本发明涉及一种使用重组载体蛋白的肺炎球菌联合疫苗，属于生物
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：：一、病原微生物与疫苗能引起人体或动物体发生传染病的微生物，称为病原微生物或致病微生物。传染是指病原微生物侵入机体后，在一定的部位生长、繁殖，并引起一系列病理生理的过程。当病原微生物侵入机体后，病原微生物与机体互相作用，互相改变对方的活性与功能，因此能否引起传染病，一方面取决于病原微生物的致病能力即致病性或毒力，另方面还取决于机体的抵抗力即免疫力。病原性细菌引起传染的能力大小，就是细菌的毒力或致病性。细菌毒力的有无和毒力的强弱主要取决于它的侵袭力、产毒素性和引起超敏反应的能力。细菌产生的毒素可分为外毒素和内毒素两大类。外毒素是病原菌在生长繁殖期间分泌到周围环境种的一种代谢产物，主要由革兰氏阳性菌产生，少数革兰氏阴性菌也能产生。其化学组成是蛋白质，抗原性强，毒性也强，但极不稳定，对热和某些化学物质敏感，容易受到破坏。常见的如：白喉棒杆菌产生的白喉外毒素、破伤风梭菌产生的破伤风毒素、霍乱弧菌产生的肠毒素、肉毒梭菌产生的肉毒毒素等。大多数革兰氏阴性细菌能产生内毒素，实际上它存在于细菌细胞壁的外层，属于细胞壁的组成部分，一般情况下并不分泌到环境中，只有当细菌溶解后才释放出来，因而称为内毒素，其毒性比外毒素要低，抗原性也弱。同种生物的不同个体，当它们与病原菌接触后，有的患病，有的则安然无恙，原因在于不同个体的免疫力不同。免疫就是指机体识别和排除抗原异物(如病原微生物等)的一种保护性反应。一般来讲，它对机体是有利的，在异常条件下，也可能损害机体。人体的免疫分为非特异性免疫和特异性免疫。其中特异性免疫是指机体针对某一种或某一类微生物或产物所产生的特异抵抗力。而疫苗即是科学家研制出来使机体产生特异性免疫抵抗病原微生物对人体侵害的生物制品，通常由病原微生物本身加以制备而成的。细菌、病毒和立克次氏体等病原微生物制成疫苗，注射机体后，使机体产生特异性或致敏性淋巴细胞，分泌抗体，达到特异性免疫效果。而疫苗又分为治疗性和预防性两种，通过治疗性疫苗治疗疾病，并通过预防性疫苗保护人体不受致病性微生物的侵害。经过多年的努力，医学界已经开发出各种不同的疫苗用以预防，诸如细菌、病毒和真菌等，感染造成的各种疾病，极大地提高了人类的健康水平。生物技术的不断发展，促进了疫苗品种的多样化。用以预防病毒导致的传染病有灭活病毒技术开发出来的疫苗，如乙脑疫苗、脊髓灰质炎疫苗、流感疫苗等；减毒病毒技术开发出来的减毒活疫苗，如轮状病毒疫苗、口服脊髓灰质炎病毒疫苗、麻疹病毒疫苗、腮腺炎病毒疫苗、风疹病毒疫苗和水痘疫苗等。用以预防细菌性传染病的有用蛋白和多糖等生物大分子纯化技术开发出来的细菌类疫苗，如破伤风类毒素、白喉类毒素、百日咳类毒素及其亚细胞组分、流行性脑膜炎球菌多糖和23价肺炎球菌多糖等。更先进的有用半化学结合技术开发出来的预防脑膜炎和肺炎的细菌疫苗，如流行性嗜血杆菌b型多糖-蛋白缀合疫苗、7价或10价肺炎球菌多糖-蛋白缀合疫苗以及4价脑膜炎球菌多糖-蛋白缀合疫苗。通过对生物技术的不断改进，能够开发出更多的新型疫苗产品来应付不同的病原微生物对人类健康的挑战。二、黏膜免疫黏膜免疫系统广泛分布于呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道黏膜下及一些外分泌腺处的淋巴组织，是执行局部特异性免疫功能的主要场所。机体约有95％的细菌、病毒和寄生虫的感染都起始于黏膜表面。黏膜免疫系统是机体抵抗病原体入侵的第一道免疫屏障，具有独特结构和功能的独立免疫系统，对于防治病原体的定植和侵入有着积极意义。有别于传统的免疫系统，黏膜免疫系统是大量免疫细胞和免疫分子弥散在黏膜上皮或黏膜下固有层(弥散淋巴组织)，或由单个或多个淋巴滤泡聚集成的黏膜相关淋巴组织，机体50％以上的淋巴组织和80％以上的免疫细胞集中于黏膜免疫系统。黏膜免疫可以诱导局部黏膜产生分泌性iga(siga)、igm和igg等保护性抗体，并可诱导其它部位的黏膜也产生siga，这是黏膜免疫保护作用的主要机制。此外，黏膜免疫还诱导黏膜ctl反应，并且产生分泌ifn-c的cd4+t细胞，这对于病原体侵入的预防和清除是非常重要的。因此黏膜免疫是保护机体免于病原体侵犯的重要屏障，在疫苗的设计中具有重要意义。基于黏膜免疫的疫苗由于诱导的免疫往往反应较弱，持续时间短，难以取得理想的免疫保护效果。目前认为，如重组蛋白、合成多肽和dna等抗原的免疫原性较弱是重要原因之一，因此需要设法提高免疫反应的强度，并且还有一些疫苗需要转变免疫反应类型，以突出黏膜免疫等。这些方面的问题使佐剂的使用显得尤为迫切和重要，因此对于黏膜免疫佐剂的研究已经成为感染免疫和疫苗领域的一个研究热点。目前，已报道的黏膜免疫佐剂主要可分为三类:第一类是细菌性物质，包括蛋白(主要是细菌毒素)和核酸；第二类是各种细胞因子；第三类是抗原递送系统。细菌毒素中作为黏膜免疫佐剂最常使用的是大肠杆菌不耐热肠毒素(lt)和霍乱毒素(ct)，人们对其已进行了较多研究。