一种用于治疗心脑血管疾病的药物及其质量检测方法与流程

技术领域

本发明涉及一种银杏内酯组合物及其应用，具体来是基于组分结构的银杏内酯固体分散体制备及其动态质量控制方法。

背景技术：

银杏树为我国古老树种之一，银杏(Ginkgoaceae)作为我国传统中药已有上千年的历史。随着现代中药制剂的发展，银杏内酯成为制备银杏制剂的重要原料药。银杏总内酯中的主要活性成分包括银杏内酯A(GA)、银杏内酯B(GB)、银杏内酯C(GC)以及白果内酯(BB)，其中在天然银杏叶中A含量最高，而药理效应最强的是银杏内酯B，它可以选择性拮抗由血小板活化因子诱导的血小板聚集，可有效防止血小板聚集和血栓的形成，银杏内酯组分对心脑血管性疾病具有很好的治疗作用。

目前大多银杏制剂多以银杏内酯B为原料药，忽视了银杏内酯组分的应用。仅用单成分银杏内酯B作为生产银杏制剂的原料药是不甚科学的。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种银杏内酯组合物。

本发明的另一目的在于提供一种用于治疗心脑血管疾病的药物。

本发明的又一目的在于提供上述银杏内酯组合物在制备治疗心脑血管疾病的药物中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种银杏内酯组合物，其特征在于所述的组合物包含银杏内酯A和银杏内酯B两种活性组分，银杏内酯A和银杏内酯B的重量比为1：2～9。

上述组合物中银杏内酯A和银杏内酯B的含量≥90％。

一种用于治疗心脑血管疾病的药物，该药物以上述的银杏内酯组合物为主要有效成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制成药学上允许的剂型。

所述的剂型为丸剂、散剂、胶囊、片剂、颗粒剂、注射、复方制剂或固体分散体；优选为固体分散体。

所述的固体分散体是以所述的银杏内酯组合物为主要有效成分，以壳聚糖为载体制成，所述银杏内酯组合物和载体的重量比为1：5～15，优选为1：10。

所述固体分散体的制备方法为：分别将壳聚糖和银杏内酯组合物溶解于乙醇中，超声溶解30～90min后，将壳聚糖的乙醇溶液和银杏内酯组合物的乙醇溶液混匀，继续超声溶解30～90min，将混合液蒸发至乙醇完全挥干后得固体分散体。本发明所述固体分散体的制备方法并不仅限于上述制备方法，也可以采用现有技术中的其他的制备方法来制备固体分散体。但是本发明所述的方法操作更为简单、成本更低，所制备的固体分散体可提高银杏内酯组合物的体内生物利用度，可提高药效。

所述的壳聚糖优选为壳聚糖3000。

上述的银杏内酯组合物在制备治疗心脑血管疾病药物中的应用。

上述的银杏内酯组合物或上述固体分散体药物的质量控制方法，包括以下步骤：

(1)制备对照品溶液：分别精密称取对照品银杏内酯A和银杏内酯B，用甲醇溶解，得到系列对照品溶液，系列对照品溶液中银杏内酯A和银杏内酯B浓度范围分别为：银杏内酯A10.14～253.5μg·mL^-1；银杏内酯B12.66～316.5μg·mL^-1；

(2)制备供试品溶液：称取上述的银杏内酯组合物制成溶液，将所得的溶液滤过，取续滤液作为供试品溶液；或者称取上述的药物制成溶液，将所得的溶液滤过，取续滤液作为供试品溶液；

色谱条件为：Agilent SB-C18柱(4.6×150mm，5μm)；流动相：甲醇-水(28∶72)；柱温35℃；流速1.0mL·min；蒸发光散射检测器ELSD，检测参数：蒸发口温度105℃，雾化口温度70℃，漂移管温度30℃，载气流速:2.8L/min。

