埃博拉病毒的小分子抑制剂的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及埃博拉病毒的小分子抑制剂。

背景技术

埃博拉病毒是引起人类和灵长类动物埃博拉出血热的烈性病毒。具有高度感染性，并可引起致死性埃博拉病毒病(evd)，症状包括恶心、呕吐、腹泻、肤色改变、全身酸痛、体内出血、体外出血、发烧等。2014年埃博拉在西非爆发，发病率高致死率高。截至2016年3月30日，有28646人患病，死亡11323人(http://apps.who.int/ebola/ebola-situation-reports)。

目前世界上没有特异性的治疗药物或疫苗通过审批。现在主要的研究方向是研发抗病毒小分子，反义技术和单克隆抗体鸡尾酒疗法(如zmapp)。广谱病毒抑制剂在应对新生病毒时表现出明显的缺陷，新发现的抗病毒药物有安全性低，在人体中作用有待确定等缺陷(1)。

天然产物化合物库具有很大的潜力，所以从天然产物化合物库中筛选原本用于治疗其他疾病的药物，研究其抑制埃博拉病毒作用有重大意义。由于应用埃博拉活病毒的操作需要在bsl-4实验室中进行，限制了抗病毒药物的研究进展。急需安全的替代方法进行药物筛选研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种埃博拉病毒的小分子抑制剂及其应用。

在本发明的第一方面，提供了维甲酸或其药学上可接受的盐在制备试剂或药物中的用途，所述试剂或药物用于抑制病毒。

在另一优选例中，所述维甲酸选自下组：9-顺式维甲酸、13-顺式维甲酸、全反式维甲酸、或其组合。

在另一优选例中，所述病毒为埃博拉病毒；和/或呼吸道合胞病毒。

在另一优选例中，所述试剂或药物用于抑制埃博拉病毒。

在另一优选例中，所述试剂或药物用于抑制呼吸道合胞病毒。

在另一优选例中，所述试剂或药物还用于抑制埃博拉病毒进入细胞。

在本发明的第二方面，提供了一种病毒抑制剂，所述抑制剂中包含维甲酸。

在另一优选例中，所述维甲酸选自下组：9-顺式维甲酸、13-顺式维甲酸、全反式维甲酸、或其组合。

在另一优选例中，所述病毒为埃博拉病毒和/或呼吸道合胞病毒。

在另一优选例中，所述病毒抑制剂为埃博拉病毒抑制剂。

在另一优选例中，所述病毒抑制剂为呼吸道合胞病毒抑制剂。

在另一优选例中，所述病毒为埃博拉病毒，所述抑制剂包括维甲酸。

在另一优选例中，所述埃博拉病毒抑制剂还包括选自下组的一种或多种化合物：9-顺式维甲酸、13-顺式维甲酸、全反式维甲酸。

在本发明的第三方面，提供了一种体外非治疗目的的抑制埃博拉病毒进入细胞的方法，所述方法包括步骤：向所述细胞的培养液中添加维甲酸。

在另一优选例中，所述维甲酸选自下组：9-顺式维甲酸、13-顺式维甲酸、全反式维甲酸、或其组合。

在另一优选例中，所述细胞为bsrt7/5细胞。

在另一优选例中，所述方法中添加的维甲酸的浓度为约0.78125μm-100μm。

在另一优选例中，向所述细胞的培养液中添加9-顺式维甲酸；添加浓度为约0.78125μm-100μm，较佳地，约2.5μm-50μm，更佳地，约6.25μm-25μm。

在另一优选例中，向所述细胞的培养液中添加13-顺式维甲酸；添加浓度为约0.78125μm-100μm，较佳地，约2.5μm-50μm，更佳地，约6.25μm-25μm。

在另一优选例中，向所述细胞的培养液中添加全反式维甲酸；添加浓度为约0.78125μm-100μm，较佳地，约2.5μm-50μm，更佳地，约6.25μm-25μm。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为根据graphpadprism作的一个双荧光检测doseresponse抑制效果图，圆点代表不同浓度化合物对细胞的毒性影响，方块点代表不同药物浓度对minigenome抑制的的程度。

