打开ep管管盖，在室温下放置rna样本5-10min，晾干。加入无rna酶处理水20-50μl，55-60℃水浴箱中水浴10min。

5)rna样品的质量分析

分光光度计检测：

nanodrop1000分光光度计检测rna样品，rna-seq测序的样品要求：od260/od280为1.8-2.2。

琼脂糖凝胶电泳检测：

将上述提取的rna进行琼脂糖凝胶电泳，agilenttechnologies2100bioanalyzer检测rna样品质量，观察28srrna和18srrna主带明显、无降解、rna完整性指数合格、浓度达到要求，可以用于芯片的lncrna表达谱及筛选实验。

3、逆转录和标记

用lowrnainputlinearamplificationkit将mrna逆转录成cdna，同时用cy3分别标记实验组和对照组。

4、杂交

基因芯片采用康城生物-humanlncrnaarray，按芯片使用说明书的步骤进行杂交。

5、数据分析

利用agilentgenespring软件对芯片结果进行分析，筛选表达量具有显著性差异(标准为该lncrna在癌与癌旁的表达量相差2倍以上，而且p<0.05)的lncrna。

6、结果

结果显示，linc00858在肺腺癌组织中的表达量显著高于癌旁组织中的表达量。

实施例2qpcr测序验证linc00858基因的差异表达

1、对linc00858基因差异表达进行大样本qpcr验证。按照实施例1中的样本收集方式选择肺腺癌癌旁组织和肺腺癌组织各50例。

2、rna提取步骤如实施例1所述。

3、逆转录

1)反应体系：

rna模板1μl，随机引物1μl，双蒸水加至12μl，混匀，低转速离心，65℃5min，然后放在冰上冷却。

继续在12μl反应液中加入下列成分：

5×反应缓冲液4μl，rna酶抑制剂(20u/μl)1μl，10mmdntp混合液2μl，amv反转录酶(200u/μl)1μl；充分混匀并进行离心处理；

2)逆转录反应条件

25℃5min，42℃60min，70℃5min。

3)聚合酶链反应

引物设计：

根据genebank中linc00858基因和gapdh基因的编码序列设计qpcr扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：

linc00858基因：

正向引物为5’-gccgaatcctactaacaa-3’(seqidno.2)；

反向引物为5’-gtggtatctggacttctg-3’(seqidno.3)。

gapdh基因：

正向引物为5’-aatcccatcaccatcttccag-3’(seqidno.4)；

反向引物为5’-gagccccagccttctccat-3’(seqidno.5)。

配制pcr反应体系：

2×qpcr混合液12.5μl，基因引物2.0μl，反转录产物2.5μl，ddh2o8.0μl。

pcr反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×40个循环，60℃5min延伸反应。75℃至95℃，每20s升温1℃，绘制溶解曲线。以sybrgreen作为荧光标记物，在lightcycler荧光定量pcr仪上进行pcr反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量。

5、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss18.0统计软件来进行统计分析的，癌与癌旁组织的配对比较采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图1所示，与肺腺癌癌旁组织相比，linc00858在肺腺癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(p<0.05)，同芯片检测结果一致。

实施例3linc00858基因的沉默

1、细胞培养

人肺腺癌细胞株a549，以含10％胎牛血清和1％p/s的rpmi1640培养基在37℃、5％co2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含edta的胰蛋白酶常规消化传代。

将培养瓶中的细胞用胰酶进行消化并接种在6孔板中，保证细胞数为2-8×10⁵个/孔，加入细胞培养基。过夜，第二天观察细胞密度，细胞密度为70％以上可进行转染。

2、sirna的设计

阴性对照sirna序列(sirna-nc)：

正义链为5’-uucuccgaacgugucacgu-3’(seqidno.6)

反义链为5’-acgugacacguucggagaa-3’(seqidno.7)

sirna-1：

正义链为5’-auauguguguaaagacaacuc-3’(seqidno.8)

反义链为5’-guugucuuuacacacauauac-3’(seqidno.9)

sirna-2：

正义链为5’-uacacuaaaggaaugucucuc-3’(seqidno.10)

反义链为5’-gagacauuccuuuaguguauc-3’(seqidno.11)

3、转染

将实验分为三组：对照组(a549)、阴性对照组(sirna-nc)和实验组(sirna1、sirna2)，其中阴性对照组sirna与linc00858基因的序列无同源性，浓度为20nm/孔，同时分别进行转染。

