本发明属于生物医药领域，尤其是涉及一种应用于肝癌化疗联合给药的肝靶向ph敏感性纳米粒子给药系统及其制备方法。
背景技术：
肝癌是世界范围内癌症死亡率很高的常见肿瘤，据2012年全球癌症统计(globecancerstactics)报告显示：全世界2012年肝癌新发肝癌74.8万人，在所有癌症发病率中位列第六位；当年死亡69.5万人，位于肺癌，胃癌之后，居第三位。在我国，其发病率位居所有恶性肿瘤的第四位，死亡率高居第二位，严重威胁我国人民健康和生命，且肝癌的发病率和死亡率呈逐年增加趋势。
抗肿瘤药物的“化疗”法在肝癌的治疗中占有重要的地位，但多数抗肿瘤药物存在水溶性差、半衰期短、药物全身分布和副作用大等缺陷。阿霉素是临床常用的蒽环类抗恶性肿瘤药物，其作用机理主要是该品嵌入dna而抑制核酸的合成。阿霉素抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，但其有严重的心脏毒性和骨髓抑制毒性。紫杉醇是从红豆杉属植物中提取出来的一种具有高效抗肿瘤活性的天然物质，可通过促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂。紫杉醇在水中的溶解性差，临床应用的主要是紫杉醇/聚氧乙烯蓖麻油注射剂（taxol©制剂），但研究显示聚氧乙烯蓖麻油在体内促使大量组织胺释放，造成严重过敏反应、肾毒性及神经毒性等毒副反应。
纳米粒子给药系统是用各种不同材料制备得到的纳米粒子包载化疗药物，可以显著提高化疗药物的水溶性，延长药物的体内半衰期，增加肿瘤组织中的药物分布，同时减小对其他组织器官的毒性。
天然多糖具有良好的生物相容性和生物可降解性，对人体无毒无刺激，廉价易得。疏水改性的天然多糖在水中发生自聚集，亲水性多糖分散在纳米粒子表面，它们不易与血液和组织成分发生作用，起到稳定作用；疏水性分子倾向于分布纳米粒内核中，提供疏水空腔，可包载疏水性化疗药物。疏水改性的天然多糖载药纳米粒子具有分散性好、载药量高以及制备方法简单等优点，使其在纳米给药系统方面具有极大发展潜力。壳聚糖是自然界中大量存在的唯一一种碱性多糖，具有优良的生物相容性，生物可降解性，已在食品、医疗、生物技术和药学等领域得到了广泛的应用。
而在纳米粒子表面修饰上一定量的靶向配体，通过靶向配体与癌细胞表面受体的特异性结合，实现主动靶向给药，又可提高治疗效率。去唾液酸糖蛋白受体(asgpr)是肝细胞特异性表达的受体，且是一种高效的内吞型受体，以半乳糖、半乳糖胺、n-乙酰半乳糖胺等为靶向基团的纳米粒子可与asgpr特异性结合，可用于肝靶向给药。
纳米粒子作为药物载体材料方面研究已经取得了很大突破，但仍然存在一些问题，如载药纳米粒子随血液循环过程中包载的药物容易泄漏，而到达肿瘤组织后，载药纳米粒子初期释药量不够而降低了治疗效果。近些年，环境敏感性给药系统的研究取得了飞速发展，特别是具有ph敏感性纳米给药系统，可有效解决这些问题。人体正常体液环境以及细胞浆的ph值在7.4左右，肿瘤组织的ph值略低，大约在6.5-7.2，而细胞内涵体和溶酶体的ph值更低，大约在4-6.8。因此，可以利用人体内不同环境ph的变化来设计ph敏感性载药纳米粒子，降低载药纳米粒子在传输过程中的药物泄露；而载药纳米粒子到达肿瘤组织、进入肿瘤细胞后，将包载的抗癌药物大量释放，这将有助于降低药物副作用、提高药物利用率，增强抑瘤作用。calderón等通过腙键将阿霉素偶联在具有纳米结构的树枝状大分子末端，其具有很好的酸敏感性，在ph7.4的释放介质中，阿霉素总释放量低于5%，而在ph4.0的释放介质中，阿霉素总释放量可达到80%，说明以腙键将阿霉素偶联在聚合物胶束上可使载药胶束释药具有ph敏感性。
