本发明涉及兽药技术领域，特别涉及一种防治副猪嗜血杆菌病的药物，具体为大黄酸或/和其衍生物，本发明还涉及所述药物的用途。
背景技术：
副猪嗜血杆菌(haemophilusparasuis，hps)普遍存在于猪的上呼吸道中，能够引起猪的格拉赛尔氏病(
目前，国内外对副猪嗜血杆菌病的防治方法主要是抗生素药物防治和疫苗免疫。许多养殖户和生产企业采取抗生素拌料的方式对整个猪群进行预防，发病猪群选用敏感抗生素大剂量肌肉注射进行治疗。但在防治过程中由于不科学的、盲目的滥用抗生素，不但导致该病对很多抗生素产生了耐药性，延误了病情，还导致动物体内抗生素毒性残留，给食品安全带来了潜在威胁。而疫苗免疫由于副猪嗜血杆菌众多血清型间的交叉保护力低不能对该病提供完全有效的免疫保护。鉴于该病在养猪业中危害的严重性、滥用抗生素带来的负面影响以及疫苗免疫经常失败的应用现状，必须研究开发一种能够很好地防治该病的安全无耐药性产生的新兽药并推广应用。
基于发明者的知识，目前没有报道显示大黄酸及其衍生物制备用于预防和/或治疗的药物用途更是没有报道。
参考文献：
1.zhoux,xux,zhaoy,chenp,zhangx,chenh,caix.distributionofantimicrobialresistanceamongdifferentserovarsofhaemophilusparasuisisolates.veterinarymicrobiology,2010,141:168-173.
2.贾爱卿，李春玲，王贵平等.副猪嗜血杆菌毒力因子的研究现状.畜牧与兽医，2008,40:92-94.
3.万世平，王建，葛菲菲等.副猪嗜血杆菌毒力因子的研宄进展.畜牧与兽医，2010,42:101-104.
4.薛国聪，任涛.副猪嗜血杆菌病流行病学及致病因子的研宄进展.中国畜牧兽,2009,36:168-171.
5.oliveiras,pijoanc.haemophilusparasuis:newtrendsondiagnosis,epidemiol-ogyandcontrol.vetmicrobiol.2004,99:1-12.
6.costa-hurtadom,ballesterm,galofré-milàn,darjia,aragonv.vtaa8andvtaa9fromhaemophilusparasuisdelayphagocytosisbyalveolarmacrophages.vetres.2012,27:43-57.
7.naritam,kawashimak,matsuuras,uchimuraa,miuray.pneumoniainpigsinfectedwithpseudorabiesvirusandhaemophilusparasuisserovar4.jcomppathol.1994,110:329-39.
8.kimj,chunghk,jungt,chows,choic,chaec.postweaningmultisystemicwastingsyndromeofpigsinkorea:prevalence,microscopiclesionsandcoexistingmicroorganisms.jvetmedsci.2002,64:57-62.
9.蔡旭旺，陈焕春.副猪嗜血杆菌病的危害及其防治策略.养殖与饲料，2004,6:34-37.
10.strawbe,allairesd,meigelingwl,taylordj.diseasesofswine.8thedition.ames,lowa,usa:lowastateuniversitupress,1999,475-481.
技术实现要素：
本发明的一个目的是经过筛选后补化合物而提供一种新型的防治副猪嗜血杆菌病的药物，安全无耐药性；本发明的另一个目的是提供该种药物作为制备预防或治疗由副猪嗜血杆菌引起的相关疾病药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明提供的一种防治副猪嗜血杆菌病的药物是大黄酸或大黄酸衍生物，其分别由下式(i)或(ii)所定义：
包括其单独的异构体、异构体的外消旋或非外消旋混合物、氧化物、或其药学上可接受的盐和水合物
其中，r1选自-cooh或-so3h；r2～r6选自氢、烃基、卤素、-cn、-oh、-n3、-no2、-n(r)2、
