本发明涉及分子生物学和医药技术领域，具体地说，涉及dmap1py246阻断剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
原癌基因c-src是人或动物细胞中固有的正常基因，在调控细胞的生长、发育、分化和其他生物学功能方面具有重要的作用。c-src及其表达产物src蛋白是一种非受体酪氨酸蛋白激酶，通过复杂的网络途径及各种信号通路对细胞行为进行调控，参与了细胞内信号转导的过程。
dmap1为dnmt1相关蛋白。dna甲基转移酶1(dnmt1)是dna甲基转移酶(dnmt)家族的主要成员，对维持和调节肿瘤细胞全基因组和局部区域甲基化起着核心作用。dnmt1在恶性肿瘤中高表达，引起基因dna的甲基化异常，特别是抑癌基因的高甲基化，继而造成相关基因表达沉默，导致细胞的恶性生长。从细胞周期的角度来说，有报道表明dmap1对基因转录调控的影响与g1/s和g2/m检验点的调节相关；然而‘dmap1-dna甲基化-基因转录’对于细胞有丝分裂的潜在影响还尚未见报到。
bub3蛋白是一个关键的有丝分裂纺锤体检验点(spindleassemblycheckpoint)因子，可识别着丝粒元件并将其他着丝点分裂检验点分子招募到着丝点。除了对于纺锤体检验点调控的经典功能外，bub3也参与了其它细胞生物学活动如dna损伤，基因转录。bub3也被发现能与其它非纺锤体检验点蛋白结合，如转录因子tap73被报道参与了纺锤体检验点的调节。tap73作为p53家族成员蛋白，其通过对基因转录的调节具有促凋亡的功能，这与另一家族类似成员δnp73(ta结构域缺失)抗凋亡的功能截然相反；从这方面来说，bub3是否会参与到tap73基因转录调节功能中仍有待阐明。
总的来说，目前关于bub3在有丝分裂阻滞过后‘基因转录-表达’再度活化过程中的新功能以及肿瘤细胞抵抗有丝分裂压力的作用方式还未见报道。而这一机制的研究也将为肿瘤药物的开发提供重要的分子基础。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术中的不足，研究证实了重要原癌基因c-src能够磷酸化dmap1酪氨酸246位(dmap1y246)，此磷酸化增强了肿瘤细胞对于有丝分裂阻断剂的拮抗作用，并证实了dmap1y246的磷酸化与胰腺癌的发生发展和不良预后密切相关，基于此提供dmap1y246的阻断剂和检测dmap1y246磷酸化水平的试剂的新用途。
在本发明的第一方面，提供了dmap1py246阻断剂在制备细胞有丝分裂阻断剂中的应用。
在本发明的第二方面，提供了dmap1py246阻断剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
作为一种具体实施方式，所述的肿瘤为c-src异常活化或者对有丝分裂阻断剂有拮抗效应的肿瘤。
作为本发明的一个实施例，所述的肿瘤为胰腺癌。
在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包含细胞有丝分裂阻断剂和dmap1py246阻断剂。
优选地，所述的药物组合物还包含药学上的常规载体。
在本发明的第四方面，提供了检测dmap1y246磷酸化水平的试剂在制备胰腺癌诊断试剂或试剂盒中的应用。
在本发明的第五方面，提供了检测dmap1y246磷酸化水平的试剂在制备胰腺癌预后试剂或试剂盒中的应用。
作为一种具体实施方式，所述的预后具体为预测生存期。
作为本发明的一个实施例，所述的检测dmap1y246磷酸化水平的试剂为磷酸化dmap1y246特异性抗体。
本发明优点在于：
本发明发现了重要原癌基因c-src能够磷酸化dmap1(dna甲基转移酶1(dnmt1)相关蛋白)酪氨酸246位，此磷酸化增强了肿瘤细胞(胰腺癌细胞)对于有丝分裂阻断剂(紫杉醇)的拮抗作用，因此，可以此磷酸化位点为靶点开发药物，用于治疗临床上c-src异常活化以及对有丝分裂阻断剂有拮抗效应的这一类肿瘤。此外，本发明还证实了dmap1y246的磷酸化与胰腺癌的发生发展和不良预后密切相关，因此可使用检测dmap1y246的磷酸化水平的试剂来进行胰腺癌的诊断或预后。
附图说明