为提高肿瘤的治疗效果，临床上可采用两种或两种以上化疗药物联合的化疗方案。将两种不同抗癌机制的化疗药物同时递送到肿瘤细胞，可降低两种化疗药物的用药剂量，又可有效增加治疗效率。
迄今，以具有ph敏感性的阿霉素修饰壳聚糖为载体材料，包载具有肝靶向性的紫杉醇前药，形成的纳米粒子给药系统尚未见相关文献报道。
技术实现要素：
本发明设计了一种应用于肝癌化疗联合给药的肝靶向ph敏感性纳米粒子给药系统及其制备方法，其解决了目前多数抗肿瘤药物存在的水溶性差、半衰期短、药物全身分布和副作用大等缺陷，同时本发明设计的纳米粒子给药系统原料廉价易得、制备方法简单易重复、易于大规模生产，能够大大提高肝癌的靶向治疗效率。
为了解决上述存在的技术问题，本发明采用了以下方案：
一种应用于肝癌化疗联合给药的肝靶向ph敏感性纳米粒子给药系统，其特征在于：其是用具有ph敏感性的阿霉素修饰壳聚糖包载肝靶向性紫杉醇前药制成；其中，按照质量分数计，所述的具有ph敏感性的阿霉素修饰壳聚糖中载有药物阿霉素的量为5%～20%，所述的肝靶向性紫杉醇前药中载有药物紫杉醇的量为2%～20％；所述的应用于肝癌化疗联合给药的肝靶向ph敏感性纳米粒子给药系统粒径为100nm～350nm。
进一步，所述的ph敏感性的阿霉素修饰壳聚糖的结构式如下：
进一步，所述的肝靶向性紫杉醇前药的结构式如下：
一种应用于肝癌化疗联合给药的肝靶向ph敏感性纳米粒子给药系统的制备方法，其特特征在于包含以下步骤：
步骤一、ph敏感性阿霉素修饰壳聚糖的制备
将壳聚糖和对羧基苯肼溶解在1%醋酸溶液中，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的等摩尔比混合物为催化剂，室温反应24h～72h，对水透析，冻干;将得到的冻干产品溶于二甲基亚砜，加入阿霉素，避光，室温反应24h～72h，对水透析，冻干，得到具有ph敏感性的阿霉素修饰壳聚糖，得到产品记为dox-cts;
步骤二、具有肝靶向性紫杉醇前药制备
将紫杉醇和琥珀酸酐溶于二氯甲烷，加入吡啶，室温反应24h～72h，旋干，柱纯化，得到产品记为ptx-cooh；
将一端为羧基、另一端为叔丁氧基羰基保护氨基的聚乙二醇（记为hooc-peg-nh-boc）和4-氨基苯基β-d-吡喃半乳糖苷溶于水中，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的等摩尔比混合物为催化剂，室温反应24h～72h，对水透析，冻干；将得到的冻干产品溶于n，n-二甲基甲酰胺，加入三氟乙酸，室温反应24h～48h，对水透析，冻干，得到产品记为gal-peg-nh2；
将ptx-cooh和gal-peg-nh2溶于乙酸乙酯，以n,n'-二环己基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的等摩尔比混合物为催化剂，室温反应24h～72h，过滤除去沉淀，对水透析，冻干，得到具有肝靶向性的紫杉醇前药，产品记为gal-peg-ptx;
其中，步骤一和步骤二的先后顺序可以进行置换；
步骤三、肝靶向ph敏感性纳米粒子的制备
将gal-peg-ptx溶于n，n-二甲基甲酰胺，再滴加到dox-cts的水溶液中，充分搅拌，超声处理0.5h-2h之后，对水透析3～7天，每天换水4次，冻干得到纳米粒子，产品记为gal-peg-ptx/dox-ctsnps。
进一步，所述步骤一中的壳聚糖的浓度为0.5mg/ml-5mg/ml，分子量为2000～100000，脱乙酰度为80%～100%；