图2为9-顺式维甲酸对呼吸道合胞病毒minigenome双荧光检测的doseresponse抑制效果图和对埃博拉病毒minigenome双荧光检测doseresponse抑制效果图的对比。

图3为9-顺式维甲酸25um,50um,100um三个浓度对呼吸道合胞病毒效价减少实验的柱状图，黑色柱子表示病毒的滴度，白色代表细胞活性。

图4为13-顺式维甲酸对埃博拉病毒minigenome系统检测的doseresponse抑制效果图。

图5为全反式维甲酸对埃博拉病毒minigenome系统检测的doseresponse抑制效果图。圆点代表不同浓度化合物对细胞的毒性影响，方块点代表不同药物浓度对minigenome抑制的的程度。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种埃博拉病毒的小分子抑制剂，所述抑制剂为维甲酸(例如9-顺式维甲酸、13-顺式维甲酸、全反式维甲酸)。实验结果表明，所述抑制剂能够有效的抑制埃博拉病毒。在此基础上完成了本发明。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

术语

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

埃博拉病毒

埃博拉病毒属于丝状病毒科，病毒感染后表现为埃博拉病毒病，人感染后致死率高达90％。目前已鉴定出埃博拉病毒5个种，扎伊尔型(ebov)、苏丹型(sudv)、莱斯顿型(restv)、塔伊森林型(tafv)和本迪布焦型(bdbv)。其中扎伊尔型和苏丹型导致了反复的埃博拉病毒爆发。埃博拉病毒主要的感染方式是接触病人或是人类尸体(2)。埃博拉病毒吸附在目标细胞后通过大胞饮方式进入细胞。病毒基因组包含一个非节段的负链单链rna分子。基因组大概19kb。从3’到5’排列着np，vp35，vp40，gp，vp30，vp24，l七个蛋白，每种产物均由各自单独的mrna所编码。

病毒转录和基因组复制需要4个病毒蛋白，即np，vp35，vp30和l形成rna聚合酶复合体。由于rna聚合物复合体对于病毒复制是必要的，所以它可以作为病毒抑制剂研究中的靶点(3)。根据这一原理，应用反向遗传学构建埃博拉病毒复制抑制筛选系统。通过添加药物，检测病毒复制的变化。

药物筛选系统

本发明建立并优化了一种基于埃博拉病毒小基因组检测的高通量筛选系统，通过读取荧光值检测药物对聚合酶复合物的作用判断抗病毒作用。

本系统可在bsl-2实验室操作，是基于埃博拉病毒小基因组检测(minigenomeassay)的高通量抑制剂筛选系统。本发明药物筛选系统可用来筛选埃博拉病毒rna合成的抑制剂。应用本系统，筛选了502个天然产物化合物。筛选得到一个特异性抑制埃博拉病毒复制的药物，9-顺式维甲酸(9’cis-retinoicacid)。

维甲酸

通过筛选天然产物化合物库，发现了维甲酸(例如9-顺式维甲酸、13-顺式维甲酸、全反式维甲酸)能够特异性抑制埃博拉病毒复制。

9-顺式维甲酸(9’cis-retinoicacid)是维甲酸的一个亚种；它主要有协同γ-干扰素体外诱导神经母细胞瘤分化、凋亡、生长抑制的作用，在治疗恶性肿瘤，骨髓增生异常等方面有一定疗效。

活性成分

本发明提供了一种埃博拉病毒的小分子抑制剂，其衍生物及其类似物的各种晶型形式、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。

在本发明的一个优选地实施方式中，作为活性成分的根据本发明的小分子抑制剂维甲酸具有式i结构：

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。

药物组合物和施用方法

由于本发明人发现本发明所涉及的化合物维甲酸(如9-顺式维甲酸、13-顺式维甲酸、全反式维甲酸)具有优异的抑制埃博拉病毒进入细胞的作用，因此本发明化合物及其各种晶型，药学上可接受的无机或有机盐，水合物或溶剂合物，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解由埃博拉病毒感染所导致的疾病。

本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有约1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有约10-200mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。

“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为约1～2000mg，优选约20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明的筛选是基于病毒聚合酶复合体小基因组检测，可在bsl-2实验室内安全、高效进行；