本发明通过药效学证明银杏内酯A和银杏内酯B在一定配比范围内其药理效应优于其他银杏内酯成分配比，故对银杏内酯组合物进行质量控制。有关银杏内酯的质量控制目前仅限于控制银杏内酯总体的含量，而无明确规定银杏内酯组分中各成分间比例关系及可控范围窗。为更全面控制银杏内酯制剂的质量，建立银杏内酯组分制剂中成分间配比关系的质量控制具有重要的意义。

本发明克服目前银杏制剂质量控制的缺陷，中药疗效在于多成分协同发挥药效，但是这种协同作用又不是简单的加和，模糊的总成分质量控制，不能反映出中药整体药效。不论是复方用药还是单味入药，其中都包含中药的内在结构关系。对于中药复方而言，各药味之间存在一定的量效配比关系，发明人认为从微观角度上说，这种配伍关系，实质上是组分间的量效配比关系；而对于单个组分而言，组分中以单成分协同发挥疗效为单位疗效物质基础，其更深层的意义是每个中药复方都存在自身的可量化组分结构，只有明确这个可控量化窗，才能达到最优疗效。

本发明通过药效试验，确定银杏内酯组合物的最优质量控制范围，组合物中银杏内酯A与银杏内酯B的量化比例在1:2～1:9范围内，其组分药效可以达到最优。再在明确银杏内酯物质基础量化关系的基础上，针对银杏内酯组分理化及生物药剂学性质，进行合理的剂型设计及处方优化设计，最终达到从原料药到制剂成型整个过程的动态质量控制过程。在银杏内酯组分动态质量控制过程中，由于银杏内酯紫外吸收较弱，发明人采用HPLC-ELSD同时测定银杏内酯A和银杏内酯B，进行从原料药组分到制剂成型后银杏内酯组分结构的动态质量控制方法。

本发明的技术方案的具体筛选试验过程如下：

本发明量化组分内结构比例配比的银杏内酯A和银杏内酯B的制备：

将银杏内酯组分中的银杏内酯A(GA)、银杏内酯B(GB)、银杏内酯C(GC)和白果内酯(BB)，按照以下比例组合：GA:GB:GC:BB(1:1:1:1)、GA:GB:GC(1:1:1)、GA:GB:BB(1:1:1)、GA:GC:BB(1:1:1)、GB:GC:BB(1:1:1)、GA:GB(2:1)、GA:GC(2:1)、GB:GC(2:1)、GA:GB(1:2)、GA:GC(1:2)、GB:GC(1:2)、GA:GB(1:4)、GA:GB(1:6)、GA:GB(1:9)组，每一比例组合设有5个平行小组。

将银杏内酯A(GA)、银杏内酯B(GB)、银杏内酯C(GC)和白果内酯(BB)分别溶解于DMSO中分别制成10mg/ml银杏内酯A(GA)溶液、10mg/ml银杏内酯B(GB)溶液、10mg/ml银杏内酯C(GC)溶液和10mg/ml白果内酯(BB)溶液。

配制GA:GB:GC:BB(1:1:1:1)比例组分方法为：分别取50μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯A(GA)、50μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯B(GB)、50μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯C(GC)以及50μ1浓度为10mg/ml的白果内酯(BB)混合制成体积为200μ1的混合液。

配制GA:GB:GC(1:1:1)比例组分方法为：分别取50μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯A(GA)、50μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯B(GB)以及50μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯C(GC)混合制成体积为150μ1的混合液。

配制GA:GB:BB(1:1:1)比例组分方法为：分别取50μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯A(GA)、50μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯B(GB)以及50μ1浓度为10mg/ml的白果内酯(BB)混合制成体积为150μ1的混合液。

配制GA:GC:BB(1:1:1)比例组分方法为：分别取50μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯A(GA)、50μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯C(GC)以及50μ1浓度为10mg/ml的白果内酯(BB)混合制成体积为150μ1的混合液。

