一种高诱导活性的修复材料、制备方法和应用与流程

本发明涉及医用生物材料
技术领域：
，具体为一种高诱导活性的修复材料、制备方法和应用，该材料用于将生长因子复合于免疫原去除基质中，增强材料对特定组织的诱导修复作用。
背景技术：
：免疫原去除小肠粘膜下层(sis)材料是在临床上广泛应用于腹壁、泌尿道、硬脑膜、血心管修复等软组织缺损修复、加固的生物医用材料，是一种无细胞、无免疫原性、能生物降解且具有纤维弹性良好的材料。发明专利(103272278a)曾公开了一种动物源性植入性医用生物材料的制备方法，介绍了通过动物组织材料的前置处理分离、初洗、病毒灭活、免疫原去除、氯化钠处理、成型、包装灭菌获得具有不同的尺寸、厚度和力学强度的医用产品。免疫原去除技术将动物组织或器官活细胞消化、溶解，去除引起免疫反应的细胞表面抗原，获得保留有生长因子等调控因子的细胞外基质(ecm)。免疫原去除基质是由多种大分子物质如i型胶原蛋白、非胶原糖蛋白、氨基聚糖、蛋白聚糖及生长因子等物质组成，构成一个多孔三维结构，为各种细胞提供适宜的生长微环境，能够调节各种细胞的附着、形态、迁移、代谢、增殖和分化。免疫原去除基质作为组织和器官移植的天然生物医用材料，植入体内后可诱导患者自身细胞长入，为细胞重建受损组织提供模板，修复为血管化、功能化的组织或器官，并且免疫原去除基质会逐步降解，与重建组织再生过程基本同步，最终免疫原去除基质补片完全被宿主组织代替。免疫原去除sis基质补片中含有氨基聚糖、蛋白聚糖及生长因子，氨基聚糖、蛋白聚糖有利于生长因子的固定与趋化，而生长因子包括vegf、tgfβ1、bfgf，因此对于软组织缺损的修复、血管化作用明显，能很好的重塑与再生受损组织。但是当用于心肌、神经、平滑肌、上皮等组织修复时，免疫原去除sis基质补片对这些组织的功能重建的诱导作用有限，主要起到物理屏障作用，形成组织修复微环境，防止周围组织长入受损部位形成粘连、瘢痕。另外免疫原去除sis基质补片应用于血管瓣膜时还应考虑其防钙化功能，考虑其增加防止钙化的生长因子。为使免疫原去除sis基质补片应用于心脏、血管、神经、膀胱、食道、子宫等器官，实现其对组织功能增强修复，可将其与单种、多种生长因子复合，以促进其对特定组织、器官细胞的诱导调控作用。但是生长因子在体内半衰期短，因此体内的释放行为还需要进一步解决。技术实现要素：本发明针对现有技术的上述不足，提供一种将生长因子复合于免疫原去除基质中，能够增强材料对特定组织诱导修复作用的高诱导活性的修复材料。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种高诱导活性的修复材料，其特征在于：该材料由具有三维网状多孔结构的天然高分子材料组成，包括由中间层和上、下表面层构成的三层结构；中间层包含胶原蛋白、多糖物质、活性因子和生长因子，上、下表面层包含胶原蛋白、多糖物质和活性因子，所述修复材料可体内降解。所述修复材料以动物小肠粘膜下层组织材料制成。所述动物为哺乳动物，优选猪或牛。所述的胶原蛋白为包含i型、iii型、iv型和vi型胶原蛋白的组合物。所述的多糖物质为包含硫酸软骨素和透明质酸的组合物。所述的活性因子为包含纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、整合素及其配体的组合物。所述的生长因子包括但不限于卵泡抑制蛋白、神经生长因子、血小板源生长因子、上皮生长因子、基质γ羧基谷氨酸蛋白等一种或几种生长因子的组合物。所述的体内降解的时间为3-6个月。所述的上表面层和下表面层的三维网状多孔结构的孔隙率为45～70％。所述的中间层的三维网状多孔结构的孔隙率为75～90％。本发明上述特定的孔隙率能够控制生长因子释放，可以选择多种生长因子。