所述步骤一中的壳聚糖结构单元与对羧基苯肼的摩尔比为1:0.1～0.4；
所述步骤一中的壳聚糖结构单元与阿霉素的摩尔比为1:0.05～0.3；
所述步骤一中的壳聚糖结构单元与催化剂的摩尔比为1:1～1.2。
进一步，所述步骤二中的紫杉醇的浓度为5mg/ml～30mg/ml；
所述步骤二中的紫杉醇和琥珀酸酐的摩尔比为1:1～5；
所述步骤二中的紫杉醇和吡啶的摩尔比为1:5～20。
进一步，所述步骤二中的hooc-peg-nh-boc的浓度为1mg/ml～5mg/ml；
所述步骤二中的hooc-peg-nh-boc和4-氨基苯基β-d-吡喃半乳糖苷的摩尔比为1:2～5；
所述步骤二中的hooc-peg-nh-boc与催化剂的摩尔比为1:1～1.2。
进一步，所述步骤二中的gal-peg-nh2的浓度为1mg/ml～5mg/ml；
所述步骤二中的gal-peg-nh2与ptx-cooh的摩尔比为1:2～5；
所述步骤二中的gal-peg-nh2与催化剂的摩尔比为1:1～1.2。
进一步，所述步骤三中的dox-cts的浓度为0.5～5mg/ml；
所述步骤三中的gal-peg-ptx的浓度为1～5mg/ml。
进一步，所述步骤三中所述的超声处理步骤中，设定反应仪器的状态为：的功率60w、温度4℃～7℃、脉冲开2s停2s。
该应用于肝癌化疗联合给药的肝靶向ph敏感性纳米粒子给药系统及其制备方法具有以下有益效果：
（1）本发明应用于肝癌化疗联合给药的肝靶向ph敏感性纳米粒子给药系统及其制备方法中gal-peg-ptx/dox-ctsnps在药物输送过程中（ph=7.4），可稳定存在，能够有效降低药物泄露。
（2）本发明应用于肝癌化疗联合给药的肝靶向ph敏感性纳米粒子给药系统及其制备方法中到达肿瘤组织后，gal-peg-ptx/dox-ctsnps可通过半乳糖受体介导的内吞方式进入肝癌细胞，在内涵体/溶酶体较低ph环境下（ph=4-6），腙键断裂，纳米粒解体，dox与cts在水中质子化均为电正性，静电排斥，加速药物释放、提高药物释放量。
（3）本发明应用于肝癌化疗联合给药的肝靶向ph敏感性纳米粒子给药系统及其制备方法中为加强对肝癌细胞的杀伤，包载了与dox抗癌机制不同的化疗药物ptx，本发明并不是简单包载疏水性小分子ptx，而是包载了gal-peg-ptx，亲水性gal-peg的引入不但可以起到肝靶向作用，也可以进一步提高纳米粒子的生物相容性，另外，在纳米粒子传输过程中，peg可与cts有一定的缠绕，则可降低ptx的药物泄露。
（4）本发明应用于肝癌化疗联合给药的肝靶向ph敏感性纳米粒子给药系统及其制备方法中制备的纳米粒子原料廉价易得、制备方法简单易重复、易于大规模加工生产，能够大大增强肝癌的靶向治疗效果，具有良好的应用前景。
本发明应用于肝癌化疗联合给药的肝靶向ph敏感性纳米粒子给药系统及其制备方法是以具有ph敏感性的阿霉素修饰壳聚糖为载体材料，包载具有肝靶向性的紫杉醇前药，提供一种同时包载两种不同抗癌机制化疗药物阿霉素和紫杉醇、且具有肝靶向性和ph敏感性的纳米粒子给药系统及其制备方法，此种纳米粒子在药物输送过程中可有效降低药物泄露，到达肿瘤组织，纳米粒子可通过半乳糖受体介导的内吞方式进入肝癌细胞，在内涵体/溶酶体较低ph环境下，腙键断裂，纳米粒解体，将两种化疗药物同时释放出来，达到联合给药治疗肝癌的目的。
具体实施方式
本发明公开了一种应用于肝癌化疗联合给药的肝靶向ph敏感性纳米粒子给药系统及其制备方法，下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明：
实施例1
步骤一、ph敏感性阿霉素修饰壳聚糖的制备