配制GB:GC:BB(1:1:1)比例组分方法为：分别取50μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯B(GB)、50μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯C(GC)以及50μ1浓度为10mg/ml的白果内酯(BB)混合制成体积为150μ1的混合液。

配制GA:GB(2:1)比例组分方法为：分别取100μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯A(GA)、50μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯B(GB)混合制成体积为150μ1的混合液。

配制GA:GC(2:1)比例组分方法为：分别取100μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯A(GA)、50μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯C(GC)混合制成体积为150μ1的混合液。

配制GB:GC(2:1)比例组分方法为：分别取100μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯B(GB)、50μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯C(GC)混合制成体积为150μ1的混合液。

配制GA:GB(1:2)比例组分方法为：分别取50μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯A(GA)、100μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯B(GB)混合制成体积为150μ1的混合液。

配制GA:GC(1:2)比例组分方法为：分别取50μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯A(GA)、100μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯C(GC)混合制成体积为150μ1的混合液。

配制GB:GC(1:2)比例组分方法为：分别取50μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯B(GB)、100μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯C(GC)混合制成体积为150μ1的混合液。

配制GA:GB(1:4)比例组分方法为：分别取50μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯A(GA)、200μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯B(GB)混合制成体积为250μ1的混合液。

配制GA:GB(1:6)比例组分方法为：分别取50μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯A(GA)、300μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯B(GB)混合制成体积为350μ1的混合液。

配制GA:GB(1:9)比例组分方法为：分别取50μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯A(GA)、450μ1浓度为10mg/ml的银杏内酯B(GB)混合制成体积为500μ1的混合液。

上述不同比例配比的银杏内酯组分体外抗凝血影响：

通过选择PT、APTT、TT和FIB为药理药效指标，比较不同配比的银杏内酯组分对抗凝血作用影响，选择最优配比组分。首先，用一次性用抽血针管抽取自愿者血样70ml，分装在26支抗凝PV管中，然后离心(3000rpm,15min),得到上清液血浆50ml。血浆分为75组，每一份含血浆400μl。分别取50μl配制好的1:1:1:1的GA:GB:GC:BB；1:1:1的GA:GB:GC；1:1:1的GA:GB:BB；1:1:1的GA:GC:BB；1:1:1的GB:GC:BB；2:1的GA:GB；2:1的GA:GC；2:1的GB:GC；1:2的GA:GB；1:2的GA:GC；1:2的GB:GC；1:4的GA:GB；1:6的GA:GB；1:9的GA:GB的不同配比银杏内酯组分混合液加入到400μ1的血浆中，涡旋混匀待测。凝血酶原时间TT、活化的部分凝血活酶时间APTT、凝血酶时间TT以及纤维蛋白酶FIB的测定由江苏省中西医结合医院分析科测定。结果见表1，银杏内酯组分中以银杏内酯A和银杏内酯B配比药效较优，且其可控量化窗为1:2～1:9时，药效较好。

表1不同比例配比的银杏内酯组分体外凝血影响作用比较(n＝5)

Tab1.The comparison between of the effect of different proportion ginkgolides component on coagulant system in vitro

注：与对照组比较*P<0.05,**P<0.01.

本发明所述给予不同比例银杏内酯组分对小鼠尾动脉出血时间影响，其方法如下：

取160只小鼠,雌雄各半，随机分为16组,每组10只,实验分为:空白对照组、GA:GB:GC:BB(1:1:1:1)、GA:GB:GC(1:1:1)、GA:GB:BB(1:1:1)、GA:GC:BB(1:1:1)、GB:GC:BB(1:1:1)、GA:GB(2:1)、GA:GC(2:1)、GB:GC(2:1)、GA:GB(1:2)、GA:GC(1:2)GB:GC(1:2)、GA:GB(1:4)、GA:GB(1:6)以及GA:GB(1:9)组。按50μl/g给药，每天灌胃给药一次，连续灌胃7天。最后一次给药后30min后进行断尾实验。将小鼠固定于固定器中，在距离小鼠尾部末端1.5mm处用手术剪剪断，记录小鼠尾部持续出血时间。结果见表2，银杏内酯组分中以银杏内酯A和银杏内酯B配比药效较优，且其可控量化窗为1:2～1:9时，药效较好。