本发明所述的高诱导活性的修复材料，长1-20cm，宽1-10cm，厚度1-4mm。本发明还提供一种上述高诱导活性的修复材料的制备方法，采用动物小肠粘膜下层组织作为原料，通过组织前置处理、病毒灭活、免疫原去除、干燥、浆料制备、成型和冷冻干燥步骤，获得清除动物源病毒风险、细胞成分、dna成分和α-gal抗原，保留细胞外基质成分的高诱导活性的修复材料。上述高诱导活性的修复材料的制备方法，具体的步骤包括：(1)组织前置处理：取动物小肠粘膜下层组织材料，清洗并将水滤干；(2)病毒灭活：采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡动物小肠粘膜下层组织材料进行病毒灭活；然后在超声装置中处理；(3)免疫原去除：免疫原去除液采用含有胰蛋白酶和edta的pbs溶液，免疫原去除过程在超声波清洗机中进行；然后在超声装置中清洗，得到小肠粘膜下层基质材料；(4)干燥：将由步骤(3)得到的经免疫原去除的基质材料固定于模具上，然后一同放于烘箱干燥；(5)浆料制备：将由步骤(3)清洗后的基质材料剪碎，使用液氮冷冻粉碎装置研磨破碎，得到颗粒；颗粒加入乙酸溶液，真空干燥后破碎；然后向颗粒中加入生长因子溶液，形成浆料；(6)成型：取由步骤(4)得到的干燥后的小肠粘膜下层基质材料膜作为上表面层和下表面层，在两个表面层之间加入由步骤(5)得到的浆料，平铺于模具上进行成型；(7)冷冻干燥：将成型后的材料放置于真空冷冻干燥机中进行真空冷冻干燥。本发明步骤(2)中过氧乙酸的体积百分比浓度为0.1％-5％、乙醇的体积百分比浓度为5％-40％(用水配置成溶液)，过氧乙酸-乙醇溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为(3-20)︰1，灭活时间2-4小时，温度范围为10-40℃。步骤(2)超声装置中处理为：采用ph值为7.0的pbs溶液超声处理小肠粘膜下层组织材料，溶液温度为20℃，pbs溶液与小肠粘膜下层组织材料的比例(体积比)为30︰1，优选处理3次，每次20分钟；然后采用20℃的纯化水清洗，纯化水与小肠粘膜下层组织材料比例为30︰1，至检测电导率为10μs/cm以下终止；清洗过程在超声波清洗机中进行，频率优选40khz，功率优选3000w以上。本发明步骤(3)中免疫原去除液为含有胰蛋白酶和edta的pbs溶液，免疫原去除液中胰蛋白酶的质量百分比浓度为0.01-0.2％，优选0.02-0.05％；edta的浓度为0.1-1mmol/l，优选0.4-0.8mmol/l；免疫原去除液的ph值为7.0-8.0，优选为7.2-7.5；所述免疫原去除液与小肠粘膜下层组织材料体积比为(20-40)︰1，免疫原去除过程在至少包括两个超声频率的超声波清洗机中进行，其中低频频率范围为20-40khz，高频频率为60-90khz，其中低频处理5-40min，高频处理5-40min，温度范围为20-35℃。采用胰蛋白酶和edta，使细胞与细胞外基质之间的连接被破坏；采用低频超声对细胞进行破碎，同时使用高频超声作用于破碎的细胞及细胞外基质，进一步使细胞脱离细胞外基质，达到免疫原去除目的。采用上述方式，对整个细胞脱离基质过程中的各个步骤进行强化，使细胞被从基质上完全脱离，到达最佳的免疫原去除效果。然后在超声波清洗机中分别用pbs溶液和降温注射用水处理，得到小肠粘膜下层基质材料；ph值7.2-7.4的pbs溶液与小肠粘膜下层组织材料比例为(20-40)︰1，注射用水与小肠粘膜下层组织材料比例为(20-40)︰1，注射用水处理至检测清洗前后注射用水电导率差为1μs/cm以下终止；超声频率优选40khz，功率优选3000w以上。