将壳聚糖和对羧基苯肼溶解在1%醋酸溶液中，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的等摩尔比混合物为催化剂，室温反应24h～72h，对水透析，冻干;将得到的冻干产品溶于二甲基亚砜，加入阿霉素，避光，室温反应24h～72h，对水透析，冻干，得到具有ph敏感性的阿霉素修饰壳聚糖，得到产品记为dox-cts;其中，壳聚糖的浓度为0.5mg/ml，质量为50mg，分子量为2000～100000，脱乙酰度为80%～100%；壳聚糖结构单元与对羧基苯肼的摩尔比为1:0.1；壳聚糖结构单元与阿霉素的摩尔比为1:0.05；壳聚糖结构单元与催化剂的摩尔比为1:1。
步骤二、具有肝靶向性紫杉醇前药制备
将紫杉醇和琥珀酸酐溶于二氯甲烷，加入吡啶，室温反应24h～72h，旋干，柱纯化，得到产品记为ptx-cooh；其中，紫杉醇的浓度为5mg/ml，质量为100mg；紫杉醇和琥珀酸酐的摩尔比为1:1；紫杉醇和吡啶的摩尔比为1:5。
将一端为羧基、另一端为叔丁氧基羰基保护氨基的聚乙二醇（记为hooc-peg-nh-boc）和4-氨基苯基β-d-吡喃半乳糖苷溶于水中，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的等摩尔比混合物为催化剂，室温反应24h～72h，对水透析，冻干；将得到的冻干产品溶于n，n-二甲基甲酰胺，加入三氟乙酸，室温反应24h～48h，对水透析，冻干，得到产品记为gal-peg-nh2；其中，hooc-peg-nh-boc的浓度为1mg/ml，质量为200mg；hooc-peg-nh-boc和4-氨基苯基β-d-吡喃半乳糖苷的摩尔比为1:2；hooc-peg-nh-boc与催化剂的摩尔比为1:1。
将ptx-cooh和gal-peg-nh2溶于乙酸乙酯，以n,n'-二环己基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的等摩尔比混合物为催化剂，室温反应24h～72h，过滤除去沉淀，对水透析，冻干，得到具有肝靶向性的紫杉醇前药，产品记为gal-peg-ptx;其中，gal-peg-nh2的浓度为1mg/ml，质量为50mg；gal-peg-nh2与ptx-cooh的摩尔比为1:2；gal-peg-nh2与催化剂的摩尔比为1:1。
步骤三、肝靶向ph敏感性纳米粒子的制备
将gal-peg-ptx溶于n，n-二甲基甲酰胺，再滴加到dox-cts的水溶液中，充分搅拌，超声处理0.5h-2h之后，对水透析3～7天，每天换水4次，冻干得到纳米粒子，产品记为gal-peg-ptx/dox-ctsnps。其中，dox-cts的浓度为0.5mg/ml；gal-peg-ptx的浓度为1mg/ml。
利用透射电镜（tem,philips,em400st）观察本发明得到的产物gal-peg-ptx/dox-ctsnps，再将记为gal-peg-ptx/dox-ctsnps的产物通过激光粒度仪（brookhaveninstrumentscorporation,holtsville,ny,usa）进行表征，得到的粒径分布范围为100nm～350nm。
实施例2
步骤一、ph敏感性阿霉素修饰壳聚糖的制备
将壳聚糖和对羧基苯肼溶解在1%醋酸溶液中，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的等摩尔比混合物为催化剂，室温反应24h～72h，对水透析，冻干;将得到的冻干产品溶于二甲基亚砜，加入阿霉素，避光，室温反应24h～72h，对水透析，冻干，得到具有ph敏感性的阿霉素修饰壳聚糖，得到产品记为dox-cts;其中，壳聚糖的浓度为2mg/ml，质量为100mg，分子量为2000～100000，脱乙酰度为80%～100%；壳聚糖结构单元与对羧基苯肼的摩尔比为1:0.2；壳聚糖结构单元与阿霉素的摩尔比为1:0.1；壳聚糖结构单元与催化剂的摩尔比为1:1.1。