紧密连接毒素(zonulaoccludenstoxin，zot)、细胞毒性坏死因子(cytotoxicnecrotizingfactor1，cnf1)和皮肤坏死毒素(dermonecrotictoxin，dnt)等是新近报道的具有黏膜佐剂功能的细菌毒素。lt和ct都是细菌毒素，其核苷酸序列同源性约80％，结构也基本相同。ct主要诱导抗原特异的cd4+th2型细胞，而lt则能诱导混合的cd4+th1和th2型细胞。ct和lt是强有力的黏膜免疫佐剂，但由于其具有毒性阻碍了其在人用疫苗领域的应用，因此构建去除毒性或降低毒性，同时保留佐剂属性的突变体是十分必要的。lt是迄今在人和动物实验中已被鉴定的最有效的黏膜免疫原之一。它能有效地介导针对lt的cd4+t细胞和b细胞反应。经消化道途径(口服或胃内途径)注射lt给小鼠，均可诱导高分泌性和全身性抗体应答，小鼠呼吸道分泌物和小肠内容物中均可查到大量的抗lt的iga抗体。取小肠黏膜作切片，在黏膜固有层淋巴集结可看到大量的浆细胞。lt诱导的黏膜分泌性抗体应答最强烈的是抗原沉积部位，但并不局限于抗原沉积部位，在其他黏膜效应部位也有同样的应答发生。lt和ltb都具有良好的免疫原性，ltb含有引起t特异性抗体应答的大部分优势抗原表位，两者均能有效地启动机体产生局部和全身的t细胞和b细胞免疫应答，还能使t、b细胞产生长期的记忆反应。lt两亚单位分别在其佐剂活性中是否发挥作用以及发挥多大作用，目前还存在很大争议。人们用缺乏gm1亲和力但保留完整adp-核糖基化活性的lt突变体作为佐剂免疫小鼠。发现具有与野生型lt一样的佐剂活性，因此认为与gm1结合的亲和力对lt的佐剂活性不是必需的。三、大肠杆菌及其流行病学大肠杆菌是大肠埃希氏菌(escherichiacoli，e.coli)的简称，被德国细菌学家theodorescherich最早于1885年从婴儿粪便中分离，是肠杆菌科(entero-bacteriaceae)、埃希氏菌属(escherichia)的成员，原名为bacteriumcolicommune，意思是指肠道常见细菌。实际上，只有少数一部分e.coli菌株可在肠道内直接导致宿主疾病，而大多数e.coli在肠道内是不致病的，但如果移位至肠道外面的组织或器官则可能引起肠外的感染。致病性e.coli并非为条件致病菌(如抵抗力降低、正常菌群比例失调或移位等)，而是某些血清型群(型)的大肠杆菌本身即为病原菌。对于肠内的致病性大肠杆菌，依据致病机理、临床症状和流行病学特点等的不同主要有以下几种类型：产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenice.coli，etec)、产志贺毒素大肠杆菌(shigatoxin-producinge.coli，stec)、肠出血性大肠奸菌(enterohemorrhagice.coli，ehec)、肠致病性大肠杆菌(enteropathogenice.coli，epec)和肠侵袭性大肠杆菌(enteroinvasivee.coli，eiec)等。此外，还有尿道致病性大肠杆菌(uropthogenice.coli，upec)、吸脱型大肠杆菌(attachingandeffacinge.coli，aeec)、产坏死性毒素大肠汗菌(necrotoxigenice.coli，ntec)、肠黏附性大肠奸菌(enteroaggregativee.coli，eaec)和肠集聚性大肠奸菌(enteroaggregativee.coli，eaggec)等。其中最常见的是etec引起的腹泻。etec最早流行于20世纪60年代晚期，是人和动物传染性腹泻的重要病原体之一。一些资料表明，etec是霍乱流行区土著成人居民中引起霍乱综合征的最常见病因；是发达国家乃至发展中国家儿童、旅行者腹泻最常见病因；也是水源与食物被粪便污染而引的起腹泻、恶心、低烧、腹部绞痛等重要因素之一。etec产生2种不同类型毒素即不耐热肠毒素(heat-labiletoxin，lt)和耐热肠毒素(heat-stabletoxin，st)。lt和st这两种毒素的物理性质有较大的不同，st在100℃，30min基本不失活，但lt在65℃，30min即完全失活。st分子量较低(<9000ku)，无抗原性，可分为st1和st2两种，其中st1在流行病学上起着重要作用，二者都激活鸟苷酸环化酶，使细胞内cgmp水平升高，扰乱电介质代谢，引起腹泻。lt与st不同之处在于，lt为一种免疫蛋白，与霍乱肠毒素(cholreatoxin，ct)有着较为密切关系，组成一个毒素家族。etec也可引起人体产生霍乱样腹泻，爽便性状和脱水症状与霍乱相似。根据毒素来源的不同，lt可分为人源(lt-h/hlt)和猪源(lt-p/plt)两人种类，它们化学性质和免疫特性均极为相似。根据编码基因不同，lt又分为两种类型：lt1和lt2。lt1由胞浆中的大质粒编码，在自然界中最为常见，是lt发挥生物学活性的主要成分。一般所说的lt大多都指lt1；而lt2由染色体dna编码产生。