本发明所述步骤(4)干燥为：将免疫原去除组织材料置于温度25-40℃、时间为8-16小时的环境中，形成上表面层或者下表面层。本发明步骤(5)所述浆料制备为：将步骤(3)清洗后的基质材料剪碎，使用液氮冷冻粉碎装置研磨破碎，将剪碎的基质材料进行破碎，然后通过筛网筛分出粒径250μm以下，优选150μm以下的颗粒(用于控制疏松结构的均匀性，颗粒越小形成的疏松结构越均匀)；颗粒中加入质量百分比为0.3％的乙酸溶液，真空干燥后破碎；然后按生长因子与颗粒质量比为(1-50):10000的比例向颗粒中加入生长因子水溶液，形成浆料，用于制备中间层(活性层)。本发明(7)所述的冷冻干燥为：将表面层与活性层进行冷冻干燥，预冻至-45℃，保温1-2小时，然后调节温度至-15℃，保温5-7小时，再调节温度至0℃，保温2小时，最后调节温度至25℃，保温4小时，形成复合结构。本发明进一步提供一种上述高诱导活性的修复材料的应用，具体为：该高诱导活性的修复材料可以包含以下一种或多种生长因子：卵泡抑制蛋白、神经生长因子、血小板源生长因子、上皮生长因子、基质γ羧基谷氨酸蛋白等。一种高诱导活性的修复材料的应用，可应用于心肌、神经、平滑肌、上皮等组织损伤的修复。一种高诱导活性的修复材料的应用，可固定于损伤组织的部位，提供力学支持与隔离保护，并缓慢释放生长因子，高活性调控组织再生与修复过程，长期植入防止材料的钙化。与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：(1)采用胰蛋白酶和edta，使细胞与细胞外基质之间的连接被破坏；采用低频超声对细胞进行破碎，同时使用高频超声作用于破碎的细胞及细胞外基质，进一步使细胞脱离细胞外基质，达到脱细胞目的。采用上述方式，对整个细胞脱离基质过程中的各个步骤进行强化，使细胞被从基质上完全脱离。到达最佳的免疫原去除效果。(2)高效破碎技术：低温超高速剪切破碎技术，保护胶原蛋白、生物因子成分不受破坏；(3)可降解吸收：体内可降解，降解过程可控，作用周期长；(4)多层封闭膜：三层结构，上下表面层为完整的免疫原去除基质层，中间层为含生长因子层，形成三明治结构，同时控制材料降解与生长因子释放过程；(5)多种生长因子可应用不同细胞各类组织的功能重建：一种高诱导活性的修复材料，可以包含以下一种或多种生长因子：卵泡抑制蛋白、神经生长因子、血小板源生长因子、上皮生长因子、基质γ羧基谷氨酸蛋白等，应用于心肌、神经、平滑肌、上皮等组织的生长与调控，或防止植入后免疫原去除基质材料的钙化。附图说明图1所示的是本发明高诱导活性载蛋白的异种免疫原去除基质材料的结构图；图2所示的是本发明高诱导活性载蛋白的异种免疫原去除基质材料不同层的微观结构sem照片，其中左图为免疫原去除基质层，右图为生长因子层；图3所示的是本发明高诱导活性载蛋白的异种免疫原去除基质材料活性因子释放曲线；图4所示的是本发明高诱导活性载蛋白的异种免疫原去除基质材料对神经细胞存活率的影响。具体实施方式以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。本发明所述小肠粘膜下层组织材料取自哺乳动物，猪小肠粘膜下层组织材料(sis)或牛小肠粘膜下层组织材料均适用于本发明的实施例。实施例1：本实施例动物源植入性生物修补片的制备方法，包括以下操作步骤：(1)组织前置处理：取小肠粘膜下层组织材料分割成宽10cm，长15cm的规定尺寸，剔除淋巴组织，用自来水冲洗3次，再用纯化水冲洗至表面无污渍，将冲洗后的小肠粘膜下层组织材料放置于滤网等滤水装置上，静置5分钟以上，将水滤干。(2)病毒灭活：采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡小肠粘膜下层组织材料进行病毒灭活，该过程可在不锈钢桶中进行。