一种经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂的制作方法

本发明涉及属于生物医药领域，具体涉及一种经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂及其制备方法及应用。
背景技术：
：帕金森病(parkinson’sdisease，pd)是临床上较为常见的难治病症，以黑质多巴胺能神经元变性缺失以及路易小体形成为主要病理特点，临床表现主要为静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态异常，极大影响了患者的生存质量。从19世纪60年代晚期开始，通过口服左旋多巴的多巴胺替代疗法来缓解pd运动症状是现代神经科学转化研究中的成功之一。目前，左旋多巴仍是治疗有症状pd的金标准。pd治疗目前最为有效的方法是采用左旋多巴替代治疗，但仍不能有效阻止或减缓疾病的发展。目前只能采用药物、外科手术或电极的方式进行缓解和控制症状，避免发展速度过快。自二十世纪八十年代初开展的细胞移植治疗pd以来，人们已尝试过胚胎中脑黑质组织、自体肾上腺髓质，胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓干细胞、人畸胎瘤神经元等，并取得了一定的疗效，因此细胞移植治疗pd也越来越多的受到关注。但上述细胞来源均受供体(donors)资源匮乏、伦理问题、成瘤风险大、免疫排斥反应、诱导多巴胺能神经元比例低等问题困扰，限制了细胞移植治疗帕金森病的进程。目前临床治疗帕金森病的方法以口服da前体药物左旋多巴为主，但这种药物起初有效，长期服用则会出现疗效下降，并引起一系列运动障碍并发症。外科治疗以苍白球和丘脑的损毁为主要方法，但术后复发率高。上述方法属于对症治疗，但不能逆转da能神经元的变性，因此，找到一种能够替代变性的多巴胺能神经细胞以恢复多巴胺神经递质功能的新技术新方法，已成为迫在眉睫的需求。技术实现要素：本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂及其制备方法及应用。本发明与鼠神经生长因子等神经营养药不同，神经干细胞注射液来源自人类胚胎(通过伦理审查)，完全100％人源，并且采用鼻腔无创给药的方式，直接作用于中枢神经系统，预计对小儿脑瘫将有更好的疗效。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：本发明涉及一种经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂，所述方法包括如下步骤：s1：种子细胞培养与纯化：将原代神经干细胞用无血清培养基对细胞悬液进行培养扩增传代至p5代即为获得的种子细胞。原代神经干细胞可以是在显微镜下使用手术器械分离获得废弃胎脑的腹侧中脑组织，然后采用消化液将细胞进行消化，细胞计数后使用无血清完全培养基进行重悬，并接种于超低吸附培养瓶中，35℃5％co2培养箱中进行悬浮培养，每间隔48-72小时进行换液，细胞连续培养12天左右即可传代，连续培养至p5代，在p0代到p5代这个过程里，所得的细胞越来越纯。将所得的p0-p5代细胞放入种子细胞库中进行存储。本发明所述神经干细胞可以是不同动物例如哺乳动物例如灵长类动物例如人、啮齿类动物例如鼠等的神经干细胞，而且所述神经干细胞可以得自不同来源，例如可以商购获得的神经球冻存液或神经干细胞细胞系，或者是间充质干细胞向神经方向诱导获得的神经干细胞；或者是由其他来源经诱导分化而来的神经干细胞，比如ipsc技术，胚胎干细胞(包括极小类胚胎干细胞)，亚全能干细胞，人类视网膜色素上皮细胞等；或者是除神经组织器官以外的其他器官及组织而来的神经干细胞，比如脐带血和脐带。s2：p6—p8代细胞培养：将步骤s1中得到的p5代神经干细胞用无血清培养基对细胞悬液进行培养扩增传代至p8代。所述培养扩增传代的方法为将细胞培养瓶采用层粘连蛋白laminin在37℃包被2小时，然后采用不含ca、mg的dpbs洗涤一遍备用；将p5代神经干细胞消化计数后，采用无血清完全培养基进行重悬，并调整密度为1x105个/ml，接种于包被好的培养瓶中，置于35℃5％co2环境进行贴壁培养；细胞培养每间隔48小时进行换液，细胞连续培养7天左右即可传代，直至p8代，期间p6-p8细胞放入主细胞库进行存储。