-ch═nr、-or、-cor、-ocor，其中，r为甲基或乙基。
本发明涉及所述的取代基为烷基、环烷基、环烯基、烯基、炔基或芳基；其中，烷基的碳的数目为1-10，环烷基的碳的数目为3-8，环烯基的碳的数目为5-6，烯基的碳的数目为2-6，炔基的碳的数目为2-6，芳基的碳的数目为6-10。
在本发明的另一个方面，所提供的药学上可接受的盐选自钾盐或钠盐。
在本发明的又一个方面，提供了所述药物的可选剂型为口服制剂、外用制剂、吸入制剂、经鼻制剂、经直肠制剂、经皮制剂或注射制剂。优选为口服制剂。
在本发明的在一个方面，对已经患有或正在患有或处在患有副猪嗜血杆菌病的风险的猪猪施用预防和/或治疗有效量的含有大黄酸及其衍生物的药物。
所述有效量包括对猪每天施用约0.1mg/kg至约10000mg/kg体重的。
在本发明的再一个方面，提供了含有大黄酸或/和其衍生物的药物组合物，在所述的药物组合物中，大黄酸或/和其衍生物所占比例，以重量计，占整个制剂的总重量为10％-80％。
在国际上，发明人使用从天然中草药中筛选获得了一个无任何毒副作用的大黄酸及其衍生物，首次有效地防止和/或治疗副猪嗜血杆菌病。做到科学用药，有的放矢。也是首次发现了副猪嗜血杆菌病的这种功能，填补了中草药现代化的国内、国际空白，利于猪的康复，生产和产量的提高。
具体实施方式
为了提供对本发明的实质性理解，在下文中以不同的详细程度描述了本发明的某些方面、模式、实施方式、变型和特征。
在实施本发明的过程中，使用了动物学、药物有机化学、细胞生物学、免疫学、微生物学等很多传统技术。这些技术是熟知的。
下面结合实施例对本发明作进一步详细描阐述：
一种防治副猪嗜血杆菌病的药物是大黄酸或大黄酸衍生物或其药用盐，所述的大黄酸衍生物为具有通式(1)的化合物，
其中，r1选自-cooh或-so3h；r2～r6选自氢、烃基、卤素、-cn、-oh、-n3、-no2、-n(r)2、
-ch═nr、-or、-cor、-ocor，其中，r为甲基或乙基。
本发明涉及所述的取代基为烷基、环烷基、环烯基、烯基、炔基或芳基；其中，烷基的碳的数目为1-10，环烷基的碳的数目为3-8，环烯基的碳的数目为5-6，烯基的碳的数目为2-6，炔基的碳的数目为2-6，芳基的碳的数目为6-10。
本发明提供的的药用盐选自钾盐、钠盐。
本发明还涉及所述的大黄酸或大黄酸衍生物或其药用盐作为制备预防或治疗由副猪嗜血杆菌引起的相关疾病药物中的应用。
本发明的药物和制备方法在如下实施例中更详细地叙述，但实施例不构成对本发明的限制。
本领域技术人员可以理解，所述大黄酸及其衍生物包括其单独的异构体、异构体的外消旋或非外消旋混合物、氧化物、或其药学上可接受的盐和水合物。
在本发明的一个具体实施方式中，通过对大黄酸化合物进行基团修饰，如氨基化、羧基化、醛基化、苄基化等化学修饰，可制备活性以及理化特性不同的大黄酸化合物衍生物。
在本发明的一些具体实施方式中，制备了本发明的黄酸衍生物。所述的大黄酸衍生物包括但不限于：2,4,5,6,7-五甲基大黄酸(hx-1)、7-乙基大黄酸衍生物(hx-2)、7-乙酰基大黄酸衍生物(hx-3)、7-乙烯基大黄酸衍生物(hx-4)、7-溴代大黄酸衍生物(hx-5)等。
本说明书中使用的一些术语的定义，除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。
大黄酸及其衍生物的预防用途和治疗用途
在本发明的一个实施方式中，通过使用潜在的候选者化合物进行筛选动力学实验，本领域技术人员筛选具有对副猪嗜血杆菌菌株的预防和治疗作用。特别地，通过候选者化合物的动力学筛选实验确定大黄酸及其衍生物能够完全预防和治疗副猪嗜血杆菌菌株。
本文中使用的术语“治疗”或指的是治疗处理措施和预防的或防止的措施，其中，防止或减缓(减弱)受试者的患有的病理症状或失调。如果接受了根据本文所述的方法的治疗量的大黄酸及其衍生物，则受试者的症状得到成功地“治疗”，受试者显示，可以观察到和/或测定到症状的一种或多种迹象和症状减少和消失。还应当理解，本文描述的治疗或防止医疗状况的各种模式意在表示“显著”，其包括全部治疗或者预防以及小于全部治疗或者预防，其中达到了某种生物学相关或医学相关的结果。
本发明的一个具体实施方式中，对受试者施用预防和/或治疗有效量的含有大黄酸及其衍生物的药物。