表2比较不同比例银杏内酯组分对小鼠尾动脉出血的影响(n＝5)

注：与对照组比较*p<0.05,**p<0.01

本发明所述银杏内酯组合物固体分散体制备方法如下：

分别将壳聚糖和固体银杏内酯组合物溶解于乙醇中，超声溶解后，将壳聚糖的乙醇溶液和银杏内酯组合物的乙醇溶液混匀，继续超声溶解，然后将混合液蒸发至乙醇完全挥干后得固体分散体。

详细的步骤为：

采用溶剂法制备银杏内酯组合物-壳聚糖固体分散体，分别将壳聚糖和固体银杏内酯组合物(银杏内酯A和银杏内酯B的重量比为1：2～9)溶解于乙醇中，超声溶解30～90min后，将二者混匀，继续超声溶解30～90min。将混合液置于旋转蒸发仪中，待乙醇完全挥干后，取出固体分散体粉末。优化银杏内酯组合物与壳聚糖重量比为1：5～15，最优选为1:10，在银杏内酯组合物与壳聚糖重量比为1:10时其累积溶出度最佳。

本发明所述银杏内酯组合物或固体分散体药物的质量控制方法具体如下：

本发明试验采用了HPLC-ELSD法同时测定银杏内酯组合物制剂中银杏内酯A和银杏内酯B的含量，本方法简单易行，具良好的精密度，重现性和可靠性，25min内同时测定银杏内酯组分含量，可用于银杏内酯组分制剂的质量控制。

色谱条件为：Agilent SB-C18柱(4.6×150mm，5μm)；流动相：甲醇-水(28∶72)；柱温35℃；流速1.0mL·min；蒸发光散射检测器ELSD，检测参数：蒸发口温度105℃，雾化口温度70℃，漂移管温度30℃，载气流速:2.8L/min。记录色谱图，对照品均可实现基线分离，测定均无干扰。

对照品为：银杏内酯A和银杏内酯B。

对照品溶液的制备方法为：

分别精密称取对照品：(1)5.07mg银杏内酯A，(2)6.33mg银杏内酯B，置10mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容，配制银杏内酯A和银杏内酯B质量浓度分别为507和633μg/mL的混合对照品贮备液。分别精密吸取混合对照品贮备液，再用甲醇稀释，稀释倍数分别为2、5、10、20、50，得到系列对照品溶液。浓度分别为：银杏内酯A：253.5、101.4、50.7、25.35和10.14μg/mL；银杏内酯B：316.5、126.6、63.3、31.65和12.66μg/mL。

供试品溶液的制备方法为：称取上述的银杏内酯组合物制成溶液，将所得的溶液滤过，取续滤液作为供试品溶液；或者称取上述的药物制成溶液，将所得的溶液滤过，取续滤液作为供试品溶液。

本发明设计了基于组分结构的银杏内酯制剂质量控制方法。

本发明方法与现有银杏内酯制剂质量控制方法相比进步性如下：

发明人基于中医药基础理论，对银杏内酯组分各成分进行系统分析，发现银杏内酯A和B之间具有很强的协同作用。在治疗心脑血管疾病中应用效果显著，本方法克服了目前银杏内酯制剂质量控制的缺陷，是从原料药到制剂制备过程，最终制剂成型的多维组分结构的动态控制过程，银杏内酯组合物制剂治疗心脑血管疾病的优化药效物质基础为银杏内酯A和银杏内酯B，优选可控质量窗为1∶2～1∶9。采用HPLC-ELSD方法，实现了银杏内酯制剂组分含量的同时测定，经试验表明，所测的GA与GB分离度好，线性关系，重现性，精密度，稳定性，回收率均较好。由于银杏内酯组分一般存在溶解度问题，这很可能是造成生物利用度低的一大原因之一，通过本发明的制剂剂型设计提高其体内生物利用度，提高药效。此外，通过药效试验进一步说明银杏内酯组分量化比例的合理性。