过氧乙酸-乙醇溶液中过氧乙酸的体积百分比浓度为2％、乙醇的体积百分比浓度为20％，过氧乙酸-乙醇溶液与小肠粘膜下层组织材料的比例(体积比)为5︰1，灭活时间2小时，温度范围为20℃；然后在超声装置中分别用pbs和纯化水处理；其中采用ph值为7.2-7.4的pbs溶液超声处理小肠粘膜下层组织材料，溶液温度为20℃，pbs溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为30︰1，优选处理3次，每次20分钟；然后采用20℃的纯化水清洗，纯化水与小肠粘膜下层组织材料比例为30︰1，至检测电导率为10μs/cm以下终止；清洗过程在超声波清洗机中进行，频率40khz，功率3000w以上。(3)免疫原去除：免疫原去除液采用含有质量百分比0.02％的胰蛋白酶和浓度为0.5mmol/l的edta的ph值为7的pbs溶液，免疫原去除液与小肠粘膜下层组织材料混合比例(体积比)为30︰1，免疫原去除过程在多频超声装置中进行，超声波功率在5000w以上；多频超声至少包括两个超声频率，低频频率范围为35khz，高频频率为70khz，其中低频处理5min，高频处理10min，温度为22℃。然后在超声波清洗机中分别用pbs溶液和纯化水处理，得到小肠粘膜下层基质材料；ph值7.2-7.4的pbs溶液与小肠粘膜下层组织材料比例为30︰1，纯化水与小肠粘膜下层组织材料比例为30︰1，用24℃注射用水处理至检测清洗前后注射用水电导率差为1μs/cm以下终止；超声频率优选40khz，功率优选3000w以上。(4)干燥：在热循环百级烘箱中进行，将烘箱预热至40℃后，将由步骤(3)得到的经免疫原去除的基质材料固定于模具，并一同放于烘箱干燥，时间为16小时。(5)浆料制备：将由步骤(3)清洗后的基质材料剪碎，使用液氮冷冻粉碎装置研磨破碎，将剪碎的基质材料和液氮送入装置进行破碎，然后通过筛网筛分出粒径150μm以下的颗粒；颗粒加入0.3％(质量百分比)的乙酸溶液，颗粒质量与乙酸溶液质量比为(0.5-2):1，真空干燥后破碎成颗粒；然后按生长因子与颗粒质量比为(1-50):10000的比例向颗粒中加入生长因子(例如上皮生长因子)水溶液，例如以20:10000的比例加入，形成浆料。其中，根据颗粒质量及比例关系确定生长因子质量，然后将生长因子与水配置为溶液，其中生长因子与水的质量比为(1-50):1000，然后将溶液滴入颗粒中并混合均匀；还可以进一步加入纯化水以调整浆料粘度；可加入颗粒质量的5-50倍的水，优选30倍的水。(6)成型控制：取由步骤(4)得到的干燥后的小肠粘膜下层基质材料膜作为表面层，在两个表面层之间加入由步骤(5)得到的浆料，平铺于模具。(7)冷冻干燥：将成型后材料平铺于真空冷冻干燥机中，关闭冻干室的门，打开循环泵约1min，开启压缩机对冻干箱致冷，将步骤(6)模具连同材料预冻至-45℃，保温2小时，然后开启真空泵，调节温度至-15℃，保温6小时，再调节温度至0℃，保温2小时，最后调节温度至25℃，保温4小时，真空冷冻干燥完成。本实施例中的制备方法还可包含以下步骤：(8)灭菌解析：采用环氧乙烷进行灭菌，灭菌条件为：先温度40℃保温4小时，湿度70％，然后通入浓度500mg/l环氧乙烷，灭菌6小时；解析过程在通风的解析室中进行，温度控制在20℃之间，时间14d。本发明所得产品结构如图1所示：包括上、下表面层(上表面层和下表面层)和中间层，微观结构如附图2所示。对本发明所得材料的化学成分进行检测，如下表1所示：表1蛋白(％)碳水化合物(％)脂类(％)水分灰分生长因子75％-85％15％-25％<1％<5％<1％0.01-2％实施例2：性能检测1)高诱导活性载蛋白的异种免疫原去除基质材料为三层结构，上下表面层为完整的表面层，中间层为含生长因子层，形成三明治结构，表面层较为致密，可控制材料降解行为与生长因子释放速度，而生长因子层为多孔结构层，利于保存生长因子。