本文中使用的术语“有效量”指的是足以获得所需的治疗和/或预防效果，例如引起预防或减轻与病理症状或疾病的症状的量。给药至受试者的组合物的量将取决于疾病的类型和严重性以及个体的性质，比如平时的健康情况、年龄、性别、体重和对药物的耐受力。所述量还取决于患病程度、严重性和类型。本领域技术人员将能够根据这些因素和其他因素来确定合适的剂量。所述组合物还可结合一种或多种其他的治疗化合物来给药。在本文描述的方法中，本发明的化合物可以给药至具有病理症状的一种或多种迹象或病理症状的受试者。例如，“治疗有效量”是指最小程度地减轻症状的生理作用的平均水平。
通常，所述剂量将能够预防或减轻所治疗状况或指征的严重性或扩展。正确的剂量将依赖于环境，例如所治疗的状况、给药时间表、所述化合物是否单独施用或者与另一种治疗剂结合施用、所述化合物的血浆半衰期和受试者的整体健康状况。
可以采用包括口服，外用，吸入，经鼻，经直肠，经皮或注射施用方式对受试者用药。
在本发明的一个具体实施方式中，制备了含有对于本文公开的所述化合物，每日给药剂量方案为约0.1mg/kg至约10000mg/kg体重、优选为约1mg/kg至约1000mg/kg体重、更优选为1mg/kg至约500mg/kg，最优选为1mg/kg至约200mg/kg体重。每日可施用1至6次，优选每日施用2或3次。间隔也可以是不规则的，本领域技术人员公认化合物或其药学上可接受的盐的最佳量和单次给药的间隔将由待治疗状况的性质和程度，给药的形式、途径和位点以及所治疗的受试者的具体情况而确定，并且可以常规技术确定最优选方案。本领域技术人员还应该理解，治疗的最佳过程，即在给定的天数内每日给予的化合物或其药学上可接受的盐的给药数量可以由本领域技术人员利用常规的治疗测试方法而确定。在治疗应用中，在相对短的时间间隔中有相对高的剂量有时是需要的，直到疾病的进程减缓或终止为止，且优选地直到受试者显示部分或完全地改善了所述疾病或病理症状。因此，患者可以对患者实行预防性的给药方式。本领域技术人员将认识到，某些因素可以影响有效地治疗一受试者的剂量和时间，包括但不局限于疾病或失调的严重程度、先前的治疗、健康情况和/或受试者的年龄以及存在的其它疾病。而且，利用本文描述的治疗有效量的治疗对照组合物来治疗一受试者可以包括单次治疗或一系列治疗。
本发明的化合物可以与至少一种其他中草药一起施用。中成药可选用柴胡、当归、丹参、桂枝、白芍、陈皮、清半夏、透骨草、羌活、生地黄、桔梗、木瓜丸、大活络丹、小活络丹、香附、白芥子、草乌、黑附片、忍冬藤、秦艽、桑枝、茯苓。本领域技术人员可以理解与本发明的化合物一起施用的上述化合物可以根据所述的不同疾病或病理症状做出选择。
所述化合物或中草药可以作为单独的制剂或者组合在单位剂型中同时施用，或者顺次施用。在任何情况下，多种治疗剂可以以任何顺序或甚至同时给药。如果同时地，所述多种治疗剂可以提供为单一、统一的形式或者以多个形式(例如，作为单一的片剂或者各自独立的片剂或胶囊的两种不同制剂)。所述治疗剂中的一种治疗剂可能以多剂量型提供，或者其中的两种可以作为多剂量型提供。如果不同时地，则多次剂量之间的时间间隔可以从大于0周到小于约1周、小于约2周、小于约4周、小于约2个月、小于约4个月或甚至小于约半年的范围中变化。
本文使用的术语“单位剂型”是指适合作为用于人和动物受试者的单位剂量的在物理上分离的单元，各单元包含单独的预定量的化合物或者与其它试剂组合，其量经计算足以与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介组合产生期望效果。
在本发明的具体实施方式中，制备含有大黄酸或其衍生物的药物组合物，其用于治疗和/或预防副猪嗜血杆菌菌株的病理症状或疾病。其通过口服、外用、吸入法等方式，对受试者给药而发挥作用。因此本发明的药物组合物可以制备成各种剂型，例如，用于口服用药的组合物可以为胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂、含片、泡腾片、糖浆、乳化物、控释的制备物、快速溶解的制备物、口服液体剂型等；用于外用用药的组合物可以为涂抹剂型药物、霜剂、外敷、软膏、外用药水、液体喷雾剂和气喷雾剂等。用于吸入法给药的组合物可以为溶液、分散液、干粉等；也可以从属植物提取高纯度的大黄酸化合物，制备脂质体包裹的纳米大黄酸，制备成注射制剂以及缓释药物剂型。在所述的药物组合物中，大黄酸或者其衍生物所占比例，以重量占整个制剂的总重量为0.0％-99.0％，优选地0.0％-90％，更优选地为10％-80％，最优选为25-70％。