步骤二、具有肝靶向性紫杉醇前药制备
将紫杉醇和琥珀酸酐溶于二氯甲烷，加入吡啶，室温反应24h～72h，旋干，柱纯化，得到产品记为ptx-cooh；紫杉醇的浓度为10mg/ml；，质量为200mg紫杉醇和琥珀酸酐的摩尔比为1:2；紫杉醇和吡啶的摩尔比为1:10。
将一端为羧基、另一端为叔丁氧基羰基保护氨基的聚乙二醇（记为hooc-peg-nh-boc）和4-氨基苯基β-d-吡喃半乳糖苷溶于水中，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的等摩尔比混合物为催化剂，室温反应24h～72h，对水透析，冻干；将得到的冻干产品溶于n，n-二甲基甲酰胺，加入三氟乙酸，室温反应24h～48h，对水透析，冻干，得到产品记为gal-peg-nh2；其中，hooc-peg-nh-boc的浓度为2mg/ml，质量为400mg；hooc-peg-nh-boc和4-氨基苯基β-d-吡喃半乳糖苷的摩尔比为1:3；hooc-peg-nh-boc与催化剂的摩尔比为1:1.1。
将ptx-cooh和gal-peg-nh2溶于乙酸乙酯，以n,n'-二环己基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的等摩尔比混合物为催化剂，室温反应24h～72h，过滤除去沉淀，对水透析，冻干，得到具有肝靶向性的紫杉醇前药，产品记为gal-peg-ptx;其中，gal-peg-nh2的浓度为2mg/ml，质量为100mg；gal-peg-nh2与ptx-cooh的摩尔比为1:3；gal-peg-nh2与催化剂的摩尔比为1:1.1。
步骤三、肝靶向ph敏感性纳米粒子的制备
将gal-peg-ptx溶于n，n-二甲基甲酰胺，再滴加到dox-cts的水溶液中，充分搅拌，超声处理0.5h-2h之后，对水透析3～7天，每天换水4次，冻干得到纳米粒子，产品记为gal-peg-ptx/dox-ctsnps。其中，dox-cts的浓度为2mg/ml；gal-peg-ptx的浓度为2mg/ml。
利用透射电镜（tem,philips,em400st）观察本发明得到的产物gal-peg-ptx/dox-ctsnps，再将记为gal-peg-ptx/dox-ctsnps的产物通过激光粒度仪（brookhaveninstrumentscorporation,holtsville,ny,usa）进行表征，得到的粒径分布范围为100nm～350nm。
实施例3
步骤一、ph敏感性阿霉素修饰壳聚糖的制备
将壳聚糖和对羧基苯肼溶解在1%醋酸溶液中，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的等摩尔比混合物为催化剂，室温反应24h～72h，对水透析，冻干;将得到的冻干产品溶于二甲基亚砜，加入阿霉素，避光，室温反应24h～72h，对水透析，冻干，得到具有ph敏感性的阿霉素修饰壳聚糖，得到产品记为dox-cts;其中，壳聚糖的浓度为2mg/ml，质量为200mg，分子量为2000～100000，脱乙酰度为80%～100%；壳聚糖结构单元与对羧基苯肼的摩尔比为1:0.3；壳聚糖结构单元与阿霉素的摩尔比为1:0.2；壳聚糖结构单元与催化剂的摩尔比为1:1.2。