虽然它们的组成和作用方式相似，但无基因同源性及交叉免疫原性。以下所说的lt均指lt1。编码lt的基因全长1148bp，位于野生型产毒性大肠杆菌细胞装中的大质粒上。lt操纵子含有2个结构基因，分别为编码b亚单位的toxb基因和编码a亚单位的toxa基因，它们串连在一起并会被转录成1条mrna链。其中toxb基因位于toxa基因3'的末端，它的核糖体结合位点(ggga)位于toxa基因内，而且toxa3'端2个密码子(ttatga)和toxb5'端2个密码子(atgaat)有4个核苷酸相互重叠。b亚单位编码区基因全长372bp，编码由124个氨基酸组成的多肽；a亚单位编码区基因全长777bp，编码259个氨基酸的多肽。toxb在起始密码子前的3个核苷酸处有sd序列，其中的5个核苷酸可与16s核糖体rna3'端12个核苷酸中的5个互补，且近atg端碱基为a。这些结构有利于提高核糖体的结合效率，且toxbmrna的二级结构也有利于toxb基因的翻译，从而导致了在同一个启动子下游，toxb虽然位于远端，表达量却超过toxa的5倍之多。这种较为特殊的结构可能更便于毒素启动子对2个亚基起到较好的调控作用，调节它们的表达量，使之易于达到毒素合成的最好状态。胞浆中的a、b亚单位都以携带信号肽的前体存在。当穿越细胞膜后才会组装成完整的lt。b亚单位的作用是与真核细胞膜表面的gm-1神经节苷脂受体特异性结合，以便利于a亚单位进入靶细胞。a亚单位具有gtp依赖性的adp-核糖基化转移酶活性，通过g蛋白介导的adp-核糖基化反应扰乱细胞内camp的降解与平衡，刺激camp含量增高，从而引发毒性效应。lt-h和lt-p作用于不同的g蛋白，前者是gs蛋白，后者是gi蛋白，而最终效果都是导致蛋白激酶a失活，引起一系列的生化反应，引起camp含量增高，刺激肠道黏膜水与电解质的过度分泌，导致腹泻。ltb作为免疫佐剂的功能已被证实，且具有越来越高的关注度，但ltb单独作为载体蛋白的研究却少之又少，单独的ltb蛋白目前仅作为lta的载体使用，这大大限制了ltb的使用范围。ltb由于其具有良好的结构基础，与其他蛋白融合表达后构建的蛋白载体具有广泛的使用前景。四、霍乱弧菌概述ct是霍乱弧菌分泌的一种不耐热肠毒素，由一个毒性a亚基(cta)和五个完全相同的b亚基(ctb)组成，形成ab5结构。a亚基是一条单链，合成后常在194、195残基间裂解为cta1与cta2，以二硫键连接。其中cta1具有adp-核糖基转移酶活性，与ct的佐剂作用有密切关系，cta2则连接cta1和ctb。ctb的5个亚基彼此以非共价键结合成五聚体，再通过cta2环绕cta形成ab5结构。ctb五聚体的亚基间的结合力很强，大于它们与a亚基的结合力。ctb近年来作为免疫载体的应用受到广泛的重视，ctb作为无毒单位，具有结合gm1的功能，是毒性亚单位a紧密结合在肠道黏膜细胞表面，使融合蛋白更易与消化道黏膜作用，进而引起一系列生理生化反应，产生更强的免疫效果，ctb还可以作为某些外源多肽的稳定载体，当它与化学偶联或基因融合的抗原同时进入体内之后，会激起融合表位抗原的免疫原性，使机体产生强烈的免疫反应，达到免疫保护作用。ctb具有很强的免疫原性，可增强细菌病毒以及其他抗原的免疫原性，特别是经过黏膜免疫途径，不仅可以增强血清的特异性igg抗体应答，还可诱导较强的特异性能黏膜iga免疫应答，具有能加强抗原表位的抗原性的特点。ctb可以刺激抗原递呈细胞中树突状细胞对抗原的运输能力，树突状细胞用于运输抗原到淋巴器官，并激活抗原性cd4+和cd8+t细胞。ctb可以激活树突状细胞的成熟，使树突状细胞的树突更长，体积更大。ctb细胞还可以调节系内的t细胞反应，以及体内抗体的产生。五、肺炎球菌及其流行病学肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)简称肺炎球菌(pneumococcus)，寄居于正常人的鼻咽腔中，是细菌性大叶性肺炎、脑膜炎、中耳炎、肺炎、支气管炎的主要病原菌。肺炎球菌导致的疾病一直是全球严重的公共卫生问题，在全世界范围内有较高的发病率和病死率，尤其是对2岁以下的儿童和老人。目前已上市的肺炎球菌荚膜糖疫苗和荚膜糖蛋白质结合疫苗，其设计都基于肺炎球菌荚膜糖，涵盖了导致肺炎球菌性疾病的最常见血清型。但肺炎球菌荚膜糖为胸腺非依赖性抗原(thymusindependentantigen，ti-ag)，抗体反应主要依赖于其重复单位组成的线性表位，在无t淋巴细胞辅助的情况下直接与b淋巴细胞表面的igm受体交联，所诱导的抗体主要为igm和igg2，缺少较好的补体活化能力，抗体水平不能维持足够长的时间，且不能诱导免疫记忆，无法在2岁以下幼儿中产生免疫保护。荚膜糖复杂的结构导致每一个血清型的免疫原性不同，无法产生有效的免疫应答。肺炎球菌结合疫苗包括血清型别多，各型别用于结合的特异性结构不同，导致其每个型别的结合方法相异。对荚膜糖的修饰及与载体蛋白的结合要在保证荚膜糖特异基团不丢失、抗原性和免疫原性不受影响的前提下进行，同时为了避免糖链的过度交联和结合物除菌过滤的要求，对荚膜糖及结合物分子的大小应当有一定控制。