在本发明药物制剂中，以口服制剂为例，所用药学上可接受的辅料包括但不局限于润滑剂，如羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸镁，硬脂酸钙，或硬脂酸锌，硬脂酸、山嵛酸甘油酯、十八烷基富马酸钠、滑石、硅胶；崩解剂，如淀粉、环糊精；稀释剂或压缩剂，如山梨糖醇、微晶纤维素、乳糖、蔗糖、甘露醇木糖醇、赤藻糖醇；调味料或其它成分，如草莓、桔子、香蕉、薄荷、蜂蜜。
载体颗粒可以为乳糖或蔗糖的晶体或球体；或复合球体或颗粒，如通过用淀粉作为粘合剂使蔗糖成粒状形成的糖的球体，通过淀粉作为粘合剂形成的碳酸钙球体或麦芽糊精。载体颗粒也可以是任何其他的医药可以接受的赋形剂的颗粒，如瓜尔豆胶颗粒、黄原胶颗粒/羟丙基纤维素颗粒。载体可以有多种形式，所有这些选择和量的调整显然在本领域技术人员的能力范围内。
通过如下实施例记载，更好地理解本发明，但不局限于该实施例。
实施例
实施例1大黄酸的抑菌活性
药品与试剂：
大豆酪蛋白琼脂培养基(tsb)、大黄酸、氨苄西林、dmso、马血清、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)、乙醇、均为分析纯试剂、pbs缓冲液(磷酸盐缓冲液0.0lmol/l，ph7.4，二水磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，蒸馏水1000ml)。
菌种：
副猪嗜血杆菌
实验方法：
培养基的配制
tsb培养基30g，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟备用。配置好的tsb培养基中每100ml加入5ml马血清和100μgnad。
试验菌的培养
在无菌室内，副猪嗜血杆菌菌株(1-25号菌株均为临床菌株)，于酒精灯下用接种针在试验菌株斜面上，刮取少量斜面菌苔，用一定量的无菌水制成菌悬液，然后取一定量加到己融化又冷却至50℃左右的tsb培养基中，摇匀，即刻倒入无菌培养皿中，待充分冷凝后用胶塞密封后，于37℃培养18-24h备用。吸取菌液iml，用tsb培养基按1：1000稀释，使菌液浓度约为105cfu/ml。
抗菌实验：
将待测药品溶于dmso中配制成2560/μml的溶液，然后用二倍稀释法将药品稀释成—定浓度梯度(128/μml，64/μml，32/μml，16/μml，8/μml，4/μml，2/μml，1/μml，0.5/μml，0.25/μml)与dmso中。于灭菌微量滴定板第一条中分别加入100ul的培养基，第二条为阳性对照，加入100μl菌悬液。其余的孔中加入90μl的菌悬液和10μl的药物溶液。每个药物溶液浓度平行3次。将处理完的培养皿于37℃培养24h，观察。
mic的测定
在每个微量滴定板都可以直观的测定其mic值之后，在板的每个孔中加入50μlpbs缓冲液(磷酸盐缓冲液0.0lmol/l，ph7.4，二水磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钠18.0g，氯化钾0.2g，蒸馏水l000ml)，其中包含2mgmtt/ml。在室温下继续孵育4-5h。将孔中的物质移出并加入100μl含有5％1m盐酸的异丙醇来萃取染料。继续在室温下孵育12h，于酶标仪测定各孔光吸收(od值)，测定波长550nm。根据各孔od值计算药物对细菌生长的最小抑制浓度。
实验结果
测得的mic见表l所示
表1大黄酸对细菌的抑制mic值(μg/ml)
实验表明，大黄酸对副猪嗜血杆菌有明显的抑制作用。
实施例2制备2,4,5,6,7-五甲基大黄酸(hx-1)
在250ml三颈瓶中依次加入大黄酸(1.42g，0.005mol)，dmf(50ml)，搅拌下加入碘甲烷(7.1g，0.05mol)和对甲苯磺酸(0.17g)，室温下，搅拌24h，tlc检测显示反应完全，加水(10ml)，在室温下，搅拌24h，将反应液中倒入500ml冰水中，过滤，将滤饼经真空干燥，得黄褐色固体1.6g，经硅胶柱分离，收集产物，减压回收溶剂后，得2,4,5,6,7-五甲基大黄酸0.60g，收率为33.9％。1h-nmr(cdcl3，300mhz)δ：13.7(s,1h)11.9(s,2h)，2.4～2.5(m,15h)。