图1：细胞有丝分裂阻滞压力下，bub3与dmap1相互结合。a利用胸腺嘧啶脱氧核苷(2mm)双阻滞法将稳定表达flag-bub3的hpde细胞同步化在细胞间期(i)，或胸腺嘧啶脱氧核苷(2mm)双阻滞后释放8小时，再用诺考达唑(200nm)处理细胞16小时，使细胞周期阻滞在有丝分裂期(m)。分别收集处在间期和有丝分裂期的细胞，并用裂解液裂解细胞后借助特异性抗flag的抗体进行免疫沉淀实验。通过sds聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色分析免疫沉淀实验结果。b胸腺嘧啶脱氧核苷(2mm)双阻滞稳定表达flag-bub3的hpde细胞后释放8小时，随后再用诺考达唑(200nm)处理细胞16小时，使细胞周期阻滞在有丝分裂期。收集细胞，裂解后借助抗bub3的抗体进行免疫共沉淀实验。c利用小干扰rna(sirna)的方法沉默hpde细胞中的dmap1，收集细胞，裂解后借助抗bub3的抗体进行免疫共沉淀实验。d用胸腺嘧啶脱氧核苷(2mm)双阻滞和诺考达唑(200nm)处理将胰腺癌细胞panc-1和sw1990的细胞周期阻滞在有丝分裂期。随后用c-src抑制剂su6656(10μm)处理细胞1小时。收集细胞，裂解后借助抗bub3的抗体进行免疫共沉淀实验。e在hpde细胞中过表达持续活化的c-src(srcy527f)，用胸腺嘧啶脱氧核苷(2mm)双阻滞和诺考达唑(200nm)处理将细胞周期阻滞在有丝分裂期。收集细胞，裂解后借助抗bub3的抗体进行免疫共沉淀实验。f将带flag标签的bub3缺失突变体和带ha标签的dmap1共转hpde细胞，用胸腺嘧啶脱氧核苷(2mm)双阻滞和诺考达唑(200nm)处理维持细胞有丝分裂阻滞。收集细胞，裂解后借助抗flag的抗体进行免疫共沉淀实验。
图2：细胞有丝分裂阻滞压力下，bub3与dmap1相互结合。a利用胸腺嘧啶脱氧核苷(2mm)双阻滞法将稳定表达flag-bub3的hpde细胞同步化在细胞间期(i)，或胸腺嘧啶脱氧核苷(2mm)双阻滞后释放8小时，再用诺考达唑(200nm)处理细胞16小时，使细胞周期阻滞在有丝分裂期(m)。收集细胞，裂解后借助抗flag的抗体进行免疫沉淀实验。用质谱分析实验结果。b-d用胸腺嘧啶脱氧核苷(2mm)双阻滞和诺考达唑(200nm)处理维持hpde细胞有丝分裂阻滞。收集细胞，裂解后借助抗bub3的抗体进行免疫共沉淀实验(b,c)；或借助抗dmap1的抗体进行免疫共沉淀实验(d)。e利用小干扰rna(sirna)的方法沉默hpde细胞中的dnmt1，收集细胞，裂解后借助抗bub3的抗体进行免疫共沉淀实验。
图3：p38磷酸化bub3第211位丝氨酸(ser211)从而促进bub3与dmap1结合。a-d及g中，细胞被胸腺嘧啶脱氧核苷(2mm)双阻滞在间期(i)，或由胸腺嘧啶脱氧核苷(2mm)双阻滞和诺考达唑(200nm)处理阻滞在有丝分裂期(m)。a将hpde细胞同步化在细胞间期或有丝分裂期。收集细胞，裂解后借助抗bub3的抗体进行免疫共沉淀实验并用小牛肠碱性磷酸酶(cip，10units)处理免疫沉淀复合体。b将hpde细胞同步化在细胞间期或有丝分裂期。随后分别用ampk抑制剂compoundc(10μm)，jnk抑制剂sp600125(20μm)和p38抑制剂sb203580(25μm)处理细胞(1小时)。借助抗bub3的抗体进行免疫共沉淀实验。c将panc-1和sw1990细胞同步化在细胞间期或有丝分裂期。用c-src抑制剂su6656(10μm)和p38抑制剂sb203580(25μm)处理细胞(1小时)。借助抗bub3的抗体进行免疫共沉淀实验。d将hpde细胞或panc-1细胞同步化在细胞间期或有丝分裂期。收集细胞，裂解后借助抗p38的抗体进行免疫共沉淀实验。e-f在[γ-32p]atp存在的情况下利用有活性的his-p38和gst-bub3重组蛋白进行体外激酶实验。bub3211位丝氨酸(ser211)在列出的各物种中是进化保守的位点。g在hpde细胞中表达带flag标签的野生型bub3或bub3特定位点丝氨酸突变体。将细胞周期阻滞在有丝分裂期后，收集细胞用抗flag的抗体进行免疫共沉淀实验。h将纯化的带有his标签的bub3蛋白(表达野生型bub3或特定丝氨酸位点突变的bub3)与纯化的带gst标签的dmap1蛋白共孵育，同时加入具有活性的p38蛋白，随后进行gstpull-down实验。