7价疫苗于2000年2月在美国获准使用。由于肺炎球菌型别多，在结合疫苗的制作过程需要结合蛋白成分，因蛋白成分可以引起局部反应，所以生产包含12个型别以上的结合疫苗就很困难。结合疫苗在初次免疫后活的抗体浓度仅能维持几个月，随后就会下降到免疫前水平；并且结合疫苗的整个工艺过程中需要加入多种化学试剂参与反应，并且荚膜糖蛋白结合疫苗的血清型覆盖率低和非疫苗血清型肺炎球菌感染性疾病的增加使得更多研究者开始关注其他方向的肺炎球菌疫苗开发。使用重组载体蛋白的肺炎球菌联合疫苗已成为近十年来肺炎疫苗的研发主流，具有种属特异性抗原为基础的疫苗广受研发人员的重视，吸引了大量的目光。但由于蛋白本身的结构及理化性质的限制，很多肺炎球菌蛋白无法直接用于人体免疫，需要花费大量的人力和物力进行研究及临床验证。蛋白疫苗利用生物工程技术合成蛋白抗原，蛋白抗原由于其选用的均为高度保守的肺炎球菌特异性蛋白，从而消除了不同血清型之间的免疫差异，并且由于不需要其他类型的通用蛋白载体，消除了现有的肺炎球菌疫苗不能与通用载体蛋白同类型的疫苗同时联合使用的障碍；其蛋白抗原本身也可以作为载体蛋白与肺炎球菌荚膜糖进行自发性缀合，因此免疫效果更好，实现了特异性免疫与广泛免疫的联合实现。肺炎球菌由于其血清型多，导致其抗原本身的抗原结构大稳定性差，难以与其他疫苗联合共存使用，并且现有的肺炎球菌荚膜糖蛋白结合疫苗均用白喉或破伤风类毒素作为蛋白载体，这种疫苗的主要成分为血清型特异性的荚膜糖，对未包含在疫苗内的其他血清型肺炎球菌感染无效，即缺乏交叉免疫保护效果；并将与已在儿童常规免疫接种中使用的白喉及破伤风疫苗产生干扰，破坏现有的免疫效果。因此研究一款自身免疫原性够好能够稳定存在使用重组载体蛋白的肺炎球菌联合疫苗成为了疫苗研发领域的当务之急。技术实现要素：针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种使用重组载体蛋白的肺炎球菌联合疫苗。为实现上述发明目的，本发明提供的使用重组载体蛋白的肺炎球菌联合疫苗采用的技术方案如下：疫苗包括：肺炎球菌抗原及载体，其中载体为重组蛋白载体，由大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位(ltb)蛋白及霍乱弧菌肠毒素b亚单位蛋白(ctb)重组获得，所述疫苗中肺炎球菌抗原与重组载体蛋白为缀合连接。ltb核酸序列与ctb核酸序列通过引物序列桥接，构建的ltb-ctb核酸序列如序列表seqidno：5所示，编码的载体蛋白序列如序列表seqidno：6所示。编码ltb蛋白的核苷酸序列如序列表seqidno：1所示，其编码的氨基酸序列如序列表seqidno：2所示。编码ctb蛋白的核苷酸序列如序列表seqidno：3所示，其编码的氨基酸序列如序列表seqidno：4所示。肺炎球菌抗原包括肺炎球菌蛋白抗原、肺炎球菌多糖抗原和/或肺炎球菌多糖-蛋白缀合抗原。肺炎球菌蛋白抗原包括：肺炎球菌溶血蛋白及其改性衍生物、肺炎球菌表面蛋白及其改性衍生物、肺炎球具表面黏附蛋白及其改性衍生物、肺炎球菌三组氨酸蛋白家族及其改性衍生物和/或肺炎球菌黏附毒力因子。肺炎球菌蛋白抗原包括：肺炎球菌溶血蛋白ply、改性肺炎球菌溶血蛋白δa146ply、肺炎球菌溶血蛋白衍生物plyd1、肺炎球菌溶血蛋白衍生物plydb、肺炎球菌溶血蛋白衍生物plydt、肺炎球菌表面蛋白c、肺炎球菌表面黏附蛋白a、肺炎球菌表面黏附蛋白c、肺炎球菌三组氨酸蛋白d和/或肺炎球菌黏附毒力因子a。所述肺炎球菌多糖抗原是分离提纯血清型肺炎球菌荚膜上的荚膜多糖，所述血清型肺炎球菌的血清型包括1、2、3、4、5、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f和/或33f。进一步优选地，肺炎球菌多糖抗原的血清型包括4、6b、9v、14、18c、19f和23f。优选地，肺炎球菌荚膜糖与肺炎球菌蛋白的每种血清型与蛋白之间的质量比为1.5～4.5:1。为了便于保存和运输，以及维持疫苗的稳定性及免疫原性，使用重组载体蛋白的肺炎球菌联合疫苗的剂型为冻干制剂。使用重组载体蛋白的肺炎球菌联合疫苗还包括蔗糖，用于作为使用重组载体蛋白的肺炎球菌联合疫苗的冻干制剂的冻干保护剂。优选地，蔗糖的初始浓度不小于60％，优选为大于70％。优选地，蔗糖在冻干原液中的初始质量百分含量为不大于20％；较佳地，为4～20％；作为一种较佳的实施方式，根据所需制备的疫苗的不同为7～10％、8～10％、10～15％或12～15％；最佳为7％、8％、10％或12％。优选地，蔗糖选用工业级分析纯或药用级。作为本发明的一种优选的实施方式，使用重组载体蛋白的肺炎球菌联合疫苗包括：血清型4、6b、9v、14、18c、19f及23f与肺炎球菌蛋白、重组ltb-ctb载体蛋白的结合物。优选地，血清型4、6b、9v、18c及23f连接肺炎球菌蛋白，血清型14与19f连接重组ltb-ctb载体蛋白。