附图说明

图1银杏内酯组合物在37℃条件下不同pH值溶液中的平衡溶解度。

图2银杏内酯组合物在37℃条件下正辛醇-缓冲液中的LogP值。

图3以不同分子量壳聚糖为载体制备银杏内酯组分-壳聚糖(1:5)固体分散体累积溶出曲线

(a)壳聚糖3000-银杏内酯组合物固体分散体,ginkgolides:chitosan 5000(1:5)SD(b)壳聚糖5000-银杏内酯组合物固体分散体,(c)壳聚糖50 000-银杏内酯组合物固体分散体,(d)壳聚糖100 000-银杏内酯组合物固体分散体,ginkgolides:chitosan>100 000(1:5)SD(e)壳聚糖大于100 000-银杏内酯组合物固体分散体,ginkgolides(f)银杏内酯组合物原料.Data are presented as the mean±SEM(n＝3)。

图4不同比例银杏内酯组合物-壳聚糖固体分散体中GA的溶出度曲线。

(a)银杏内酯组合物-壳聚糖3000(1:5)固体分散体,(b)银杏内酯组合物-壳聚糖3000(1:10)固体分散体,(c)银杏内酯组合物-壳聚糖3000(1:15)固体分散体,(d)银杏内酯组合物原料药.Data are presented as mean±SEM(n＝3)。

图5不同比例银杏内酯组合物-壳聚糖固体分散体中GB的溶出度曲线。

(a)银杏内酯组合物-壳聚糖3000(1:5)固体分散体,(b)银杏内酯组合物-壳聚糖3000(1:10)固体分散体,(c)银杏内酯组合物-壳聚糖3000(1:15)固体分散体,(d)银杏内酯组合物原料药.Data are presented as mean±SEM(n＝3)。图6高剂量银杏内酯组合物原料药组、低剂量银杏内酯组合物原料药组、对照组、ISO模型组、阳性药组与高剂量银杏内酯组合物固体分散体组、低剂量银杏内酯组合物固体分散体组的SOD活性。

图7高剂量银杏内酯组合物原料药组、低剂量银杏内酯组合物原料药组、对照组、ISO模型组、阳性药组与高剂量银杏内酯组合物固体分散体组、低剂量银杏内酯组合物固体分散体组的MDA活性。

图8高剂量银杏内酯组合物原料药组、低剂量银杏内酯组合物原料药组、对照组、ISO模型组、阳性药组与高剂量银杏内酯组合物固体分散体组、低剂量银杏内酯组合物固体分散体组的LDH活性。

图9为混合对照品的色谱图。

具体实施方式

实施例1银杏内酯组合物在水中及不同pH的PBS中平衡溶解度的测定：

制备供试品溶液：配制pH分别为2.0、2.5、5.0、5.8、6.5、7.0、7.4、7.8-8.0的磷酸盐缓冲盐溶液，取过量银杏内酯A：银杏内酯B重量比为1：2的银杏内酯组合物等量分为10份分别置于具塞玻璃试管中，然后向其中一个具塞玻璃试管加入水作为空白，向其他具塞玻璃试管中分别加入pH值不同的磷酸盐缓冲盐溶液，超声至药物不再溶解制成银杏内酯组合物饱和溶液，然后放入恒温振荡器中温度保持(37±1)℃，振摇24h。将饱和溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。

制备对照品溶液：分别精密称取对照品：(1)5.07mg银杏内酯A，(2)6.33mg银杏内酯B，置10mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容，配制银杏内酯A和银杏内酯B质量浓度分别为507和633μg/mL的混合对照品贮备液。分别精密吸取混合对照品贮备液，再用甲醇稀释，稀释倍数分别为2、5、10、20、50，得到系列对照品溶液。浓度分别为：银杏内酯A：253.5、101.4、50.7、25.35和10.14μg/mL；银杏内酯B：316.5、126.6、63.3、31.65和12.66μg/mL。