图4：p38磷酸化bub3第211位丝氨酸(ser211)从而促进bub3与dmap1结合。a-d中，细胞被胸腺嘧啶脱氧核苷(2mm)双阻滞在间期(i)，或由胸腺嘧啶脱氧核苷(2mm)双阻滞和诺考达唑(200nm)处理阻滞在有丝分裂期(m)。a将hpde细胞同步化在细胞间期或有丝分裂期。收集细胞，裂解后借助抗bub3的抗体进行免疫共沉淀实验并用小牛肠碱性磷酸酶(cip，10units)或小牛肠碱性磷酸酶(10units)/na3vo4处理免疫沉淀复合体。b将hpde细胞同步化在细胞间期(i)或诱导有丝分裂期阻滞(阻滞6小时，标注为“s”；阻滞16小时，标注为“l”)。用图中所示的抗体分别进行免疫印迹实验。c将hpde细胞同步化在细胞间期或有丝分裂期。随后分别用ampk抑制剂compoundc(10μm)，jnk抑制剂sp600125(20μm)和p38抑制剂sb203580(25μm)处理细胞(1小时)。用图中所示的抗体分别进行免疫印迹实验。d将hpde细胞同步化在细胞间期或有丝分裂期后加入p38抑制剂sb203580(25μm)处理细胞(1小时)。用图中所示的抗体分别进行免疫印迹实验。e将hpde细胞同步化在g1期后用tgf-β刺激细胞1小时。用抗p38抗体进行免疫共沉淀实验。f用胸腺嘧啶脱氧核苷(2mm)双阻滞和诺考达唑(200nm)处理将表达野生型bub3和bub3丝氨酸突变体的胰腺癌细胞panc-1细胞周期阻滞在有丝分裂期。随后用c-src抑制剂su6656(10μm)处理细胞1小时。用抗flag的抗体进行免疫共沉淀实验。
图5：c-src磷酸化dmap1第246位酪氨酸(tyr246)从而抑制bub3与dmap1结合。a-d及e中，细胞被胸腺嘧啶脱氧核苷(2mm)双阻滞在间期(i)，或由胸腺嘧啶脱氧核苷(2mm)双阻滞和诺考达唑(200nm)处理阻滞在有丝分裂期(m)。a将panc-1和sw1990细胞同步化在细胞间期或有丝分裂期。收集细胞，裂解后借助抗c-src的抗体进行免疫共沉淀实验。b在[γ-32p]atp存在的情况下利用有活性的his-c-src和gst-dmap1重组蛋白进行体外激酶实验。dmap1246位酪氨酸(tyr246)在列出的各物种中是进化保守的位点。c将表达带flag标签的野生型dmap1或dmap1特定位点酪氨酸突变体的panc-1细胞周期阻滞在有丝分裂期后，收集细胞用抗flag的抗体进行免疫共沉淀实验。d将处于有丝分裂阻滞的panc-1细胞裂解液与纯化的gst-dmap1共孵育，同时加入具有活性的c-src，随后进行gstpull-down实验。e将未被磷酸化或被p38磷酸化的his-bub3蛋白分别与未被磷酸化或被c-src磷酸化的gst-dmap1蛋白共孵育，随后进行gstpull-down实验。
图6：c-src磷酸化dmap1第246位酪氨酸(tyr246)从而抑制bub3与dmap1结合。将panc-1细胞同步化在细胞间期或有丝分裂期。随后用c-src抑制剂su6656(10μm)处理细胞1小时。用图中所示的抗体分别进行免疫印迹实验。
图7：bub3/dmap1复合体抑制抗凋亡基因转录。a在sw1990细胞中用小发夹rna(shrna)沉默内源性的dmap1，随后在细胞中表达shrna干扰抵抗的野生型dmap1(rdmap1)或tyr246位点突变的dmap1(rdmap1y246f)。用dmap1抗体进行免疫印迹实验。b在sw1990细胞中用小发夹rna(shrna)沉默内源性的dmap1和bub3，随后在细胞中表达shrna干扰抵抗的野生型dmap1(rdmap1)，野生型bub3或(rbub3)，tyr246位点突变的dmap1(rdmap1y246f)和ser211位点突变的bub3(rbub3s211a)。用图中所示的抗体分别进行免疫印迹实验。
图8：bub3/dmap1复合体抑制抗凋亡基因转录。图c-e中，*代表p<0.05，**代表p<0.01。a表达野生型dmap1和tyr246位点突变dmap1的sw1990细胞经胸腺嘧啶脱氧核苷(2mm)双阻滞和诺考达唑(200nm)处理后按图示时间分别释放，使细胞进入g1期。用g1期特异标记蛋白cyclind1和有丝分裂期特异标记蛋白cyclinb1的抗体分别进行免疫印迹实验。b表达野生型dmap1(wtrdmap1)和dmap1tyr246点突变(rdmap1y246f)的sw1990细胞经胸腺嘧啶脱氧核苷(2mm)双阻滞和诺考达唑(200nm)处理后释放4小时。4307个基因探针的层次聚类表达表明野生型dmap1细胞和dmap1tyr246点突变细胞中基因表达明显不同：抗凋亡基因在dmap1tyr246点突变细胞中表达明显低于野生型细胞；自噬相关基因则在dmap1tyr246点突变细胞中表达水平明显上升。c-d表达相应载体的sw1990细胞经胸腺嘧啶脱氧核苷(2mm)双阻滞和诺考达唑(200nm)处理后释放相应的时间。收集细胞后用实时定量pcr法检测bcl2l1和hmga2转录活化情况。eannexinv/pi染色分析表达相应载体的sw1990细胞凋亡。