更优选地，肺炎球菌蛋白为△a146ply。为了保证疫苗的免疫原性，使用重组载体蛋白的肺炎球菌联合疫苗的血清抗体水平≥0.35μg/ml。使用重组载体蛋白的肺炎球菌联合疫苗临用时复溶，混合均匀后肌肉注射。与现有技术相比，本发明采用重组载体蛋白连接肺炎球菌的多种荚膜糖，该载体蛋白还具有激活黏膜免疫的佐剂效果，与肺炎球菌抗原缀合后，不仅可以引起高滴度的血清抗体，还可以快速长时间的引起黏膜血清抗体。肺炎球菌抗体可选肺炎球菌蛋白及肺炎球菌荚膜多糖，当疫苗的价态较高时，可采用重组的蛋白载体与肺炎球菌同源蛋白组合使用，不仅能够增强现有肺炎球菌血清型引发的免疫反应，而且可以引起肺部的黏膜免疫。本发明中的使用重组载体蛋白的肺炎球菌联合疫苗具有一定的结构弹性，具有多种多糖蛋白的缀合组合，载体蛋白促进机体产生特异性抗原，但本身不致病，也不会产生交叉性的免疫影响，因此该疫苗具有很广泛的使用价值。附图说明图1是本发明提供的构建pet28a-ltb-ctb质粒的构建示意图。图2是本发明提供的构建pet28a-ltb-ctb质粒的质粒示意图。图3是本发明提供的重组ltb-ctb载体蛋白诱导纯化结果示意图。图4是本发明提供的小鼠呼吸道黏液中特异性抗体效价。图5是本发明提供的小鼠血清中特异性抗体效价。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。一、重组ltb和ctb蛋白的克隆和原核表达lt与ct等一样，lt是由a、b两种亚单位(lt-a和lt-b)组成的ab5型六聚体蛋白。a、b两个亚单位通过非共价键结合，单独的亚单位没有生物活性，只有结合在一起才具有全毒素的生物学和化学特性。a亚单位是毒素的毒力中心，分子量约为28kd，具有adp-核糖基化酶活性。用还原反应可将a亚单位切成a1(lt-a1)和a2(lt-a2)两个片段，a1片段和a2片段分别呈折叠结构和螺旋结构，二者通过二硫键相连。a1是lt毒素的活性部分，a2是与b亚单位相连的部分。当连接a1与a2的二硫键被还原时，具有酶活性的a1亚单位即被释放出来。b亚单位由两个α螺旋和六个β片层结构组成，其n-端的一个半胱氨酸残基与c-端的一个半胱氨酸残基形成二硫键，将分子的两个末端连接在一起。五个分子量约为11.5kd的分子排列在一起呈环状结构，可与鞭细胞上特异性受体神经苷酯gm1结合。a亚单位通过a2片段插入b亚单位五聚体中央，组成一个完整的lt分子。根据genebank登录的ltb和ctb核酸序列和氨基酸序列，具体序列如下：核酸，ltb核酸序列(375bp)如序列表seqidno：1所示，由此核酸序列编码出的氨基酸序列(124a.a，mw＝14133.74)如序列表seqidno：2所示。ctb核酸序列(375bp)如序列表seqidno：3所示，由此核酸序列编码出的ctb氨基酸序列(124a.a.mw＝13896.46)如序列表seqidno：4所示。选择pet28a作为载体，根据genebank登录的ltb和ctb的全长cds序列，设计引物如下：ltb-fwd由5’端至3’端依次为：保护碱基--bamhⅰ酶切位点--ltb蛋白n端序列。引物(如序列表seqidno：7所示)具体如下：5’-cg--ggatcc--atgaataaagtaaaatgttatgttttatttacggcgtta-3’ltb-rev由5’端至3’端依次为：保护碱基--eco311酶切位点--ctb蛋白n端序列--ltb蛋白c端序列。引物(如序列表seqidno：8所示)具体如下：5’-ctag--ggtctc--cat--gtttttcatactgattgccgcaa-3ctb-fwd由5’端至3’端依次为：保护碱基--eco311酶切位点--ltb蛋白c端序列--ctb蛋白n端序列。引物(如序列表seqidno：9所示)具体如下：5’-ctag--ggtctc--aac--atgattaaattaaaatttggtgttttttttacagtttta-3’ctb-rev由5’端至3’端依次为：保护碱基--xhoⅰ酶切位点--ctb蛋白c端序列。引物(如序列表seqidno：10所示)具体如下：5’-cc--ctcgag--ttaatttgccatactaattgcggcaa-3’如图1～2所示，构建pet28a-ltb-ctb质粒。由于ltb和ctb的具有较高的同源性，因此在ltb片段插入ctb的片段，以引物连接，搭桥进行pcr，可扩增得到重组ltb-ctb载体蛋白全长片段。构建的pet28a质粒的全序列如序列表seqidno：5所示，编码的氨基酸序如序列表seqidno：6所示。载体和pcr产物通过bamhⅰ和xhoⅰ双酶切后，凝胶回收ltb和ctb片段。胶回收后，用dna连接酶，16℃连接过夜，连接转化大肠杆菌dh5α，单克隆扩增，小提质粒后，bamhi和xhoⅰ双酶切鉴定的约800bp条带，在氨苄青霉素抗性下筛选阳性克隆，阳性筛选后测序，将测序结果在ncbi网站进行比对，结果完全正确。二、重组ltb-ctb载体蛋白的诱导表达和纯化重组ltb-ctb载体蛋白在20℃诱导30h，iptg浓度为0.3mmol/l，诱导条件最佳。