一种丝蛋白海绵及其制备方法与流程

本发明涉及生物材料技术领域，尤其涉及一种丝蛋白海绵及其制备方法。

背景技术：

丝蛋白优异的生物相容性，力学性能，可降解性，易于成形以及能够在水溶液中进行处理等优点，已经使其成为具有潜在应用价值的通用生物材料。具有多孔结构的丝蛋白海绵已经广泛应用于皮肤、骨、神经、软骨等多种组织的修复，并取得良好的效果。如何利用温和、稳定、简单的方法制备丝蛋白多孔海绵，并调控多孔海绵的力学以及生物学性能成为丝蛋白生物材料的重要发展方向。

目前研究者开发出多种制备丝蛋白海绵的方法，主要包括盐析法和冷冻干燥法；盐析法制备的多孔海绵主要构象为beta-sheet结晶，力学性能高，不适合应用于软组织修复，冷冻干燥法所制备的丝蛋白，尽管一般为非晶结构，但其会在水中溶解，导致其无法应用，只能通过醇处理、真空水处理来诱导形成beta-sheet，最终获得不溶于水的海绵材料。近年来，利用高结晶的丝蛋白纳米纤维作为诱导剂，促进丝蛋白在冻干过程中发生结构转化，从而直接获得不溶于水的丝蛋白海绵材料，上述方法由于制备过程中不需要使用有机溶剂进行后处理，引起人们的兴趣。然而，上述技术要求加入高结晶丝蛋白纳米纤维的含量不能低于7.5％，否则制备的多孔海绵会在水中部分溶解；而高晶纳米纤维含量过高，则容易导致部分丝蛋白沉淀，使得制备多孔海绵不均匀。如何有效降低高晶纳米纤维含量的同时，有效提高所制备多孔海绵在水中的稳定性是提高上述丝蛋白海绵材料应用价值的关键。因此，基于上述进展，有必要将高晶纳米纤维诱导同丝蛋白自组装调控结合，在更低的高晶纳米纤维含量的条件下，实现不溶性丝蛋白海绵的稳定制备。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题在于提供一种丝蛋白海绵及其制备方法，本申请在较低含量高结晶丝蛋白纳米纤维的基础上可制备不溶性的丝蛋白海绵。