s3：工作细胞库：取步骤s2中p8代细胞，进行细胞特性和异源物质检测，检测合格后，即为工作细胞，将其进行消化冻存，并转移至工作细胞库待用。优选的，步骤s2中所述无血清培养基是由dmem/f12，b27，n2，以及神经营养因子bfgf,egf,lif组成，无任何动物源血清成分。s4：用于帕金森病的治疗制剂的配制：将步骤s3的工作细胞进行贴壁培养，待细胞生长至对数生长期时将细胞进行消化并计数；然后在0-4度条件下将工作细胞溶液与塑形剂按体积比1：1进行混合；所述工作细胞溶液的浓度为100微升2.5x106个工作细胞；所述塑性剂为matrigel与0.4％羧甲基纤维素钠溶液按体积比1:1进行混合。如果工作细胞是从工作细胞库中的取出的冻存工作细胞先应进行复苏后，再进行贴壁培养，待细胞生长至对数生长期时将细胞进行消化并计数；然后在0-4度条件下将100微升2.5x106个神经干细胞与100微升塑形剂轻轻混匀，并转移至预冷的容器中，于4℃恒温环境保存。上述的经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂的使用方法，将所述的经鼻腔给药用于帕金森病治疗的神经干细胞制剂取出，滴至鼻腔粘膜或注射至皮下。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.本专利提供了一种无创的经鼻腔粘膜吸附给药的治疗帕金森的神经干细胞制剂，该制剂滴加或注射入鼻腔后在体温条件下能迅速形成固态膜状，吸附于鼻腔待细胞进行缓慢吸收，并且不会随呼吸进入口腔或肺部，便捷了病人和医生的使用，且试验数据表明其的疗效和安全性比从创伤性的纹状体给药更好。2.本专利中神经干细胞的培养方法采用p0-p5为悬浮培养、p6-p9为贴壁培养的方式，前期悬浮培养有利于获得纯化的神经干细胞克隆，能够保证获得的神经干细胞的纯度，而贴壁培养能够使神经干细胞更快的增殖传代，有利于细胞的中试扩大培养，并且能缩短接近一半的培养时间。3.本专利提供了一种性能稳定、哺乳动物来源的神经干细胞制剂，该制剂可在哺乳动物脑内分化成多巴胺受体的神经元，少突胶质细胞和星状胶质细胞，可修复大脑的神经和组织。4.该制剂可用于治疗帕金森疾病，且不需要使用免疫抑制剂。附图说明图1为神经干细胞形态，左图为悬浮培养的神经干细胞球；右图为贴壁培养的神经干细胞；细胞增殖倍数可达10倍/代次。图2为神经干细胞细胞特性和分化能力的鉴定；a-e为神经干细胞特性鉴定，f-m为神经干细胞分化能力的鉴定。图3为流式鉴定神经干细胞的纯度(＞95％)。图4为神经干细胞给药后各组动物黑质区域免疫组化染色结果。图5为神经干细胞给药后神经递质dopac相对含量变化。图6为神经干细胞给药后神经递质hva相对含量变化。图7为各标准品的hplc检测图谱。图8为神经干细胞给药后各组组织样品的hplc检测图谱。图9为神经干细胞给药后不同组大鼠跨步试验结果比较。图10为神经干细胞给药后第10周不同组大鼠跨步试验结果比较。具体实施方式下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。实施例1：神经干细胞种子库细胞的获得1、从胚胎干细胞(escs)诱导获得原代神经干细胞使用细胞刮挑取escs细胞克隆，轻柔吹散，然后使用神经干细胞诱导液重悬，转移至超低吸附培养皿中进行悬浮培养3天左右，收集形成的细胞球，轻柔吹散，再用神经干细胞诱导液进行重悬，超低吸附培养皿中再次悬浮培养3天，收集形成的细胞球；将提前一天使用laminin包被的培养皿用不含ca、mg的dpbs洗涤2次，将收集的细胞球用神经干细胞完全培养基进行重悬，接种于包被好的培养皿中进行贴壁培养，每2-3天进行换液，直至形成明显的神经样集落，然后使用细胞刮收集形成的集落，并使用accutase将其消化成为单个细胞，用神经干细胞完全培养基进行重悬，悬浮培养，使其形成神经干细胞球，获得的神经干细胞球可以消化进行传代，也可以进行液氮冻存。2、从诱导多能干细胞(ipscs)诱导获得原代神经干细胞挑取ipscs细胞克隆，将细胞轻柔吹散并使用不含bfgf和egf的完全培养基进行重悬，转移至超低吸附培养皿中进行悬浮培养7天左右，每2-3天进行半量换液，然后离心收集形成的细胞球。