表面层孔隙率为67.4±5.2％，而生长因子层开孔率90.5±7.0％。2)力学性能检测表明样品伸断裂强度达105n/cm，缝合保持力大于21n。3)依据生物制剂残留dna检测方法《中国药典》2015年版第四部，采用荧光染色法检测实施例1所提供的样品dna残留量，实施例1所提供的样品的dna残留量2.56±0.14ng/mg。4)采用实时定量pcr法检测病毒的dna拷贝数，检测3批样品。结果：病毒dna拷贝数为0。5)按照gb/t14233.2-2005《医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法》进行检测实施例1所提供的样品，结果：细菌内毒为20eu/套。6)半乳糖苷酶(α-gal)清除率免疫原去除处理前材料的gal值为23.41±2.34×1014/mg，实施例1中样品的gal值为0.13±0.02×1014/mg，半乳糖苷酶(α-gal)清除率在99.40％以上。7)采用免疫组化染色法检测i、iii、iv型和vi型胶原蛋白，呈阳性。多糖物质含量检测表明样品中硫酸软骨素含量平均值为5687±201μg/g，透明质酸(ha)保留量平均值为354±35μg/g。8)采用免疫组化染色法检测活性因子纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、整合素，呈阳性。实施例3：活性因子释放曲线的检测高诱导活性载蛋白的异种免疫原去除基质材料按实施例1制备样品置于12孔板中，每孔中加入2毫升的pbs(ph7.4)。在饱和湿度的37℃下5％co2气氛的co2培养箱中孵育1、3、5、7、14、21、28d(天)，再将pbs转移到离心管中，并检测pbs溶液中血小板源生长因子含量m1，以加初始加入量为分母m0，计算生长因子释放率＝m1/m0。如附图3所示，生长因子释放稳定可控，第1天时生长固子释放率为19.92±1.96％，第3天释放率为46.32±3.36％，第7天释放率为64.16±2.50％，28天时总释放率达到86.56±3.42％。因此生长因子可持续周期28天以上，未出现突释现象，体现了高诱导活性。实施例4：添加神经生长因子后对神经细胞存活率的影响高诱导活性载蛋白的异种免疫原去除基质材料按实施例1制备样品，其中添加的生长因子替换为神经生长因子，制备好样品裁剪为小样，置于96孔进行神经细胞培养，采用mtt测试神经细胞的存活率，空白对照组只加培养基。结构如附图4所示，培养3天时，试验组细胞存活率比空白对照组高29.62±2.66％，培养5天时，试验组细胞存活率比空白对照组高50.04±12.69％，培养7天时，试验组细胞存活率比空白对照组高54.87±9.47％，因此高诱导活性载蛋白的异种免疫原去除基质材料添加神经生长因子后明显提高了神经细胞存活率。综上，本发明一种高诱导活性的修复材料：(1)dna残留能够达到10ng/mg以下，较同类产品低30-50ng/mg、半乳糖苷酶去除率较高，能够达到99％以上；(2)降低引起过敏、感染、炎症、肉芽肿、局部脓肿的风险；(3)保留细胞外基质中活性生长因子；(4)利用氨基聚糖、蛋白聚糖锚定添加的多种有益生长因子；(5)体内可降解，生长因子释放可控，作用周期长，具有高诱导活能；(6)可控力学性能，通过不同层数封闭膜控制生长因子释放与力学性能；(7)生产过程可实现标准化、产业化。本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。当前第1页12