诱导后去适量超声波裂解产物的上清和沉淀进行sds-page，同时设诱导前的蛋白做为对照。破菌后，发现表达蛋白质以包涵体形式存在。将包涵体洗涤后，用8mol/l的尿素溶解，经复性液复性，再经谷胱甘肽转硫酶(gst)亲和层析柱纯化，得到纯度约为93％的重组融合蛋白。sds-page结果显示重组菌裂解沉淀中出现一条约30kd的额外条带，与预期结果相近。由于蛋白主要以包涵体的形式表达，因此选择较低温度的长时间诱导，以保证蛋白表达量。诱导表达的纯化结果如图3所示，条带1为蛋白marker；2为诱导前总的蛋白；3为诱导后总的蛋白；4为细菌破碎液离心后上清；5为细菌破碎液离心后沉淀；条带6为冻干后的重组ltb-ctb载体蛋白。三、制备肺炎球菌蛋白-荚膜多糖结合体3.1.1肺炎球菌多糖(7价)的制备选取7种血清型(4、6b、9v、14、18c、19f、23f)的肺炎球菌发酵培养后，采用沙培离心机、碟片式离心机或其他大容量离心机分离培养液，收集离心上清；将离心上清以100kd膜包超滤浓缩，采用25～80％的乙醇进行分级沉淀，收集沉淀并用无水乙醇及丙酮分别洗涤，得到粗制多糖；灭菌注射用水溶解多糖并经脱氧胆酸钠处理后，采用离子交换填料，以串联层析或分步层析的方法进行粗糖精制，收集流穿峰，采gesephadexg25coarse对流穿峰进行脱盐，乙醇沉淀或冻干回收多糖，置于-20℃保存备用。3.1.2重组ltb-ctb载体蛋白肺炎球菌多糖结合物将纯化备用的重组ltb-ctb载体蛋白以氨基还原法与肺炎球菌荚膜多糖进行偶联，具体为将上述步骤获得的重组ltb-ctb载体蛋白与多种荚膜糖以1：2质量比混合。取各血清型多糖溶于ph7.2的150mmol/lpbs中，加入过碘酸钠(终浓度为2mmol/l)室温氧化10min，以制备10ml疫苗原液为例，加入荚膜多糖4、9v、14、19f及23f各40μg，寡糖18c20μg及多糖6b80μg，加入乙二醇(终浓度为25mmol/l)终止反应。用150mmol/lpbs透析3次后加入预先复溶的重组ltb-ctb载体蛋白160μg，室温轻轻搅拌5d，出现颗粒状结合物，在4℃离心10min收集。经凝胶层析柱层析纯化，得到纯化的肺炎球菌与重组ltb-ctb的结合物。重组ltb-ctb载体蛋白肺炎球菌多糖结合物可选择冻干剂型，便于储存与运输。冻干剂型蔗糖作为冻干骨架，其中蔗糖在冻干原液中的初始质量百分含量不大于20％，冻干后得到肺炎球菌荚膜糖-蛋白疫苗冻干制剂。3.1.3重组ltb-ctb载体蛋白肺炎球菌多糖结合物检验将结合产物通过凝胶过滤层析柱进行纯化，洗脱液为0.2mnacl，检测紫外280nm处的吸光值，收集个洗脱峰内的物质。采用sds-page法确认结合产物中含有重组ltb-ctb组分，并检测蛋白含量。采用苯酚-硫酸法检测多糖含量，确认产物中多糖含量约为95μg/ml。通过gm1-elisa检测结合产物是否与小肠表面的gm1结合，刺激黏膜系统产生黏膜iga。具体测定方法如下：1)包被：用碳酸盐包被缓冲液将gm1稀释至10μg/ml。在96孔板的每个反应孔中加100μl上述包被抗原，4℃放置过夜。次日，移去孔内溶液，用洗涤缓冲液pbst洗3次；2)封闭：加4％的bsa溶液200μl于上述已包被的反应孔中，37℃放置2小时。弃去封闭液，洗涤3次；3)加样：分别加入一系列稀释梯度的ctb溶液和结合物样品溶液，每孔100μl，置于37℃孵育1.5小时，然后洗涤3次；4)加一抗：每孔加入1：4000稀释的兔抗ctbigg抗体100μl，37℃孵育2小时；5)加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标驴抗兔igg抗体100μl，37℃孵育1小时，洗涤3次；6)加底物液显色：于各反应孔中加入tmb底物溶液100μl，室温放置10～15分钟；7)终止反应：于各反应孔中加入2m硫酸50μl；8)读数：在酶标仪上，于紫外450nm处检测各孔的吸光值，打印记录。检测结果显示，ctb纯蛋白的od值为0.30左右，且与gm1的结合能力稳定。重组ltb-ctb蛋白的od值在0.25～0.48之间波动，说明结合产物中的重组ltb-ctb仍然维持与gm1结合的能力，并且该能力是稳定的，可以引起良好的黏膜免疫反应。各峰值处于预计结果完全相同。收集各峰产物，并进行gm1-elisa检测，确认结合产物中的重组ltb-ctb仍然维持与gm1结合的能力，并且该能力是稳定的，可以引起良好的黏膜免疫反应。3.1.4活体检验将连接成功的结合物进行小鼠活体感染，取连接成功的结合物对小鼠进行腹腔注射及滴鼻给药，选择6～8周健康balb/c小鼠进行试验，每组5只。第一组给药重组ltb-ctb载体蛋白肺炎球菌多糖结合物，第二组给药市售7价肺炎球菌疫苗(商品名：沛儿)，第三组给药pbs作为阴性空白对照。腹腔免疫给药三次，每周免疫一次，给药量均为每只0.2ml(含15μg重组载体蛋白肺炎球菌多糖结合物)，第三组腹腔注射pbs每只0.2ml。