(2)本发明所涉及的化合物对细胞的毒性较低，在水相中溶解度较理想，在动物体内或者人体内会有较好的药物耐受性，有希望成为临床试验候选药物。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国sambrook.j等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

材料和方法

细胞，质粒和化合物

bsrt7/5(稳定表达t7rna聚合酶的bhk-21细胞)细胞在含有2％mem氨基酸(aminoacid)，1％l-谷氨酰胺(glutamine)(200mm)和10％灭活胎牛血清(fetalbovineserum)的gmem培养基中培养，每隔一代加入300ul50mg/ml的g418基因选择素，于37oc，5％co2的培养箱中培养。质粒根据genebank中序列(检索号ay354458)由上海捷瑞生物工程公司合成。天然产物化合物库购买自enzo公司。

检测方法

本发明的检测方法是基于重要的病毒功能结构，不涉及感染性病毒材料。本发明人应用反向遗传学构建了小基因组系统(minigenomesystem)。在一个病毒顺式调节序列后用萤火虫荧光素酶基因(fireflyluciferase)替换ebov基因组构建出扎伊尔型埃博拉病毒小基因组(minigenome)。并分别将np，l，vp30和vp35四个基因构建到真核表达载体pcdna3.1(+)中，合成了四个辅助质粒。通过在bsrt7/5(一种稳定表达t7rna聚合酶的bhk-21)细胞中转入4种辅助质粒(np，vp35，vp30，l)重建了rna聚合酶复合体。同时转入的minigenome质粒来检测抑制效果。在转入5种质粒2h后加入药物，24小时后用brightglo检测结果。

高通量筛选药物库

向96孔白板(corningcostar)的每孔中加入50μl含有20000个bsrt7/5细胞的培养基，在37oc，5％co2的培养箱中培养24h。用opti-mem培养基清洗两遍后，在每孔中用lipofectamine2000转入小基因组(minigenome)(25ng)，np(25ng)，vp35(25ng)，vp30(15ng)，l(150ng)5种质粒，转染2h。每孔分别加入5μl5mg/ml的药物(药物中的dmso终浓度为0.25％)，分别使用转入l质粒和不转入l质粒的实验作为对照，向其中加入5μl5％的dmso。然后加入45μl的培养基，使得最终体积为100μl。培养24小时后，按照试剂盒说明书要求每孔加入50μlbrightglo(promega)试剂，使用veritasmicroplateluminometer(turnerbiosystem)酶标仪进行检测。初筛挑选抑制率大于50％的药物进行进一步验证。

药物毒性实验

在96孔白板中测试69种药物的毒性。每孔铺20000个细胞，第二天用opti-mem清洗两遍后加入95μlopti-mem培养基，每孔加入5μl药物。37oc，5％co2条件下培养24h加入50μlcelltiterglo检测细胞存活率。

双荧光验证实验

在24孔板中每孔铺2×10⁵个bsrt7/5细胞，24h后用lipofectamine2000同时转入含海肾荧光素酶(renillaluciferase)的质粒rl-sv40(5ng)，minigenome(50ng)，np(100ng)，vp35(100ng)，vp30(60ng)，l(600ng)。转染两小时后加入100μm起始的2倍倍比稀释药物。培养24h后，吸去培养基，用pbs清洗两遍后用250μl裂解液裂解细胞。在96孔白板中加入20μl细胞裂解液并分别加入50μldualglo，50μlstopglo并用veritasmicroplateluminometer(turnerbiosystems)检测荧光信号。

呼吸道合胞病毒复制抑制检测

在24孔板中每孔铺2×10⁵个bsrt7/5细胞。第二天吸去上清，pbs清洗两遍，在单层细胞中用lipofectamine2000共转染6种质粒，即200ngn，200ngp，200ngm2-1，100ngl和200ngrsvminigenome和10ngrl-sv40。药物在转染2h后加入药物。转染24h后,移除上清，用pbs清洗两遍后用250μl裂解液裂解。在96孔白板中加入20μl细胞裂解液并分别加入50μldualglo，50μlstopglo并用veritasmicroplateluminometer(turnerbiosystems)检测荧光信号。