色谱条件为：Agilent SB-C18柱(4.6×150mm，5μm)；流动相：甲醇-水(28∶72)；柱温35℃；流速1.0mL·min；蒸发光散射检测器ELSD，检测参数：蒸发口温度105℃，雾化口温度70℃，漂移管温度30℃，载气流速:2.8L/min。记录色谱图，对照品均可实现基线分离，测定均无干扰。

上述制备的供试品和对照品的进样量为10μL；记录时间30min。

对银杏内酯组合物中2种有效成分进行测定，计算其平衡溶解度，结果见表1和图1(银杏内酯组合物在37℃条件下不同pH值溶液中的平衡溶解度)。

表1银杏内酯组合物在37℃条件下不同pH值溶液中的平衡溶解度

结果：银杏内酯组合物溶解性差。因此，在考虑制备银杏内酯组合物制剂时，必须改善其溶解度为主，以提高其生物利用度。

实施例2银杏内酯A:银杏内酯B重量比为1：2的银杏内酯组合物油水分配系数的测定

取适量银杏内酯组合物溶解于被水饱和的正辛醇中，制成银杏内酯组合物的正辛醇饱和溶液，精密吸取该溶液分别置于10个10mL西林瓶中(2mL/瓶)，向其中一个西林瓶内加入2ml正辛醇饱和的水作为空白，向其他西林瓶内分别加入2mL不同pH值的磷酸盐缓冲溶液，放入37℃空气振荡器中，振摇24h直至平衡，取下层水相，以6000r·min^-1离心10min，按照实施例1所述的制备对照品溶液的方法和色谱条件制备对照品溶液并测定分配前正辛醇中银杏内酯组合物浓度C₀和分配后水相中的银杏内酯组合物浓度C，按照公式计算表观油水分配系数。计算公式如下：

P_app＝(C₀V₀-CV)/CV

上式中P_app为表观油水分配系数；C₀为指标成分在正辛醇中的初始浓度(μg·mL^-1)；V₀为水饱和的正辛醇体积(即2mL)；C为分配平衡时在水相中测得指标成分的浓度(μg·mL^-1)；V为水相体积(即2mL)。结果见表2和图2(银杏内酯组合物在37℃条件下正辛醇-缓冲液中的LogP值)。

表2银杏内酯组合物在37℃条件下正辛醇-缓冲液中的logP值

结果：银杏内酯组合物在不同pH下的正辛醇-缓冲液中的LogP值都在3以上，说明其渗透性良好。结合实施例1和实施例2，可以得到银杏内酯组合物按照生物药剂学分类可归为第3类组分，即低溶解性，高渗透性药物。制剂设计应该针对该性质进行改善。

实施例3基于优选组合物的银杏内酯固体分散体的制备

方法：采用溶剂法选择壳聚糖作为固体分散体载体，首先制备银杏内酯A:银杏内酯B重量比例为1：2的银杏内酯组合物和3000、5000、50000、100000及大于100000的壳聚糖比例为1:5，比较不同分子量对银杏内酯组合物溶解度影响，优选最佳分子量的壳聚糖载体。再进一步优化银杏内酯组合物与优选壳聚糖载体的重量比例(1:5、1:10、1:15)制备银杏内酯固体分散体，以溶出度为考察指标优化银杏内酯固体分散体的处方。结果见图3-5。

结果：与其他分子量壳聚糖相比壳聚糖3000可以最大程度提高银杏内酯组合物的溶解度，而且考察不同比例银杏内酯组合物和壳聚糖的固体分散体，发现银杏内酯组合物和壳聚糖重量比例1:10为最优处方，20min内银杏内酯组分的累积溶出度可以达到90％。