本申请提供了一种丝蛋白海绵，所述丝蛋白海绵的beta-sheet含量低于30wt％，所述丝蛋白海绵不溶于水。

优选的，所述丝蛋白海绵具有贯通的多孔结构，孔径为50～500μm。

本申请还提供了所述的丝蛋白海绵的制备方法，包括以下步骤：

a)，将丝蛋白水溶液密封培育后与高结晶丝蛋白纳米纤维溶液混合，得到混合溶液；

b)，将所述混合溶液冷冻后冻干，得到丝蛋白海绵。

优选的，所述丝蛋白水溶液中的丝蛋白与所述高结晶丝蛋白纳米纤维溶液中高结晶丝蛋白纳米纤维的质量比为(15～60)：1。

优选的，所述密封培育的温度为35～70℃，时间为6～48h。

优选的，所述高结晶丝蛋白纳米纤维溶液的高结晶丝蛋白纳米纤维以beta-sheet结构为主，高结晶丝蛋白纳米纤维的直径为10～20nm，长度为200nm～3μm。

优选的，所述冷冻的温度为-4～-12℃，所述冷冻的时间为8～48h。

优选的，所述冻干的温度为-20～-90℃，所述冻干的时间为12～48h。

优选的，所述高结晶丝蛋白纳米纤维溶液按照下述方法制备得到：

将丝蛋白溶液浓缩至浓度为8～12wt％的第一丝蛋白溶液；

将所述第一丝蛋白溶液浓缩至浓度为18～22wt％的第二丝蛋白溶液；

将所述第二丝蛋白溶液稀释至浓度为0.5～2wt％，密封培育，得到高结晶丝蛋白纳米纤维溶液。

优选的，所述得到第一丝蛋白溶液中的浓缩在40～60℃进行；所述得到第二丝蛋白溶液中的浓缩在25～35℃进行，所述密封培育的温度为50～70℃。

本申请提供了一种丝蛋白海绵，其beta-sheet含量低于30wt％，且不溶于水。为得到上述丝蛋白海绵，本申请提供了所述丝蛋白海绵的制备方法，其首先将丝蛋白水溶液密封培育后再与高结晶丝蛋白纳米纤维溶液混合，再将得到的混合溶液冷冻后冻干，得到丝蛋白海绵。在上述过程中，丝蛋白在密封培育后丝蛋白的构象逐渐向中间态转变，由此部分转变的丝蛋白更容易在高晶纳米纤维诱导下继续变化，从而可降低高结晶丝蛋白纳米纤维的含量；在同高结晶丝蛋白纳米纤维溶液混合后，在高结晶丝蛋白纳米纤维的诱导下，丝蛋白继续向中间态和晶体结构变化；在冷冻的过程中，丝蛋白的构象进一步向中间态转化，并逐步靠近结晶态，同时在丝蛋白中形成结晶颗粒，最后在冻干阶段，形成主要由非晶构象的丝蛋白纳米纤维组成，且结晶颗粒冻干在丝蛋白纳米纤维中形成多孔结构，最终得到了多孔-非晶结构的且不溶于水的丝蛋白海绵。

附图说明

图1为本发明采用的高结晶丝蛋白纳米纤维的宏观图；

图2为本发明采用的高结晶丝蛋白纳米纤维的微观图；

图3为本发明采用的高结晶丝蛋白纳米纤维的红外光谱图；

图4为本发明实施例2制备的丝蛋白多孔海绵的扫描电镜图(高倍)；

图5为本发明实施例2制备的丝蛋白多孔海绵的扫描电镜图(低倍)；

图6为本发明实施例2制备的丝蛋白多孔海绵的ftir图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

本发明实施例公开了一种丝蛋白海绵，所述丝蛋白海绵的beta-sheet含量低于30wt％，所述丝蛋白海绵不溶于水。

本申请提供了一种丝蛋白海绵，其beta-sheet含量低于30wt％，具有贯通的多孔结构。本申请所述丝蛋白海绵不溶于水，在水中稳定性较好，生物相容性更好。本申请的丝蛋白海绵具有可控的孔结构，孔径在50～500μm可调。

由此，本申请提供了上述丝蛋白海绵的制备方法，包括以下步骤：

a)，将丝蛋白水溶液密封培育后与高结晶丝蛋白纳米纤维溶液混合，得到混合溶液；

b)，将所述混合溶液冷冻后冻干，得到丝蛋白海绵。

本申请以少量高结晶的丝蛋白纳米纤维为诱导剂，经与处理的丝蛋白溶液混合，再依次经过冷冻与冻干，得到了丝蛋白海绵。

在制备丝蛋白海绵的过程中，本申请首先将丝蛋白水溶液密封培育；经过密封培育后，无规丝蛋白的构象逐渐向中间态转变。所述丝蛋白为本领域技术人员熟知的丝蛋白，对此本申请没有特别的限制。所述密封培育的温度为35～70℃，时间为6～48h；在具体实施例中，所述密封培育的温度为40～60℃，时间为8～24h。所述密封培育的温度和时间影响丝蛋白转化的程度，因此也会影响最终获得的丝蛋白海绵在水中的稳定性、多孔结构以及力学性能等。