呼吸道合胞病毒效价减少实验

在12孔板中每孔铺3×10⁵个hep-2细胞。第二天加入3×10⁴个rsv-a病毒，同时加入10ul稀释好的化合物，42小时后收取上清液，冻在-80℃冰箱中。用免疫染色的方法对每孔收的病毒测定滴度。化合物对hep-2细胞的毒性试验是在96孔板中加入50ul体积的20,000个hep-2细胞，24小时后加入5ul稀释好的化合物和45ul培养基，42小时后加入50ulcelltiterglo检测细胞存活率。

数据分析

把原始数据输入到excel表格中计算信背比(s/b)，信噪比(s/n)，z因子(z-factor)及抑制率。计算公式如下：s/b＝μl/μb，μl表示添加l质粒组信号的平均值，μb表示未添加l质粒组信号的平均值，s/n＝(μl–μb)/(σl–σb),σl表示添加l质粒组信号的标准差，σb表示未添加l质粒组信号的标准差，z＝1-((3σl+3σb)/|μl–μb|),z因子在0.5与1之间表示实验方法能够有效的区分对照组之间的差异。添加药物后抑制率＝1-(μcpd–μb)/(μl–μb)×100％，μcpd表示添加药物后的平均信号强度，化合物对细胞的作用细胞存活率＝μcpd/μm×100％。μm表示仅添加0.25％dmso细胞的平均信号强度。μcpd表示添加药物后的平均信号强度。半数最大效应浓度(ec50)是指能引起50％最大效应的浓度。半数细胞毒性浓度(cc50)是指引起50％细胞毒性反应的药物浓度，在此实验中表示为实验组比对照组荧光强度降低50％。ec50和cc50是用prism软件计算的，每个化合物的选择性指数(si)＝cc50/ec50。

实施例1筛选条件的优化

筛选过程在96孔白板中进行。在培养16-24小时的bsrt7/5细胞中，用opti-mem清洗两遍后，转入50μlebolaminigenome，np，vp35，vp30，l5种质粒混合物，转染2h。通过比较，在96孔板中每孔铺20000个bsrt7/5细胞，转入minigenome(25ng)，np(25ng)，vp35(25ng)，vp30(15ng)，l(150ng)5种质粒效果最好，会获得最大的信背比(s/b)和较好的z-因子(z-factor)。选择以上条件对天然产物化合物库进行筛选。为保证药物不影响转染作用，在转染2小时后加入5μl药物，所有药物浓度为5mg/ml。用不转入l质粒的实验作为对照组，加入5μl5％dmso。最后每孔加入45μl培养基，使得每孔总体积为100μl。在37℃5％co2条件下培养24h，按说明加入brightglo读取荧光值。筛选结果得到信背比(s/b)平均值为28.23，z-因子(z-factor)平均值为0.69。

实施例29-顺式维甲酸抑制埃博拉病毒复制

通过筛选天然产物化合物库，首次筛选得到了69个抑制率在50％以上的药物。通过进一步检测这些药物的毒性，筛选出5个毒性小于10％，抑制率大于80％的药物，检测率为0.99％。通过进一步验证，用转染海肾荧光素酶的质粒rl-sv40在24孔板中进行双荧光检测。验证结果发现9-顺式维甲酸抑制埃博拉病毒复制。在去除细胞毒性影响后，浓度为25um时抑制率达到94％，ec50是8.18um，结果见图1。

实施例39-顺式维甲酸抑制呼吸道合胞病毒复制

本发明人在呼吸道合胞病毒(rsv)小基因组检测系统中双荧光检测这个药物，发现9-顺式维甲酸对于呼吸道合胞病毒(rsv)的复制有抑制作用，ec50是24.34um。然后我们在呼吸道合胞病毒活病毒中做了病毒效价减少实验，证实了9-顺式维甲酸对呼吸道合胞病毒有抑制作用。结果见图2和图3。

实施例49-顺式维甲酸结构类似物抑制埃博拉病毒复制

本发明人测试了9-顺式维甲酸的两个结构类似物13-顺式维甲酸和全反式维甲酸对埃博拉病毒复制的抑制作用。同样的我们用埃博拉病毒的minigenome系统测试了这两个化合物，结果显示两个都有抑制作用。结果见图4和图5。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献

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