将提前一天使用laminin包被的培养皿用不含ca、mg的dpbs洗涤2次，将收集的细胞球用含有并接种于包被好的培养皿中进行贴壁培养，每2-3天进行换液，直至形成明显的神经样集落，然后使用细胞刮收集形成的集落，并使用accutase将其消化成为单个细胞，用神经干细胞完全培养基进行重悬，悬浮培养，使其形成神经干细胞球，获得的神经干细胞球可以消化进行传代，也可以进行液氮冻存。3、通过胚胎组织获取原代细胞(1)胚胎组织获取取e14的大鼠1只，以40mg/kg的剂量腹腔注射2％戊巴比妥钠麻醉；75％酒精浸泡消毒大鼠腹部5min，将大鼠仰卧位放置，牵拉固定四肢，剪开后腹正中接近耻骨联合的皮肤游离含有胚胎的完整子宫，移入含神经干细胞保存液的大培养皿内；分离冠臀长1l～12mm左右的胎鼠。(2)、原代细胞获取和接种使用精细手术镊分离中脑腹侧组织，取出放入装有6ml神经干细胞保存液的60mm无菌培养皿中，用镊子将组织块分成约1mm3的小块，然后转移至含有10ml神经干细胞保存液的50ml离心管中。然后进行细胞消化与计数，采用无血清完全培养基进行重悬，加入超低吸附t75培养瓶中，置于35℃二氧化碳培养箱中进行培养。4、p1-p5代细胞的扩增传代神经干细胞培养至10-12天，观察细胞状态，用移液器将低吸附t75培养瓶中的神经球和培养液吸入50ml离心管中，100g离心3分钟，使神经球充分沉淀到管底，吸弃上清，将配好的5ml消化液加入到离心管中，放入培养箱中消化15分钟；4℃，300g，离心5分钟，吸弃上清，加入神经干细胞保存液10ml进行洗涤；4℃，300g，离心5分钟，吸弃上清，加入1-5ml神经干细胞保存液，轻柔吹打使细胞分散重悬。然后按照《细胞密度测定标准操作程序》对单细胞悬液进行计数。根据计数得到的细胞数量，计算需加入的无血清完全培养基的体积。将重悬的细胞迅速加入低吸附t75培养瓶中，并轻轻从不同方向晃动，使细胞在培养液中均匀分布，放入二氧化碳培养箱中，培养温度为35℃，二氧化碳浓度为5％。连续传代培养直至p5代，消化后细胞冻存至种子细胞库进行保存。实施例2：神经干细胞主细胞库细胞的获得1、培养瓶包被：将细胞培养瓶中加入适量的层粘连蛋白laminin溶液，放入37℃培养箱中包被2小时，然后采用不含ca、mg的dpbs洗涤一遍备用；2、将扩增纯化的p5代神经干细胞消化计数后，采用无血清完全培养基进行重悬，并调整密度为1x105个/ml，接种于包被好的培养瓶中，置于35℃5％co2培养箱中进行贴壁培养；细胞培养每间隔48小时进行换液，细胞连续培养7天左右即可消化传代，直至p8代，期间所得的细胞放入主细胞库进行存储。实施例3：神经干细胞工作细胞库细胞的获得将p8代细胞采用无血清完全培养基进行重悬，并调整密度为1x105个/ml，接种于包被好的培养瓶中，置于35℃5％co2培养箱中进行贴壁培养，培养过程中取样进行细胞特性和异源物质检测，检测合格后，将细胞进行冻存，并转移至工作细胞库待用。实施例4：神经干细胞制剂的制备将工作细胞库中的神经干细胞复苏进行贴壁培养，参照实施例1消化细胞，4℃，300g，离心5分钟，吸弃上清，加入生理盐水离心洗涤，吸弃上清，1-5ml生理盐水重悬计数，4℃，300g，离心5分钟，吸弃上清，加入100微升的生理盐水将细胞重悬，在冰上将制备好的细胞悬液与塑形剂进行1:1混匀，然后分装至4度保存的预灌封的注射器中，置于4℃恒温箱中保存备用，使用时直接注射至给药部位。实施例5：神经干细胞的鉴定如图1所示实施例2、3里的神经干细胞增殖倍数可达10倍/代次。如图2所示采用免疫荧光的方法鉴定检测合格后的p8代细胞，能够鉴定细胞表达神经干细胞的特异性表面标志，其纯度可达95％以上；同时也能分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、多巴胺神经元等。如图3所示通过流式鉴定鉴定检测合格后的p8代细胞，神经干细胞的纯度可达95％以上。实施例6：神经干细胞应用于帕金森动物模型的药效学研究一、帕金森动物模型神经干细胞给药与评价1.实验分组及免疫组化分析采用单侧mfb内微量注射6-ohda诱导pd模型。大鼠麻醉后放置成仰卧位，用前端套有硅胶软管的微量注射器吸取神经干细胞细胞悬液10ul，将软管慢慢伸入大鼠左侧鼻腔中，缓慢将细胞注射入鼻腔，放置15min待神经干细胞液完全形成固态凝胶时，将大鼠放回笼中。