图9：tap73招募bub3/dmap1复合体到靶基因启动子区。b-f中细胞被胸腺嘧啶脱氧核苷(2mm)双阻滞在间期(i)，或由胸腺嘧啶脱氧核苷(2mm)双阻滞和诺考达唑(200nm)处理阻滞在有丝分裂期(m)。*表示p<0.05，**表示p<0.01。a将表达相应载体的sw1990细胞阻滞在有丝分裂期，收集细胞用抗flag的抗体进行免疫共沉淀实验。b将表达相应载体的sw1990细胞阻滞在间期或有丝分裂期，收集细胞进行染色质免疫共沉淀(chip)实验。chip引物分别包含tap73在bcl2l1和hmga2启动子区的识别序列。c将sw1990细胞阻滞在间期或有丝分裂期，收集细胞进行染色质免疫共沉淀(chip)实验。chip引物分别包含tap73在bcl2l1和hmga2启动子区的识别序列。d在sw1990细胞中表达相应载体，利用焦磷酸测序法检测bcl2l1启动子区5-mc的水平。pcr引物含tap73在bcl2l1启动子区的识别序列。
图10：tap73招募bub3/dmap1复合体到靶基因启动子区。a-h中细胞被胸腺嘧啶脱氧核苷(2mm)双阻滞在间期(i)，或由胸腺嘧啶脱氧核苷(2mm)双阻滞和诺考达唑(200nm)处理阻滞在有丝分裂期(m)。*表示p<0.05，**表示p<0.01。a沉默sw1990细胞中dmap1后，在细胞中表达shrna干扰抵抗的野生型dmap1(rdmap1)或tyr246位点突变的dmap1(rdmap1y246f)。随后沉默细胞中tap73然后进行实时定量pcr。b将sw1990细胞阻滞在间期或有丝分裂期，收集细胞进行染色质免疫共沉淀(chip)实验检测tap73在bcl2l1和hmga2启动子区的募集。c-d沉默sw1990细胞中tap73并将细胞阻滞在间期或有丝分裂期，收集细胞进行染色质免疫共沉淀(chip)实验。chip引物分别包含tap73在bcl2l1和hmga2启动子区的识别序列。e在sw1990细胞中分别表达相应载体，诱导细胞周期阻滞在间期或有丝分裂期，收集细胞进行染色质免疫共沉淀(chip)实验。f在sw1990细胞中分别表达相应载体，利用焦磷酸测序法检测bcl2l1启动子区5-mc的水平。pcr引物含tap73在bcl2l1启动子区的识别序列。
图11：dmap1y246的磷酸化是胰腺癌发生发展所必需。a分别将5×106个表达野生型rbub3/野生rdmap1，野生型rbub3/rdmap1y246f或rbub3s211a/rdmap1y246f的sw1990细胞皮下注射到裸鼠体内。当肿瘤体积达到200mm3时开始给小鼠腹腔注射紫杉醇(5mg/kg)从而诱导有丝分裂阻滞。每组各8只小鼠，实验结束时每组选取一只代表性实验小鼠拍照。剥离每组小鼠的肿瘤并拍照。b整个实验周期内每周用游标卡尺量取实验小鼠肿瘤的长(a)与宽(b)，并按如下公式计算肿瘤体积v＝ab2/2。实验结束后称取每组实验小鼠的肿瘤重量。c用抗dmap1py246的抗体对含有90对胰腺癌临床样本及其相应癌旁组织的组织芯片进行免疫组织化学染色。收集8胰腺癌临床样本及其相应癌旁组织免疫印迹实验检测肿瘤组织和癌旁组织中dmap1py246，c-srcpy416和c-src的水平。d通过免疫组织化学染色法对芯片中90例胰腺癌患者的dmap1py246水平进行评分：0-5分，0分代表无明显阳性着色；1分代表<10％的区域有浅棕色阳性着色；2分代表10％～30％的区域有浅棕色阳性着色；3分代表31％～50％的区域有浅棕色阳性着色；4分代表≥50％的区域有棕色阳性着色；5分代表≥50％的区域有深棕色阳性着色。0-2分视为dmap1py246低表达；3-5分为dmap1py246高表达。利用组织芯片随访数据和免疫组织化学染色法分析dmap1py246水平与芯片中90例胰腺癌患者生存率的关系，并利用spss软件进行cox多因素分析。