实施例3制备7-乙基大黄酸衍生物(hx-2)
在250ml三颈瓶中依次加入大黄酸(1.42g，0.005mol)，dmf(50ml)，搅拌下加入溴乙烷(1.1g，0.01mol)和对甲苯磺酸(0.17g)，60℃下，搅拌2h，tlc检测显示反应完全，加水(10ml)，在室温下，搅拌24h，将反应液中倒入500ml冰水中，过滤，将滤饼经真空干燥，得黄褐色固体1.5g，经硅胶柱分离，收集产物，减压回收溶剂后，得7-乙基大黄酸0.31g，收率为21.4％。1h-nmr(cdcl3，300mhz)δ：13.7(s,1h)11.9(s,2h)，8.1(s,1h)，7.8(d,1h)，7.7(m,2h)，2.5(m,2h)，1.3(t,3h)。
实施例4制备7-乙酰基大黄酸衍生物(hx-3)
在250ml三颈瓶中依次加入7-乙基大黄酸衍生物(hx-2)(1.56g，0.005mol)，乙酸(150ml)，搅拌下加入铬酐(1.5g，0.015mol)，50℃下，搅拌4h，tlc检测显示反应完全，在室温下，将反应液中倒入500ml冰水中，过滤，将滤饼经真空干燥，得黄褐色固体1.5g，经硅胶柱分离，收集产物，减压回收溶剂后，得7-乙酰基大黄酸0.81g，收率为49.7％。1h-nmr(cdcl3，300mhz)δ：13.7(s,1h)11.9(s,2h)，8.1(s,1h)，7.9(d,1h)，7.8(d,1h)，7.7(s,1h)，2.6(s,3h)。
实施例5制备7-乙烯基大黄酸衍生物(hx-4)
在250ml三颈瓶中依次加入7-乙基大黄酸衍生物(hx-2)(1.56g，0.005mol)，dmf(50ml)，搅拌下加入溴代丁二酰亚胺(1.0g，0.006mol)，80℃下，搅拌7h，tlc检测显示反应完全，加入叔丁醇钾(0.6g，0.005mol)，在100℃下，搅拌1h，将反应液中倒入500ml冰水中，过滤，将滤饼经真空干燥，得黄褐色固体1.1g，经硅胶柱分离，收集产物，减压回收溶剂后，得7-乙烯基大黄酸0.11g，收率为7.01％。1h-nmr(cdcl3，300mhz)δ：13.7(s,1h)11.9(s,2h)，8.1(s,1h)，7.8(d,1h)，7.7(m,2h)，6.9(m,1h)，5.4(d,2h)。
实施例6制备7-溴代大黄酸衍生物(hx-5)
在250ml三颈瓶中依次加入大黄酸(1.42g，0.005mol)，dmf(50ml)，搅拌下，缓慢滴加溴素(0.8g，0.005mol)，0℃下，搅拌1h，tlc检测显示反应完全，将反应液中倒入500ml冰水中，过滤，将滤饼经真空干燥，得黄色固体1.1g，经硅胶柱分离，收集产物，减压回收溶剂后，得7-溴代大黄酸0.6g，收率为31.75％。1h-nmr(cdcl3，300mhz)δ：13.7(s,1h)11.9(s,2h)，8.1(s,1h)，7.8(d,1h)，7.7(m,2h)。
以副猪嗜血杆菌为受试菌株，对比大黄酸及部分大黄酸衍生物(hx-1、hx-2、hx-3、hx-4、hx-5)的最小抑制浓度(mic)，实验结果表明，大黄酸衍生物hx-1的抑菌活性与大黄酸相近，大黄酸衍生物hx-2、hx-3、hx-4、hx-5的抑菌活性优于大黄酸。
本发明不局限在本申请中描述的特定实施方式，用作本发明的单独的方面的单一说明。本领域技术人员将理解，可以不脱离本申请的精神和范围的情况下进行各种修改和改动。根据以上描述，除了本文中列举的以外，本公开的范围内的功能上等同的用途对于本领域的本领域技术人员而言是明显的。这样的改动和修改意欲落在所附权利要求的范围内。本公开仅受所附权利要求以及与这样的权利要求的的范围所等同的全部范围限制。应当理解，本公开不局限于特定的方法、试剂、组合物和生物系统，当然，所述方法、试剂、组合物和生物系统可以变化。还可理解，本文中使用的术语仅用于描述特定的实施方式，不用来是限制性的。
本文所参考的或引用的所有专利、专利申请、在先申请和出版物通过引用而全文并入本文，使得它们不与本说明书的明确教导相矛盾。在权利要求范围内提出其他的实施方式。