实施例4银杏内酯组合物固体分散体制剂的表征

方法：利用SOD、MDA及LDH生化指标考察比较银杏内酯组合物原料药高剂量组和低剂量组、银杏内酯组合物固体分散体(GSD)高剂量组和低剂量组、阳性药对照组的药效差异。

银杏内酯组合物原料药：银杏内酯A和银杏内酯B按重量比1：2混合。

银杏内酯组合物固体分散体(GSD)：分别将壳聚糖3000和银杏内酯组合物(银杏内酯A和银杏内酯B重量比为1：2)溶解于乙醇中，超声溶解45min后，将壳聚糖的乙醇溶液和银杏内酯组合物的乙醇溶液混匀，继续超声溶解45min，将混合液蒸发至乙醇完全挥干后得固体分散体。其中所述银杏内酯组合物与壳聚糖3000的重量比为1:10。

阳性对照药：普诺奈尔。

ISO建模方法：连续5天给大鼠腹腔注射盐酸异丙肾上腺素注射液(Isoprenaline Hydrochloride injection,ISO)ISO 10mg/kg方式的造模方法，可安全得到急性心肌缺血的模型大鼠。

空白对照组：正常饮食，第5天后，连续灌胃生理盐水7天。

ISO模型组：按照上述方法造模，正常饮食。

阳性药对照组：按照上述方法造模，连续灌胃2mg/kg普诺奈尔7天。

高剂量银杏内酯组合物固体分散体组(High dose GSD)：按照上述方法造模，连续灌胃高剂量(50mg/kg相当于银杏内酯组合物原料药量)银杏内酯固体分散体7天。

低剂量银杏内酯组合物固体分散体组(Low dose GSD)：按照上述方法造模，连续灌胃低剂量(10mg/kg相当于银杏内酯组合物原料药量)银杏内酯固体分散体7天。

高剂量银杏内酯组合物原料药组(High dose GK)：按照上述方法造模，连续灌胃高剂量50mg/kg银杏内酯组合物原料药7天。

低剂量银杏内酯组合物原料药组(Low dose GK)：按照上述方法造模，连续灌胃低剂量10mg/kg银杏内酯组合物原料药7天。

制备了银杏内酯组合物固体分散体释药单元，为了证明该制剂技术有效提高了其药效，本课题首先建立ISO大鼠心肌缺血模型，借助SOD、MDA和LDH生化指标，通过比较高剂量银杏内酯组合物原料药组、低剂量银杏内酯组合物原料药组、空白对照组、ISO模型组、阳性药组与高剂量银杏内酯组合物固体分散体组、低剂量银杏内酯组合物固体分散体组的药效差异，实验结果表明，银杏内酯对于心肌缺血大鼠的药效作用具有浓度依赖性，而且其固体分散体药理效应明显优于银杏内酯组合物原料药的药理药效。对注射ISO造模心肌缺血的大鼠，给药高、低剂量组的银杏内酯组合物固体分散体组(GSD)后与ISO模型组比较，其测定SOD值明显升高，MDA值明显降低，LDH值也明显下降，其变化程度与高剂量和低剂量的银杏内酯组合物原料药组比较，也明显优于其结果值。结果见图6-8。

实施例5银杏内酯组合物原料药和银杏内酯组合物固体分散体中银杏内酯A和银杏内酯B的含量测定

1.仪器与试药

Waters高效液相色谱仪，包括600四元梯度泵、717自动进样器、ELSD2000E检测器。

对照品：银杏内酯A(批号110862)购自中国药品生物制品检定所；银杏内酯B(批号110863)纯度均>98％。

供试品：银杏内酯组合物原料药(银杏内酯A:银杏内酯B重量比为1：2)；银杏内酯组合物固体分散体(载体为壳聚糖3000，银杏内酯组合物与壳聚糖3000的重量比为1:10，银杏内酯组合物中银杏内酯A和银杏内酯B重量比为1：2)。