图12：通过特异性封闭多肽处理和免疫组化分析验证磷酸化dmap1y246抗体特异性。在有或无相应的封闭多肽时，用特异性抗dmap1py246的抗体对胰腺癌组织进行免疫染色。
图13：正常细胞与胰腺癌细胞中p38/bub3/dmap1信号轴作用模式示意图。有丝分裂阻滞激活p38。活化的p38促使bub3ser211位点磷酸化进而促进bub3与dmap1/dnmt1的相互作用。tap73将bub3/dmap1复合体招募到靶基因启动子区。此时dmap1/dnmt1通过调节启动子区甲基化水平抑制抗凋亡基因的转录。c-src通过维持较高的dmap1tyr246的磷酸化水平而抑制bub3/dmap1复合体形成。在正常细胞中，由于c-src活性较低，一旦细胞发生有丝分裂阻滞，p38/bub3/dmap1信号轴能够迅速活化。此时细胞更易发生凋亡(左图)。在肿瘤细胞中，异常活化的c-src导致dmap1tyr246位点的磷酸化，从而抑制有丝分裂阻滞时p38/bub3/dmap1信号轴调控的细胞凋亡(右图)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
1、细胞有丝分裂阻滞压力下，bub3能与dmap1形成复合物
为探究有丝分裂阻滞压力下bub3除具备其经典的纺锤体检验点功能外是否还参与到其他未知的细胞事件中，我们在永生化的人胰腺导管上皮细胞hpde中稳定地表达带有flag标签的bub3，随后通过胸腺嘧啶脱氧核苷双阻滞和诺考达唑处理将细胞周期阻滞在有丝分裂期。流式细胞分析以及对晚g2期和有丝分裂期特异标记磷酸化(10号位丝氨酸)组蛋白h3的免疫印迹检测验证了细胞有丝分裂阻滞的效率(图1a)。我们收集细胞后用偶联有flag抗体的琼脂糖珠(anti-flagm2)进行免疫共沉淀并借助质谱分析的手段探寻bub3相互作用的蛋白。质谱数据表明，dna甲基转移酶1(dnmt1)相关蛋白dmap1能在有丝分裂阻滞时期特异性与bub3结合。尽管结合程度不及dmap1，但我们发现在细胞处于有丝分裂期阻滞时(图2a)，dnmt1与bub3的相互作用与分裂间期相比仍有一定程度的增强(图2b)。此外，质谱分析结果显示tap73在有丝分裂阻滞时也能与bub3相结合，这一发现与之前的研究报道一致(图2c)。我们分别用特异识别bub3(图1b)和dmap1(图2d)的抗体进行正、反免疫共沉淀实验，实验结果表明在有丝分裂阻滞压力下，bub3/dmap1相互作用确实有明显增加。进一步实验结果显示，沉默dnmt1并不影响bub3与dmap1的结合(图2e)；但dmap1的缺失抑制了bub3/dnmt1复合体的形成(图1c)。这一结果说明有丝分裂阻滞时bub3与dnmt1的结合是以dmap1为纽带。此外，我们也检测了bub3与damp1在胰腺癌细胞panc-1和sw1990中相互结合的情况。然而在肿瘤细胞中，当有丝分裂阻滞的压力存在时，bub3与damp1的相互结合仅有少量增加(图1d)，因此某些肿瘤特异性的信号通路可能参与bub3/damp1复合体形成过程。据报道，在胰腺癌发展的过程中，pi3k、mek/erk、c-src等激酶相关的信号通路异常活化。我们分别用ly294002(pi3k抑制剂)、u1026(mek/erk抑制剂)和su6656(c-src抑制剂)处理胰腺癌细胞panc-1和sw1990。只有在c-src活性被抑制的情况下有丝分裂阻滞诱导的bub3/damp1结合显著增加(图1d)。因而c-src可视为一个bub3/damp1结合的负调控因子。为了更进一步证明这一结果，我们在c-src活性相对较低的胰腺导管上皮细胞hpde中表达组成型激活的c-src(c-srcy527f)。hpde中表达c-srcy527f后，有丝分裂阻滞诱导的bub3/dmap1相互作用确实明显减少(图1e)。随后，我们构建了一系列bub3的缺失突变体以期找到bub3与dmap1相结合的区域(图1f)。我们在有丝分裂阻滞的hpde细胞中分别表达bub3的缺失突变体(含flag标签)和野生型dmap1(含ha标签)，通过免疫共沉淀实验我们发现，当bub3缺少第197-306位氨基酸或缺少第203-328位氨基酸时，它与dmap1的结合基本消失(图1f)。因此，bub3与dmap1结合区域应位于bub3第203-306位氨基酸之间。
2、p38磷酸化bub3第211位丝氨酸(ser211)从而促进bub3与dmap1结合