4、qpcr检测linc00858基因的转录水平

4.1细胞总rna的提取

1)将6孔板中的细胞培养液倒掉，用pbs冲洗两次，各孔加入1mltrizol试剂，室温放置5min。

2)加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，4℃，12000g离心15min。

3)水相转移到新管中，加入4.5ml异丙醇，室温放置10min；4℃，10000g离心10min。

4)倒掉液体，用lml的75％乙醇洗ep管壁。4℃，7500g，离心5min。

5)倒掉清洗后的75％乙醇，室温晾置5-10min。

6)加入25μl无rna酶的depc水，-70℃保存。

4.2逆转录步骤同实施例2。

4.3qpcr扩增步骤同实施例2。

5、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss18.0统计软件来进行统计分析的，linc00858基因实验组与对照组之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图2显示，与非转染组与转染sirna-nc组相比，实验组中的linc00858的表达水平显著降低，差异具有统计学意义(p<0.05)。

实施例4linc00858基因对肺腺癌细胞增殖的影响

采用cck-8实验检测linc00858基因对肺腺癌细胞增殖能力影响。

1、细胞培养与转染步骤同实施例3，转染后6h换液，放置细胞培养箱过夜。

2、第二天将细胞取出，显微镜下观察细胞生长情况，1ml/孔加入含edta的胰酶，进行细胞消化，待消化完成后去除胰酶，加入细胞培养基混匀使细胞悬浮，然后进行细胞计数。

3、将细胞悬液浓度稀释为15000个/ml，之后往96孔板中进行接种，每孔加入细胞悬液200μl，细胞控制在3000个左右，接种8个复孔。设置sirna-1实验组和sirna-nc对照组。共铺4块96孔板分别用于24h、48h、72h、96h4个检测时间点。

4、24h后，将第一块96孔板取出，每孔中加入10μl的cck-8检测液，将96孔板继续放入细胞培养箱中孵育4h左右，用酶标仪检测各孔在450nm波长处的吸光度值并记录数据。

5、在48h、72h、96h后分别重复步骤4中的操作，最后统计出各时间点的吸光度值，作出生长曲线图。

6、统计学分析

实验都是按照重复3次来完成的，采用spss18.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。

7、结果

结果如图3所示，与对照相比，实验组在转染sirna-1后，细胞的增殖明显受到了抑制，差异具有统计学意义(p<0.05)说明linc00858具有促进细胞增殖的作用。

实施例5linc00858基因对肺腺癌细胞凋亡的影响

使用流式细胞仪检测linc00858基因对细胞凋亡的影响。

1、细胞培养步骤同实施例3。

2、细胞转染步骤同实施例3。

3、步骤

1)将3ml10×上样缓冲液用27ml蒸馏水稀释。

2)收集细胞样本并用预冷的pbs清洗。

3)将细胞加入lml1×上样缓冲液，300g离心10min，吸出缓冲液。

4)再次加入lml1×上样缓冲液，将细胞悬液中细胞浓度调整为1×10⁶个/ml。

5)将细胞悬液取出100μl，加入ep管中。

6)将5μl的annexinvfitc加入ep管中，混匀ep管中的液体，在室温下避光孵育10min。

7)向ep管中加入5μlpi染液，在室温下避光5min。

8)在ep管中加入500μl的pbs溶液，轻轻混匀，1h内上流式细胞仪进行检测。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用的t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。

4、结果：

结果如图4所示，实验组与对照组相比，细胞凋亡率无显著的变化(p<0.05)，该结果说明，linc00858对肺腺癌细胞的凋亡无明显的影响。

实施例6细胞迁移及侵袭实验

1、transwell小室制备

无菌条件下matrigel冰浴融化，用pbs进行20倍稀释，以50μl/孔的体积铺在transwell小室的聚碳酸酯膜上。37℃放置4h，待matrigel胶聚合成凝胶后取出，轻轻吸出上层析出液。每孔中加入50μl的含bsa的无血清培养液对基底膜进行水化处理，37℃放置30min。

2、配置细胞悬液

细胞撤血清饥饿处理12-24h，对细胞进行消化处理，终止消化后进行离心，去除上层培养液。用pbs对沉淀细胞进行清洗，加入含有bsa的无血清培养基对其进行重悬。调整细胞的密度至5×l0⁵个/ml。

3、细胞接种

取细胞悬液200μl(迁移实验为100μl，侵袭实验为200μl)加入到transwell小室中。在24孔板下室加入500μl含fbs的1640培养基。把细胞放入细胞培养箱中培养24h。

4、染色

细胞在培养结束后使用dapi染色。把小室细胞先用pbs漂洗2遍，放入dapi工作液中室温染色5-20min。用pbs漂洗2遍，放入荧光显微镜下观察并计数。

5、结果

结果如图5所示，在肺腺癌细胞转染干扰rna之后，与对照组相比，实验组的迁移及侵袭能力均有明显下降，结果说明linc00858能够促进肺腺癌的迁移及侵袭。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

sequencelisting

<110>河北医科大学第四医院

<120>一种肺腺癌的诊治靶标

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