步骤二、具有肝靶向性紫杉醇前药制备
将紫杉醇和琥珀酸酐溶于二氯甲烷，加入吡啶，室温反应24h～72h，旋干，柱纯化，得到产品记为ptx-cooh；紫杉醇的浓度为20mg/ml，质量为400mg；紫杉醇和琥珀酸酐的摩尔比为1:4；紫杉醇和吡啶的摩尔比为1:15。
将一端为羧基、另一端为叔丁氧基羰基保护氨基的聚乙二醇（记为hooc-peg-nh-boc）和4-氨基苯基β-d-吡喃半乳糖苷溶于水中，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的等摩尔比混合物为催化剂，室温反应24h～72h，对水透析，冻干；将得到的冻干产品溶于n，n-二甲基甲酰胺，加入三氟乙酸，室温反应24h～48h，对水透析，冻干，得到产品记为gal-peg-nh2；其中，hooc-peg-nh-boc的浓度为3mg/ml，质量为400mg；hooc-peg-nh-boc和4-氨基苯基β-d-吡喃半乳糖苷的摩尔比为1:4；hooc-peg-nh-boc与催化剂的摩尔比为1:1.2。
将ptx-cooh和gal-peg-nh2溶于乙酸乙酯，以n,n'-二环己基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的等摩尔比混合物为催化剂，室温反应24h～72h，过滤除去沉淀，对水透析，冻干，得到具有肝靶向性的紫杉醇前药，产品记为gal-peg-ptx;其中，gal-peg-nh2的浓度为3mg/ml，质量为150mg；gal-peg-nh2与ptx-cooh的摩尔比为1:4；gal-peg-nh2与催化剂的摩尔比为1：1.2。
步骤三、肝靶向ph敏感性纳米粒子的制备
将gal-peg-ptx溶于n，n-二甲基甲酰胺，再滴加到dox-cts的水溶液中，充分搅拌，超声处理0.5h-2h之后，对水透析3～7天，每天换水4次，冻干得到纳米粒子，产品记为gal-peg-ptx/dox-ctsnps。其中，dox-cts的浓度为4mg/ml；gal-peg-ptx的浓度为3mg/ml。
利用透射电镜（tem,philips,em400st）观察本发明得到的产物gal-peg-ptx/dox-ctsnps，再将记为gal-peg-ptx/dox-ctsnps的产物通过激光粒度仪（brookhaveninstrumentscorporation,holtsville,ny,usa）进行表征，得到的粒径分布范围为100nm～350nm。
实施例4
步骤一、ph敏感性阿霉素修饰壳聚糖的制备
将壳聚糖和对羧基苯肼溶解在1%醋酸溶液中，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的等摩尔比混合物为催化剂，室温反应24h～72h，对水透析，冻干;将得到的冻干产品溶于二甲基亚砜，加入阿霉素，避光，室温反应24h～72h，对水透析，冻干，得到具有ph敏感性的阿霉素修饰壳聚糖，得到产品记为dox-cts;其中，壳聚糖的浓度为5mg/ml，质量为300mg，分子量为2000～100000，脱乙酰度为80%～100%；壳聚糖结构单元与对羧基苯肼的摩尔比为1:0.4；壳聚糖结构单元与阿霉素的摩尔比为1:0.3；壳聚糖结构单元与催化剂的摩尔比为1:1.2。
步骤二、具有肝靶向性紫杉醇前药制备
将紫杉醇和琥珀酸酐溶于二氯甲烷，加入吡啶，室温反应24h～72h，旋干，柱纯化，得到产品记为ptx-cooh；紫杉醇的浓度为30mg/ml，质量为400mg；紫杉醇和琥珀酸酐的摩尔比为1:5；紫杉醇和吡啶的摩尔比为1:20。