在丝蛋白溶液经过密封培育后将其与高结晶丝蛋白纳米纤维溶液混合，得到混合溶液。高结晶丝蛋白纳米纤维具有诱导普通丝蛋白构象变化和纳米纤维形成的作用，因此高结晶丝蛋白纳米纤维能够诱导普通丝蛋白溶液中的丝蛋白向中间态和bata-sheet晶体结构转化，除此之外，高结晶丝蛋白纳米纤维的直径和长度会对丝蛋白在冷冻过程中的排布有影响，最终影响丝蛋白海绵的孔结构以及力学性能。由于密封培育后的丝蛋白溶液中的丝蛋白已经发生了部分转变，因此丝蛋白更容易在高结晶丝蛋白纳米纤维诱导下继续变化，从而在低含量的高结晶丝蛋白纳米纤维下可获得不溶于水的多孔海绵。所述高结晶丝蛋白纳米纤维溶液中的高结晶丝蛋白纳米纤维与所述丝蛋白溶液中的丝蛋白的质量比为1：(15～60)，在具体实施例中，所述高结晶丝蛋白纳米纤维溶液中的高结晶丝蛋白纳米纤维与所述丝蛋白溶液中的丝蛋白的质量比为1：(20～50)。高结晶丝蛋白纳米纤维的含量增加会提高对普通丝蛋白向晶体结构转化的程度，因此导致丝蛋白海绵结晶度升高，硬度增加；同时高结晶丝蛋白纳米纤维含量的增加会降低溶液的均匀性，从而使得制备多孔海绵的均匀性降低，因此，为制备不溶于水的低结晶含量的多孔海绵材料，高结晶丝蛋白纳米纤维的量越低越好，但含量过低，对诱导普通丝蛋白向中间态和beta-sheet结晶的转化能力也会降低，而导致所制备多孔海绵溶于水，因此，需要在尽可能低的情况下，保持一定量的高晶丝蛋白纳米纤维。所述高结晶丝蛋白纳米纤维溶液的高结晶丝蛋白纳米纤维以beta-sheet结构为主，高结晶丝蛋白纳米纤维的直径为10～20nm，长度为200nm～3μm。示例的，所述高结晶丝蛋白纳米纤维溶液的制备过程具体为：

(1)将普通丝蛋白溶液在40～60℃缓慢浓缩，获得浓度为10％左右的溶液；

(2)将溶液转移到常温继续浓缩至20％左右，在此过程中丝蛋白转变成亚稳态的纳米颗粒；

(3)将浓缩液加水稀释至0.5％～2％，放置到60℃密封培育，获得高晶丝蛋白纳米纤维。

本申请然后将混合溶液进行冷冻，以使混合溶液中的丝蛋白继续向中间态结构转变，同时在丝蛋白中形成结晶颗粒，为后续形成多孔结构做准备。在上述过程中，所述冷冻的温度为-4～-12℃，所述冷冻的时间为8～48h；在具体实施例中，所述冷冻的温度为-5～-10℃，所述冷冻的时间为10～24h。所述冷冻温度和时间会影响丝蛋白转化的速率和程度，冷冻温度过低，时间过短，丝蛋白构象转化不足，所制备多孔丝蛋白海绵会溶于水；冷冻温度过高，时间过长，则会导致凝胶形成，因此冷冻必须保持在一定温度和时间范围。同时，冷冻温度和时间的作用同前面高晶丝蛋白纳米纤维含量以及密封培育的时间和温度息息相关，具有协同作用，需要根据前面的变化做相应调整，而不能单独调控。

按照本发明，最后将冷冻后的丝蛋白进行冻干，得到丝蛋白海绵。此过程可去除结晶颗粒，在丝蛋白中形成多孔结构，且使丝蛋白的构象转化为非晶态。所述冻干的温度为-20～-90℃，时间为12～48h；在具体实施例中，所述冻干的温度为-40～-70℃，所述冻干的时间为24～36h。所述冻干过程中的温度和时间除了影响水的去除，也会对丝蛋白的构象转化有一定影响，从而影响丝蛋白海绵的结构和性能。

本申请中每个步骤均是对丝蛋白的结构和构象转化的程度进行调控，最终通过协同作用获得不溶于水的低晶丝蛋白多孔海绵；首先密封培育使得普通丝蛋白从无规向中间态结构部分转化，使其更容易被高晶纳米纤维诱导；随后加入高结晶丝蛋白纳米纤维继续诱导普通丝蛋白向纳米纤维以及中间态转化，并通过高晶纳米纤维的量控制进一步转化的程度；随后将冷冻温度和时间调控到合理范围，进一步调控丝蛋白向中间态转化的程度，最后通过冻干过程，使得丝蛋白在低结晶含量下获得不溶于水的性能。