在证明有丝分裂阻滞压力下bub3能与dmap1相互作用且找到bub3与dmap1具体结合区域后，我们开始着手研究有丝分裂阻滞下bub3/dmap1结合上游调节信号。我们发现用小牛肠碱性磷酸酶(cip)处理免疫沉淀复合物后bub3与dmap1的结合消失；而用na3vo4处理免疫沉淀复合体则无此现象(图3a和图4a)。这一结果说明bub3/damp1结合是磷酸化依赖的。丝氨酸/苏氨酸激酶例如jnk、ampk及p38在细胞内压力信号的存在下会发生活化，它们在有丝分裂阻滞时也会被激活(图4b)。我们分别用sp600125(jnk抑制剂)、compoundc(ampk抑制剂)和sb203580(p38抑制剂)处理hpde细胞(图4c)。有丝分裂阻滞诱导的bub3/damp1结合只能被sb203580特异性抑制(图3b)。同样地，在c-src活性受抑制的情况下，sb203580很大程度上阻碍了胰腺癌细胞panc-1和sw1990中有丝分裂阻滞诱导的bub3/damp1复合体形成(图3c)。因此，有丝分裂阻滞的效应激酶p38参与到bub3/dmap1的相互结合过程。此外，通过免疫共沉淀实验我们发现有丝分裂阻滞促进了hpde细胞和panc-1细胞中p38与bub3的结合(图3d)，这一结果促使我们进一步探究bub3是否是p38激酶的底物。体外的蛋白激酶实验证实纯化的具有活性的p38蛋白能够磷酸化纯化的重组bub3(放射自显影)(图3e)。与此同时，我们利用抗磷酸化丝氨酸的抗体进行免疫印迹实验发现p38确实能使bub3的丝氨酸发生磷酸化(图3e)。scansite的分析预测了bub3氨基酸序列中一系列能被p38磷酸化的潜在位点(图3f)。我们对这些潜在位点进行单点突变后发现只有当进化保守的211位丝氨酸发生突变(bub3s211a)，bub3才不能被p38激酶磷酸化。这一点通过放射自显影和免疫印迹实验(利用特异性抗bub3pser-211抗体)得以证实(图3f)。在有丝分裂阻滞下bub3第211位丝氨酸(s211)磷酸化确实能被p38激酶抑制剂sb203580所抑制(图4d)。为进一步探究bub3s211磷酸化是否依赖于有丝分裂压力下p38的活性，我们将hpde细胞同步化在g1期，并用已知的p38激活因子tgf-β刺激细胞。然而我们的研究结果表明p38/bub3的相互作用以及bub3s211磷酸化均未发生明显的增加(图4e)。综合上述结果，我们认为有丝分裂阻滞压力下p38的活性是bub3s211发生磷酸化的重要前提。随后，为研究bub3s211磷酸化对bub3/dmap1结合的影响，我们在有丝分裂阻滞的hpde细胞中分别表达野生型和突变的bub3。免疫共沉淀实验结果显示，只有当bub3s211发生突变时，bub3/dmap1的结合消失。与之相类似的是当c-src活性受抑制时，有丝分裂阻滞显著促进胰腺癌细胞panc-1中dmap1与野生型bub3而非bub3s211a的结合(图3g)。随后，我们又进行了如下实验：将重组的gst-dmap1蛋白与重组的his-bub3或his-bub3s211a共孵育，孵育时分别加入或不加纯化的具有活性的p38蛋白。通过gstpull-down实验，我们发现p38促进野生型bub3与dmap1的结合但并不能促使bub3s211a突变体与dmap1结合(图3h)。综上，这些结果均表明有丝分裂阻滞下p38调控的bub3s211磷酸化对其与dmap1的结合至关重要。
3、c-src磷酸化dmap1第246位酪氨酸(tyr246)从而抑制bub3与dmap1结合
有丝分裂阻滞导致胰腺癌细胞panc-1中bub3s211磷酸化显著增加，而这一过程则和c-src的活性无关(图4f)。因此c-src负调控bub3/dmap1并不依赖bub3s211磷酸化水平，同时这也促使我们探究c-src调控bub3/dmap1结合的分子机制。在panc-1和sw1990这两株胰腺癌细胞中，c-src与dmap1而非bub3在整个细胞周期内均能形成明显的复合体(图5a)，说明dmap1极有可能作为c-src激酶的底物。根据scansite的分析，我们在dmap1氨基酸序列中找到了多个能被c-src磷酸化的潜在位点(图5b)。进化保守的dmap1第246位酪氨酸发生突变后，c-src对dmap1的磷酸化也随即消失。这一点通过放射自显影和免疫印迹实验(利用特异性抗dmap1py246抗体)得以证实(图5b)。