实验分组如下：序号组别数量注射体积(ul)注射次数给药途径1a910ul4次，每周1次鼻腔2b910ul4次，每周1次鼻腔3c910ul4次，每周1次鼻腔4d1010ul4次，每周1次鼻腔5e810ul4次，每周1次鼻腔6sham组(生理盐水)1010ul4次，每周1次鼻腔7g86mg/kg每天注射腹腔注射黑质区酪氨酸羟化酶(th)免疫组化评价干细胞给药90天后，分别随机取每组大鼠各3只，10％水合氯醛麻醉后，心脏灌注固定。先用生理盐水300ml进行预灌注，将其体内血液冲出，再用中性甲醛固定液400ml进行灌注固定，完整剥取脑组织，继续4℃过夜固定。后进入30％蔗糖溶液4℃脱水至下沉，作连续冰冻冠状切片，片厚为30μm，进行th染色，见图4所示。2.高效液相检测神经递质2.1样品处理方法干细胞给药90天后，分别随机取每组大鼠各3～6只，即刻处死，解剖取出纹状体，称重并记录。先于液氮中速冻5min后置-80℃保存备用。hplc检测当天，样品按照100mg加入300μl样品处理液(0.2m高氯酸，0.2mm焦亚硫酸钠，0.01％edta-2na)，同时含有2.5μmdhba作为内标，超声粉碎(强度60％，时间2min)，14,000rpm离心10min，上清液经0.22μm水相滤膜过滤后用于hplc检测，以上过程均在4℃下操作。神经递质dopac相对含量变化见图5所示；神经递质hva相对含量变化见图6所示。2.2色谱条件色谱柱：dikmaplatisilods(5μm，250mm*4.6mm)流动相：16％甲醇水溶液，含40mm乙酸钠，15mm柠檬酸，0.25mm辛烷磺酸钠，0.2mmedta-2na，未加甲醇前调解ph至4.3检测器：电化学检测器(ecd)流速：1ml/min电压：500mv量程：1μa柱温：25℃进样体积：50μl各标准品的hplc检测图谱见图7所示色谱峰结果为：组织样品的hplc检测图谱见图8所示色谱峰结果为：3.大鼠行为学评价采用跨步试验，对大鼠治疗前后分别进行前肢功能测定。实验者一手固定大鼠躯体后半部和后肢，使其离地，另一手固定一侧前肢使另一侧前肢着地，以大鼠正手方向斜向一侧匀速移动大鼠(5s内移动90cm)，记录移动时着地侧前肢步数。交替测量两侧上肢的跨步数。每只大鼠一侧前肢重复5次，计算其均数。二、实验结果与讨论1.黑质区酪氨酸羟化酶(th)免疫组化评价对各组大鼠黑质区域的免疫组织化学评价结果如图4所示。第3组黑质区域th阳性神经元染色明显变浅，说明6-ohda造模后，会诱导黑质区域神经元的大量凋亡。第7组黑质th免疫组化染色稍有加深，说明给予美多巴后能一定程度改善由6-ohda诱导的神经细胞凋亡。第1,2，4，5组黑质神经元染色较为明显，比第3组显著增多，说明鼻腔给予不同剂量的神经干细胞后能有效的提高黑质区域神经元的密度。2.高效液相检测神经递质2.1各标准品峰的归属配制一定浓度的标准品后进样，各标准品的定位图谱如图7所示。内标dhba最先出峰，出峰时间在6.5min左右，神经递质dopac的出峰时间约为9min，神经递质hva的出峰时间在20min左右，峰形均良好，空白对照无干扰。2.1纹状体中神经递质含量测定结果dopac和hva是多巴胺的主要代谢产物，可以反应脑内多巴胺含量变化的指标。如图5所示，样品图谱中其他成分对测定成分无干扰。dopac和hva的含量相对于植物油处理组的百分比如图5和图6所示。两种递质的变化趋势相似。不同剂量的神经干细胞给药后，递质水平有不同程度的提高。说明干细胞的治疗能提高6-ohda诱导的帕金森模型大鼠脑内的递质水平。3.行为学实验结果分析神经干细胞给药后不同组大鼠跨步试验结果比较见图9所示。给予6-ohda进行造模后，模型动物跨步数显著减少；第1-4周给予不同剂量的神经干细胞进行干预，从得到的跨步试验结果看，给药后第10周，给药d组和g组与模型对照组比较有显著改善。神经干细胞给药后第10周不同组大鼠跨步试验结果比较见图10所示。4.综合讨论结合行为学、th神经元染色及神经递质含量检测结果综合分析，中低剂量的干细胞鼻腔给药后对于6-ohda诱导的帕金森模型鼠的运动能力有一定改善作用，减少黑质区域神经元凋亡的产生，并能提高模型大鼠脑内的递质水平。当前第1页12