本发明提出一种由高结晶丝蛋白纳米纤维诱导的不溶性低晶丝蛋白多孔海绵及其制备方法，制备得到的丝蛋白海绵在水中具有稳定性，结构均匀，晶体结构含量低，孔径可在50～500μm调控。在制备丝蛋白海绵的过程中，本发现显著降低了高结晶丝蛋白纳米纤维的使用量，从而避免了过多纳米纤维导致的部分丝蛋白聚集沉淀的问题，提高了材料的均匀性，同时也显著降低了最终材料中的beta-sheet含量，使得材料具有更好的亲水性和生物相容性。

本发明的核心技术在于在利用高结晶纳米纤维诱导的同时，通过温度培育前处理促进丝蛋白向中间态转化，随后通过冷冻过程中温度和时间的精细调控来改变丝蛋白相互作用，将上述三种因素有机结合，利用不同因素的协同作用，从水溶液中直接获得不溶于水的低晶丝蛋白多孔海绵。尽管上述的关键条件看似采用的常规技术，但其核心在于对丝蛋白纳米纤维本身状态和丝蛋白组装过程的深入理解，以及不同参数的协同作用，不同的参数之间具有极高的关联性，不考虑丝蛋白的本身状态和不同因素对丝蛋白组装影响，而机械套用上述参数并不会制备出具有不溶性的非晶海绵。

与现有制备多孔丝蛋白海绵的方法相比，本申请以更少量的高结晶丝蛋白纳米纤维作为诱导剂，解决了纳米纤维含量过高导致的不均匀问题，制备的丝蛋白多孔海绵具有更好的质量；同时高结晶丝蛋白纳米纤维含量的降低，也显著降低了所制备丝蛋白海绵的晶体含量，使得材料具有更好的亲水性和生物相容性；通过温度培育前处理和冷冻温度精细调控结合，调控丝蛋白的结构转化，实现了更低含量高结晶丝蛋白纳米纤维诱导下，不溶于水的丝蛋白多孔海绵材料的制备，解决了高结晶丝蛋白纳米纤维诱导制备多孔海绵方法中，纳米纤维含量，水不溶性以及均匀性之间的固有矛盾；整个过程主要通过温度的控制来诱导丝蛋白分子的相互作用，直接从水溶液中制备出不溶于水的丝蛋白海绵，而不需要添加任何其他物质或者进行任何后处理，条件温和，工艺简单，具有更好的可生产性。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的丝蛋白海绵的制备方法进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

实施例1

(1)将普通丝蛋白溶液在40～60℃范围内缓慢浓缩，获得浓度为10％左右的溶液；

(2)将溶液转移到常温继续浓缩至20％左右，在此过程中丝蛋白转变成亚稳态的纳米颗粒；

(3)将浓缩液加水稀释至0.5％～2％，放置到60℃密封培育，直到获得高结晶丝蛋白纳米纤维。

图1与图2分别为本实施例制备的高结晶丝蛋白纳米纤维的宏观图和微观图，图3为本实施例制备的纳米纤维的红外光谱；由图可知，本实施制备的高结晶丝蛋白纳米纤维为溶液状态，纤维直径在10～20nm之间，长度在200nm～3μm之间，红外光谱表明其构象主要为beta-sheet晶体。

以下实施例采用的高结晶丝蛋白纳米纤维均由实施例1制备得到。

实施例2

(1)将一定浓度的普通丝蛋白溶液在40℃密封培育48h后，同高结晶丝蛋白纳米纤维溶液混合，高结晶丝蛋白纳米纤维同普通丝蛋白的质量比为1:40，获得两种丝蛋白的混合水溶液，并注入模具；

(2)将注入模具的丝蛋白纳米纤维溶液在-7℃冷冻24h，形成冰状物；

(3)将冷冻后的冰状物放置于冻干机中，冷阱温度为-63℃，冻干48h，获得不溶于水的丝蛋白海绵。

图4和图5分别为本实施例制备的多孔丝蛋白海绵材料的高倍电镜图与低倍电镜图，由图可知，本实施例制备的多孔丝蛋白海绵的孔径在100～200μm之间，孔壁由纳米纤维组成。图6为本实施例制备的多孔丝蛋白海绵的ftir图，由图可知，本实施例制备的多孔丝蛋白海绵的支架为低晶结构。