同时，免疫印迹实验结果表明panc-1细胞中dmap1py246的水平在整个细胞周期内较为恒定，并能随c-src的抑制而降低(图6)。panc1细胞发生有丝分裂阻滞时，dmap1y246f突变体相比野生型dmap1及dmap1其他突变体而言，与bub3的结合更为显著(图5c)，这一结果恰好与之前我们抑制胰腺癌细胞中c-src活性后dmap1与bub3的结合的情况一致(图1d)。因此，c-src调控的dmap1磷酸化能阻碍有丝分裂阻滞诱导的bub3/dmap1复合体形成。值得注意的是，在panc1细胞中，表达dmap1y246f突变体并不影响有丝分裂阻滞诱导的bub3s211磷酸化(图5c)。此外，gstpull-down实验结果表明，纯化的dmap1蛋白能与有丝分裂阻滞时细胞提取物中的bub3结合，而这一结合能被体系中的c-src显著抑制(图5d)。在另一个gstpull-down实验中，当我们将纯化的dmap1、bub3、p38和c-src共孵育时，即使在c-src存在的情况下，dmap1仍然能与磷酸化的bub3形成复合体(图5e)。这些结果说明c-src介导的dmap1磷酸化并非直接阻碍dmap1/bub3相互作用，可能还存在着其他未被发现的因子能在有丝分裂阻滞时与bub3竞争结合磷酸化dmap1。
4、bub3/dmap1复合体抑制抗凋亡基因转录
有报道指出dmap1能与dnmt1相互作用从而参与基因转录抑制。我们沉默了sw1990细胞中内源性dmap1，并在细胞中表达rna干扰抵抗的野生型rdmap1或ry246fdmap1以探讨c-src介导的dmap1磷酸化对bub3/dmap1结合的抑制是否与有丝分裂后基因转录相关(图7a和图8a)。首先，我们用胸腺嘧啶脱氧核苷和诺考达唑将细胞周期阻滞在有丝分裂期。移除诺考达唑后分别释放1小时，2小时，4小时和6小时使细胞进入g1期。取释放4小时后表达野生型rdmap1或ry246fdmap1的sw1990细胞进行cdna微阵列(cdnamicroarray)分析。我们发现在表达ry246fdmap1的sw1990细胞中多数表达降低的基因与自噬或抗凋亡信号相关；相反，表达升高的基因多与促凋亡或细胞存活维持相关(图8b)。鉴于dmap1在基因转录抑制中的作用，我们认为在表达dmap1突变体y246f的细胞中，那些表达下调的基因可作为bub3/dmap1复合体潜在的靶基因。在这些靶基因中，我们选择hmga2和bcl2l1这两个编码抗凋亡蛋白的基因为研究对象来进一步探究bub3/dmap1复合体对有丝分裂后基因再度活化的影响。通过实时定量pcr实验，我们发现dmap1y246f突变在有丝分裂释放后4小时和6小时内(大部分细胞此时处于g1期)能够显著延迟hmga2和bcl2l1这两个基因的再活化(图8c和8d)，这也与我们cdnamicroarray结果一致。我们之前的实验结果表明bub3s211的磷酸化是bub3/dmap1相结合所必需的(图3h和图5c)，因此bub3s211的磷酸化极有可能参与基因转录调控。为验证这一点，我们沉默sw1990中的bub3并在细胞中表达rna干扰抵抗的野生型rbub3或rbub3s211a(图7b)。我们发现rbub3s211a显著逆转由dmap1y246f介导的基因再活化延迟这一过程(图8c)。此外，dnmt1的沉默也能抑制dmap1y246f对基因再活化的延迟(图8d)。dmap1y246f对有丝分裂后基因转录的抑制作用促使我们研究它与有丝分裂阻滞压力下细胞存活之间的关系。借助pi/annexinv染色和细胞流式分析，我们发现当sw1990细胞从有丝分裂期中释放后，dmap1y246f突变能使部分细胞发生凋亡，而bub3s211a突变或共表达hmga2和bcl2l1这两个基因则逆转细胞凋亡(图8e)。通过以上结果我们认为在有丝分裂阻滞压力下，bub3/dmap1复合体构成转录抑制调控因子调节抗凋亡基因的转录，而肿瘤细胞中高度活化的c-src则能够抑制bub3/dmap1复合体对抗凋亡基因转录的作用。
5、tap73招募bub3/dmap1复合体到靶基因启动子区