甲醇(色谱纯，江苏汉邦科技有限公司)、Milli-Q超纯水。其余试剂为分析纯。

2.色谱条件

色谱柱：Agilent SB-C18柱(4.6×150mm，5μm)；流动相：甲醇-水(28∶72)；柱温35℃；流速1.0mL/min；蒸发光散射检测器ELSD，检测参数：蒸发口温度105℃，雾化口温度70℃，漂移管温度30℃，载气流速:2.8L/min。记录时间30min。

3.实验方法与结果

3.1供试品溶液的制备

称取1.32mg银杏内酯组合物原料药和2.47mg银杏内酯组合物固体分散体，分别置25mL量瓶中，以甲醇溶解并定容，样品滤过，取续滤液，即得供试品溶液，用于测定银杏内酯组合物含量。

3.2对照品溶液的制备：按照实施例1所述的方法制备对照品溶液。

3.含量测定方法

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，进行测定，结果见表3-5。在制剂工艺设计及制备过程中，银杏内酯组合物结构比例出现小波动的变动，而且有部分原料损耗，但是其组合物结构配比值控制在可控范围窗内，进一步说明本发明的本质。

表3银杏内酯组合物固体分散体中银杏内酯A和银杏内酯B的含量(mg/g)

注：银杏内酯组合物固体分散体的检测结果为去除壳聚糖后的计算结果。

表4制剂成型后原料损耗量比重(％)

表5制剂前后银杏内酯组合物结构比例值

实施例6含量测定方法学考察

1.线性关系

分别精密称取对照品5.07mg银杏内酯A，6.33mg银杏内酯B，置10mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容，配制银杏内酯A和银杏内酯B质量浓度分别为507和633μg/mL的作为混合对照品贮备液。分别精密吸取混合对照品贮备液，再用甲醇稀释，稀释倍数分别为2、5、10、20、50，得到系列对照品溶液。浓度分别为：银杏内酯A：253.5、101.4、50.7、25.35和10.14μg/mL；银杏内酯B：316.5、126.6、63.3、31.65和12.66μg/mL；各浓度对照品溶液分别进样10μL。用HPLC-ELSD测定峰面积，以峰面积对数lnA对进样量对数lnM作线性回归，得回归方程，见表6。

表6线性关系实验结果

2.精密度试验

精密吸取3个不同浓度对照品，分别含GA和GB浓度为50.7，63.3；25.3，31.6；12.7，15.8μg·mL^-1，按实施例1所述的色谱条件测定，每种浓度测定5次，计算日内RSD；连续测定5d，计算日间RSD。结果：其日内RSD分别为0.96％、1.53％、0.78％；日间RSD分别为2.81％、1.79％、0.75％。

3.重复性实验

取银杏内酯组合物原料药样品6份，按照实施例5所述的供试品制备方法和色谱条件制备供试品溶液并分析，结果银杏内酯A和银杏内酯B色谱峰面积的RSD分别为2.25％和2.92％。

4.稳定性实验

取“重复性试验”项下银杏内酯组合物原料药供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24h进行测定，计算峰面积的RSD，分别为2.14％和2.72％。5.加样回收率试验

精密称取同一银杏内酯组合物原料药样品9份，每份约15mg分别加入25mL量瓶中，均分为3组，每组的3个量瓶中分别加入一定量的对照品溶液(各量瓶中所添加的对照品溶液中银杏内酯A的含量分别约为1.40、1.75、3.50mg，银杏内酯B的含量分别约为2.87、3.51、7.08mg)，以甲醇溶解并定容，样品滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按照实施例5所述的色谱条件测定，进样20μL进行分析，计算各对照品的平均加样回收率，结果银杏内酯A 102.8％，RSD为2.54％；银杏内酯B为100.1％，RSD为2.59％。

综上，本发明所建立的基于银杏内酯组分固体分散体的质量控制的方法，具有一定的药效实验基础，可更有效、更全面的控制银杏内酯组分制剂的质量。