将一端为羧基、另一端为叔丁氧基羰基保护氨基的聚乙二醇（记为hooc-peg-nh-boc）和4-氨基苯基β-d-吡喃半乳糖苷溶于水中，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的等摩尔比混合物为催化剂，室温反应24h～72h，对水透析，冻干；将得到的冻干产品溶于n，n-二甲基甲酰胺，加入三氟乙酸，室温反应24h～48h，对水透析，冻干，得到产品记为gal-peg-nh2；其中，hooc-peg-nh-boc的浓度为5mg/ml，质量为400mg；hooc-peg-nh-boc和4-氨基苯基β-d-吡喃半乳糖苷的摩尔比为1:5；hooc-peg-nh-boc与催化剂的摩尔比为1:1.2。
将ptx-cooh和gal-peg-nh2溶于乙酸乙酯，以n,n'-二环己基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的等摩尔比混合物为催化剂，室温反应24h～72h，过滤除去沉淀，对水透析，冻干，得到具有肝靶向性的紫杉醇前药，产品记为gal-peg-ptx;其中，gal-peg-nh2的浓度为5mg/ml，质量为200mg；gal-peg-nh2与ptx-cooh的摩尔比为1:5；gal-peg-nh2与催化剂的摩尔比为1:1.2。
步骤三、肝靶向ph敏感性纳米粒子的制备
将gal-peg-ptx溶于n，n-二甲基甲酰胺，再滴加到dox-cts的水溶液中，充分搅拌，超声处理0.5h-2h之后，对水透析3～7天，每天换水4次，冻干得到纳米粒子，产品记为gal-peg-ptx/dox-ctsnps。其中，dox-cts的浓度为5mg/ml；gal-peg-ptx的浓度为5mg/ml。
利用透射电镜（tem,philips,em400st）观察本发明得到的产物gal-peg-ptx/dox-ctsnps，再将记为gal-peg-ptx/dox-ctsnps的产物通过激光粒度仪（brookhaveninstrumentscorporation,holtsville,ny,usa）进行表征，得到的粒径分布范围为100nm～350nm。
本发明应用于肝癌化疗联合给药的肝靶向ph敏感性纳米粒子给药系统及其制备方法的作用原理是：
利用具有ph敏感性的腙键将疏水性抗癌药物阿霉素偶联在壳聚糖上，制备出具有ph敏感性的阿霉素修饰壳聚糖；另外，将聚乙二醇一端修饰上具有肝靶向性的亲水性小分子半乳糖，另一端利用易水解断裂的脂键偶联疏水性抗癌药物紫杉醇，制备具有肝靶向性的紫杉醇前药。阿霉素修饰壳聚糖在水中可自聚集形成纳米粒子，疏水空腔可以包载肝靶向性紫杉醇前药中的疏水端紫杉醇，而亲水链段半乳糖化聚乙二醇可以伸展到纳米粒表面，得到具有ph敏感性和肝靶向纳米粒子，同时包载了阿霉素和紫杉醇。其提供一种同时包载两种不同抗癌机制化疗药物阿霉素和紫杉醇、且具有肝靶向性和ph敏感性的纳米粒子给药系统及其制备方法，此种纳米粒子在药物输送过程中可有效降低药物泄露，到达肿瘤组织，纳米粒子可通过半乳糖受体介导的内吞方式进入肝癌细胞，在内涵体/溶酶体较低ph环境下，腙键断裂，纳米粒解体，将两种化疗药物同时释放出来，达到联合给药治疗肝癌的目的。
本发明应用于肝癌化疗联合给药的肝靶向ph敏感性纳米粒子给药系统及其制备方法中制备的纳米粒子原料廉价易得、制备方法简单易重复、易于大规模加工生产，能够大大增强肝癌的靶向治疗效果，具有良好的应用前景。
上面结合具体实施例对本发明进行了示例性的描述，显然本发明的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围内。