有丝分裂阻滞下，bub3与tap73相结合(图2c)，且二者的结合并不依赖于bub3s211的磷酸化状态(图9a)。由此我们推断tap73可能参与bub3/dmap1介导的基因转录调控。如图10a所示，沉默tap73后dmap1y246f对hmga2和bcl2l1的转录抑制作用也随即消除，因此tap73确实参与bub3/dmap1对基因的转录调控。通过分析，我们发现hmga2启动子区的序列‘tgcatgtgcttacacgcg’和bcl2l1启动子区的序列‘ggcatgcgccaccacgcc’是转录因子tap73的潜在结合位点(图10b)。染色质免疫共沉淀实验结果证实在有丝分裂期tap73能富集在这两个靶基因的启动子区。此外，有丝分裂阻滞时sw1990细胞中hmga2和bcl2l1启动子区的bub3(图10c)及磷酸化bub3s211(图10d)均显著增加，但tap73的缺失阻止了bub3及磷酸化bub3s211在启动子区的募集。在表达rdmap1y246f的sw1990中，有丝分裂阻滞同时也以依赖tap73的方式招募更多的dmap1(图10e)和dnmt1(图9b)到靶基因启动子区，但在仅表达野生型rdmap1或同时表达rdmap1y246f和rbub3s211a的细胞中则无此现象(图9b)。这说明p38调节的bub3磷酸化对于启动子区dmap1/dnmt1的募集不可或缺。在有丝分裂阻滞下，tyr246磷酸化的dmap1并不能被招募到靶基因启动子区(图9c)。接下来，我们检测了有丝分裂阻滞时bub3/dmap1/dnmt1复合体对hmga2和bcl2l1基因启动子区甲基化的影响(图9d)。dna甲基化实验结果表明经诺考达唑处理的表达rdmap1y246f的sw1990细胞与表达rdmap1y246f/rbub3s211a细胞相比，靶基因(bcl2l1)启动子区的5mc有显著提高(图10f)，这一结果与这些突变体对靶基因转录调节的效果相符。综合上述结果，我们认为有丝分裂阻滞时c-src介导的dmap1y246磷酸化阻碍bub3诱导的启动子相关的dmap1/dnmt1募集从而抑制相关启动子区dna甲基化进而解除基因转录抑制。
6、dmap1y246的磷酸化是胰腺癌发生发展所必需
我们之前的结果表明有丝分裂阻滞下c-src介导的dmap1y246磷酸化能阻碍bub3/dmap1复合体形成从而促进胰腺癌细胞的存活与增殖(图8e)。为了进一步确认dmap1y246磷酸化在胰腺癌发展过程中的作用，我们分别将表达有野生型rbub3/野生型rdmap1，野生型rbub3/rdmap1y246f以及rbub3s211a/rdmap1y246f的sw1990胰腺癌细胞通过皮下注射到裸鼠体内待肿瘤生长。当肿瘤体积达到200mm3时给予小鼠腹腔注射紫杉醇(5mg/kg，诱导胰腺癌细胞有丝分裂阻滞)。尽管接受了紫杉醇治疗，但注射野生型rdmap1细胞组的小鼠肿瘤仍然能迅速生长。与之相反，注射rdmap1y246f突变细胞组的小鼠肿瘤则生长较为缓慢(图11a和11b)，而这种抑制效应却能通过表达rbub3s211a突变体所逆转。上述体内实验结果说明，dmap1y246磷酸化对bub3/dmap1复合体的抑制效应对胰腺癌发生发展至关重要。
7、dmap1y246的磷酸化与胰腺癌不良预后密切相关
我们已经证明dmap1y246磷酸化阻碍bub3介导的转录抑制。接下来我们的目标是探讨之前的研究结果是否具有临床的相关性。首先，我们通过免疫印迹实验检测了8对胰腺癌组织及其相应癌旁组织中c-src活性和dmap1y246磷酸化水平。我们发现dmap1y246磷酸化水平与c-src/c-srcpy416磷酸化水平呈正相关(图11c)。此外，我们收集了90对胰腺癌患者的肿瘤组织及相应的癌旁组织，用免疫组织化学染色法检测了dmap1y246磷酸化水平。磷酸化dmap1y246抗体特异性通过其特异性封闭多肽处理和免疫组化分析已经得以验证(图12)。肿瘤组织中dmap1y246磷酸化水平显著高于相应癌旁组织(图11c)。随后，我们分析了dmap1y246磷酸化水平与这90例胰腺癌患者生存率之间的关系(图11d)。dmap1y246磷酸化水平较低的患者(共29例，dmap1y246磷酸化评分等级0-2分)中位生存期较长且并未达到，而具有高dmap1y246磷酸化水平的患者(共61例，dmap1y246磷酸化评分等级3-5分)的中位生存期仅为10.5个月。cox多因素模型分析表明，dmap1y246磷酸化可作为胰腺癌患者生存率的一个独立预测指标(图11d)。这些结果均说明dmap1y246的磷酸化与胰腺癌不良预后密切相关。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。