鼻腔粘膜给药时，用1.5％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，至小鼠不再活动后，将药物用无菌枪头逐滴滴入实验组小鼠鼻腔，每只30μl(含15μg重组载体蛋白肺炎球菌多糖结合物)，每周免疫一次，连续免疫三周。第三组每次小鼠鼻腔滴注pbs30μl，连续三周。末次免疫后一周进行采样。取样时收集血清和呼吸道黏液。取血清检测各组小鼠血清igg抗体水平，取小鼠鼻腔灌洗液稀释后检测iga抗体水平。血清的制备：采集小鼠眼眶血，血液收集后置于37℃静置2h后，以3000r/min离心l0min，吸取血清低温保存，备检。呼吸道粘液制备：灌水冲洗小鼠鼻腔。收集冲洗液，然后用4倍的pbs稀释，低温保存，备检。采用间接elisa法对血清中igg抗体及黏膜中iga抗体进行检测，检测结果如图4及图5所示。具体方法如下：采用纯化后7种各血清型多糖，分别以适宜剂量包被酶标板，37℃孵育过夜，洗板后加入系列稀释的待测小鼠血清，37℃孵育后洗板，加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠igg二抗显色，酶标仪测定，读取492nm(630nm为参比波长)吸光度值(a值)。阴性对照组血清a均值+3倍的标准偏差为cutoff值，待测血清a值大于cutoff值判为阳性，以a值大于cutoff值的最大稀释度计算各型别小鼠的几何平均滴度，即为小鼠血清igg抗体效价(如表1所示)。缀合疫苗蛋白原液和市售7价阳性对照多糖疫苗免疫小鼠后均产生了高低度的血清抗体，且缀合疫苗蛋白原液产生的滴度更高，说明蛋白抗原具有协同促进免疫的功能。表17价肺炎球菌各血清型抗体滴度检测(几何平均值)(1：)结合产物igg市售疫苗igg阴性对照igg4型多糖158321786406b型多糖160291875409v型多糖1895719801014型多糖1200315642018c型多糖1442116788019f型多糖1578816835023f型多糖14358165230由表1及图4图5可知，重组ltb-ctb载体蛋白本身不具有霍乱弧菌或大肠杆菌的毒性，基本无法引起免疫反应，连接了肺炎球菌荚膜多糖的重组抗原蛋白与使用重组载体蛋白的肺炎球菌联合疫苗相比，具有更强的血清抗体滴度，免疫反应的引发时间短、免疫效果好，免疫反应的持续时间长，并且可以成功的刺激黏膜免疫，激活黏膜特异性抗体。黏膜iga的含量检测结果说明重组后的蛋白不仅作为良好的抗原载体起到进入活体后引发免疫反应，更能够在黏膜系统内引发黏膜免疫，定向增强了局部区域的免疫效果。3.1.5稳定性检测修饰后的肺炎球菌联合疫苗在4℃12个月或37℃保存4周，外观检查和鉴别试验未见异常，ph值和抗原含量保持相对稳定，进行小鼠试验也未发现抗体水平发生明显差异。说明使用重组载体蛋白的肺炎球菌联合疫苗在4℃12个月或37℃保存4周的稳定性良好。最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。序列表<110>武汉博沃生物科技有限公司<120>使用重组载体蛋白的肺炎球菌联合疫苗<130>2017<160>10<170>patentinversion3.5<210>1<211>375<212>dna<213>unknown<220><223>ltbdna序列<400>1atgaataaagtaaaatgttatgttttatttacggcgttactatcctctctatatgcacac60ggagctccccagactattacagaactatgttcggaatatcgcaacacacaaatatatacg120ataaatgacaagatactatcatatacggaatcgatggcaggcaaaagagaaatggttatc180attacatttaagagcggcgaaacatttcaggtcgaagtcccgggcagtcaacatatagac240tcccagaaaaaagccattgaaaggatgaaggacacattaagaatcacatatctgaccgag300accaaaattgataaattatgtgtatggaataataaaacccccaattcaattgcggcaatc360agtatgaaaaactag375<210>2<211>124<212>protein<213>unknown<220><223>ltb氨基酸序列<400>2mnkvkcyvlftallsslyahgapqtitelcseyrntqiytindkilsytesmagkremvi60itfksgetfqvevpgsqhidsqkkaiermkdtlrityltetkidklcvwnnktpnsiaai120smkn124<210>3<211>375<212>dna<213>unknown<220><223>ctbdna序列<400>3atgattaaattaaaatttggtgttttttttacagttttactatcttcagcatatgcaaat60ggaacacctcaaaatattactgatttgtgtgcagaataccacaacacacaaatacatacg120ctaaatgataagatattttcgtatacagaatctctagctggaaaaagagagatggctatc180attacttttaagaatggtgcaacttttcaagtagaagtaccaggtagtcaacatatagat240tcacaaaaaaaagcgattgaaaggatgaaggataccctgaggattgcatatcttactgaa300gctaaagtcgaaaagttatgtgtatggaataataaaacgcctcatgcgattgccgcaatt360agtatggcaaattaa375<210>4<211>124<212>protein<213>unknown<220><223>ctb氨基酸序列<400>4miklkfgvfftvllssayangtpqnitdlcaeyhntqihtlndkifsyteslagkremai60itfkngatfqvevpgsqhidsqkkaiermkdtlriaylteakveklcvwnnktphaiaai120sman124<210>5<211>747<212>dna<213>unknown<220><223>ltb-ctbdna<400>5atgaataaagtaaaatgttatgttttatttacggcgttactatcctctctatatgcacac60ggagctccccagactattacagaactatgttcggaatatcgcaacacacaaatatatacg120ataaatgacaagatactatcatatacggaatcgatggcaggcaaaagagaaatggttatc180attacatttaagagcggcgaaacatttcaggtcgaagtcccgggcagtcaacatatagac240tcccagaaaaaagccattgaaaggatgaaggacacattaagaatcacatatctgaccgag300accaaaattgataaattatgtgtatggaataataaaacccccaattcaattgcggcaatc360agtatgaaaaacatgattaaattaaaatttggtgttttttttacagttttactatcttca420gcatatgcaaatggaacacctcaaaatattactgatttgtgtgcagaataccacaacaca480caaatacatacgctaaatgataagatattttcgtatacagaatctctagctggaaaaaga540gagatggctatcattacttttaagaatggtgcaacttttcaagtagaagtaccaggtagt600caacatatagattcacaaaaaaaagcgattgaaaggatgaaggataccctgaggattgca660tatcttactgaagctaaagtcgaaaagttatgtgtatggaataataaaacgcctcatgcg720attgccgcaattagtatggcaaattaa747<210>6<211>248<212>protein<213>unknown<220><223>ltb-ctb氨基酸序列<400>6mnkvkcyvlftallsslyahgapqtitelcseyrntqiytindkilsytesmagkremvi60itfksgetfqvevpgsqhidsqkkaiermkdtlrityltetkidklcvwnnktpnsiaai120smknmiklkfgvfftvllssayangtpqnitdlcaeyhntqihtlndkifsyteslagkr180emaiitfkngatfqvevpgsqhidsqkkaiermkdtlriaylteakveklcvwnnktpha240iaaisman248<210>7<211>47<212>dna<213>unknown<220><223>ltb-fwd引物序列<400>7cgggatccatgaataaagtaaaatgttatgttttatttacggcgtta47<210>8<211>36<212>dna<213>unknown<220><223>ltb-rev引物序列<400>8ctagggtctccatgtttttcatactgattgccgcaa36<210>9<211>52<212>dna<213>unknown<220><223>ctb-fwd引物序列<400>9ctagggtctcaacatgattaaattaaaatttggtgttttttttacagtttta52<210>10<211>34<212>dna<213>unknown<220><223>ctb-rev引物序列<400>10ccctcgagttaatttgccatactaattgcggcaa34当前第1页12当前第1页12