将本实施例制备的丝蛋白海绵放置到水中培育24小时后，干燥，称量培育前后的质量变化，发现丝蛋白海绵的质量损失低于5％，证明丝蛋白海绵具有良好的水稳定性。

实施例3

(1)将一定浓度的普通丝蛋白溶液在60℃密封培育12h后，同高结晶丝蛋白纳米纤维溶液混合，高结晶丝蛋白纳米纤维同普通丝蛋白的质量比为1:30，获得两种丝蛋白的混合水溶液，并注入模具；

(2)将注入模具的丝蛋白纳米纤维溶液在-4℃冷冻48h，形成冰状物；

(3)将冷冻后的冰状物放置于冻干机中，冷阱温度为-20℃，冻干24h，获得不溶于水的丝蛋白海绵。

实施例4

(1)将一定浓度的普通丝蛋白溶液在70℃密封培育6h后，同高结晶丝蛋白纳米纤维溶液混合，高结晶丝蛋白纳米纤维同普通丝蛋白的质量比为1:15，获得两种丝蛋白的混合水溶液，并注入模具；

(2)将注入模具的丝蛋白纳米纤维溶液在-12℃冷冻8h，形成冰状物；

(3)将冷冻后的冰状物放置于冻干机中，冷阱温度为-90℃，冻干24h，获得不溶于水的丝蛋白海绵。

实施例5

(1)将一定浓度的普通丝蛋白溶液在50℃密封培育16h后，同高结晶丝蛋白纳米纤维溶液混合，高结晶丝蛋白纳米纤维同普通丝蛋白的质量比为1:15，获得两种丝蛋白的混合水溶液，并注入模具；

(2)将注入模具的丝蛋白纳米纤维溶液在-4℃冷冻48h，形成冰状物；

(3)将冷冻后的冰状物放置于冻干机中，冷阱温度为-40℃，冻干36h，获得不溶于水的丝蛋白海绵。

实施例6

(1)将一定浓度的普通丝蛋白溶液在70℃密封培育48h后，同高结晶丝蛋白纳米纤维溶液混合，高结晶丝蛋白纳米纤维同普通丝蛋白的质量比为1:60，获得两种丝蛋白的混合水溶液，并注入模具；

(2)将注入模具的丝蛋白纳米纤维溶液在-4℃冷冻48h，形成冰状物；

(3)将冷冻后的冰状物放置于冻干机中，冷阱温度为-60℃，冻干48h，获得不溶于水的海绵材料。

对比例1

(1)将一定浓度的普通丝蛋白溶液不进行温度培育，直接同高结晶丝蛋白纳米纤维溶液混合，高结晶丝蛋白纳米纤维同普通丝蛋白的质量比为1:60，获得两种丝蛋白的混合水溶液，并注入模具；

(2)将注入模具的丝蛋白纳米纤维溶液在-4℃冷冻48h，形成冰状物；

(3)将冷冻后的冰状物放置于冻干机中，冷阱温度为-60℃，冻干48h，获得海绵材料，材料由非晶结构组成，完全在水中溶解。

对比例2

(1)将一定浓度的普通丝蛋白溶液在70℃密封培育6h后，同高结晶丝蛋白纳米纤维溶液混合，高结晶丝蛋白纳米纤维同普通丝蛋白的质量比为1:15，获得两种丝蛋白的混合水溶液，并注入模具；

(2)将注入模具的丝蛋白纳米纤维溶液在-20℃冷冻8h，形成冰状物；

(3)将冷冻后的冰状物放置于冻干机中，冷阱温度为-90℃，冻干24h，获得丝蛋白海绵，材料由非晶结构组成，完全在水中溶解。

对比例1和对比例2均为将相关实施例中的其中单个因素调整到本申请范围外，其它参数保持不变，但所获得海绵均未获得在水中的稳定性，证明了不同因素之间的高度相关性。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。