卡巴他塞‑生物素偶联复合物在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及卡巴他塞-生物素偶联复合物(biotin-cabazitaxel)在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

目前，内分泌治疗是前列腺癌的主要方法。对于肿瘤持续发展的患者，标准治疗为激素治疗，即雄激素阻断治疗，可阻断参与前列腺癌生长的睾酮的生成。大多数患者起初对去势或联合雄激素阻断治疗有效，但经过14-30个月后，几乎所有患者都逐渐发展激素难治性前列腺癌(hrpc)。塞诺菲公司的细胞毒性药物多西他塞为hrpc临床一线药物。如今，卡巴他塞的推出使得患者在多西他塞治疗失败后多了一种化疗选择。

研究表明，卡巴他塞(cabazitaxel)能够通过与游离的β-微管蛋白结合，阻碍了gtp及一些辅助蛋白因子与β-微管蛋白的结合为位点。β-微管蛋白在缺少gtp和辅助因子时发生动态聚合，破坏了细胞正常的有丝分裂，使细胞分裂停滞在g2/m期，最终导致细胞的凋亡。此外，卡巴他塞还可以通过抑制雄激素受体来发挥其对前列腺癌的治疗作用。

生物素是人和动物新陈代谢中不可或缺的物质，肿瘤细胞需要大量的生物素供给才能满足其生长需要。而且生物素具有体积小，并且与肿瘤细胞表面过度表达受体的亲和力较高的特征，因此可将生物素连载到药物上实现对肿瘤的靶向诊断和治疗。

本发明人发现将卡巴他塞(cabazitaxel)和生物素(biotin)偶联，形成卡巴他塞-生物素偶联复合物(biotin-cabazitaxel)，能够有效抑制前列腺癌细胞的生长，宜进一步研究开发新药。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于研究设计卡巴他塞-生物素偶联复合物(biotin-cabazitaxel)在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明提供了卡巴他塞-生物素偶联复合物(biotin-cabazitaxel)在制备抗肿瘤药物中的应用。

卡巴他塞-生物素偶联复合物(biotin-cabazitaxel)的结构式如下：

本发明所述卡巴他塞-生物素偶联复合物(biotin-cabazitaxel)是通过下列方法制备得到的：

将14.5mmol卡巴他塞(cabazitaxel)、44.1mmol氨基聚乙二醇异氰酸酯(nh2-peg-nco),10ml无水二氯甲烷(ch2cl2)加入50ml干燥的三口瓶中，室温搅拌，并向体系中缓慢滴加2ml无水三乙胺，30min后待体系恢复到室温后，加热使体系维持在40-50℃左右，继续搅拌3h,过滤得固体沉淀，以乙二醇单甲醚重结晶，得到产物卡巴他塞-聚乙二醇复合物(npeg-cabazitaxel)。

将卡巴他塞-聚乙二醇复合物(cabazitaxel-npeg)溶解于二甲亚砜(dmso)中；将生物素(biotin)用(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化，按摩尔比1：30的比例，将活化好的生物素(biotin)和卡巴他塞-聚乙二醇复合物混合，4℃搅拌24小时，取出透析除盐，过分子筛，收集终产物得到卡巴他塞-生物素偶联复合物(biotin-peg-cabazitaxel)。

本发明的另一目的是提供以卡巴他塞-生物素偶联复合物为活性成分，用于制备抗肿瘤的药物，尤其用于制备治疗转移性激素难治性前列腺癌的药物。

本发明将卡巴他塞-生物素偶联复合物进行动物药效试验，结果显示卡巴他塞-生物素偶联复合物主要可抑制转移性激素难治性前列腺癌细胞生长。因此，卡巴他塞-生物素偶联复合物可用于制备治疗转移性激素难治性前列腺癌的药物。

本发明所述卡巴他塞-生物素偶联复合物在制备治疗转移性激素难治性前列腺癌的药物为由卡巴他塞-生物素偶联复合物作为活性成分与药学上可接受的载体制成的药物组合物，其中药物组合物的单剂量含活性成分卡巴他塞-生物素偶联复合物为1mg-5mg，当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是医师技能范围之内的。

所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等；填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如明胶、聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如碳酸钙、碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、聚乙二醇等、另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特殊限制，所述药物组合物可以是片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂等，各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。

附图说明

图1不同浓度卡巴他塞和卡巴他塞-生物素偶联复合物对pc-3细胞的作用；

图中1：空白对照组、2：卡巴他塞低剂量组、3：卡巴他塞中剂量组、4：卡巴他塞高剂量组、5：卡巴他塞-生物素偶联复合物低剂量组、6：卡巴他塞-生物素偶联复合物中剂量组、7：卡巴他塞-生物素偶联复合物高剂量组

图2卡巴他塞和卡巴他塞-生物素偶联复合物的体外抑制肿瘤实验

图中1：模型组、2：卡巴他塞-生物素偶联复合物高剂量组、3：卡巴他塞-生物素偶联复合物中剂量组、4：卡巴他塞-生物素偶联复合物低剂量组、5：卡巴他塞高剂量组、6：卡巴他塞中剂量组、7：卡巴他塞低剂量组

具体实施方式

本发明公开了一种卡巴他塞-生物素偶联复合物在制备抗肿瘤药物中的应用，下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1卡巴他塞-生物素偶联复合物的制备

将14.5mmol卡巴他塞(cabazitaxel)、44.1mmol氨基聚乙二醇异氰酸酯(nh2-peg-nco),10ml无水二氯甲烷(ch2cl2)加入50ml干燥的三口瓶中，室温搅拌，并向体系中缓慢滴加2ml无水三乙胺，30min后待体系恢复到室温后，加热使体系维持在40-50℃左右，继续搅拌3h,过滤得固体沉淀，以乙二醇单甲醚重结晶，得到产物卡巴他塞-聚乙二醇复合物(npeg-cabazitaxel)。

将卡巴他塞-聚乙二醇复合物(cabazitaxel-npeg)溶解于二甲亚砜(dmso)中；将生物素(biotin)用(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化，按摩尔比1：30的比例，将活化好的生物素(biotin)和卡巴他塞-聚乙二醇复合物混合，4℃搅拌24小时，取出透析除盐，过分子筛，收集终产物得到卡巴他塞-生物素偶联复合物(biotin-peg-cabazitaxel)。

实施例2卡巴他塞-生物素偶联复合物对前列腺癌pc-3细胞株的作用

前列腺癌pc-3细胞株(购自上海细胞生物学研究所)种板后，加入不同浓度的卡巴他塞(购自aventis公司)以及对应浓度的卡巴他塞-生物素偶联复合物，mtt检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率。

实验分组和实验方案：

空白对照组：rpmi1640培养液(含100ml/l的胎牛血清)

卡巴他塞组：卡巴他塞(cabazitaxel)3、10、30nmol/l

偶联组：卡巴他塞-生物素偶联复合物3、10、30nmol/l

将前列腺癌pc-3细胞消化收集，按每孔5×10³个细胞接种于96孔培养板(购自美国corning公司)，置于37℃，5％co2培养箱中培养24h。待细胞贴壁后，每孔进行换液。吸除原培养液后，卡巴他塞组分别加入不同浓度的卡巴他塞(cabazitaxel)、偶联组加入对应不同浓度的卡巴他塞-生物素偶联复合物，另设空白对照组，每组4个复孔，将96孔板移入co2培养箱静置培养。24h后加5mg/mlmtt溶液(购自sigma-aldrich)20μl/孔，移入37℃培养箱中继续培养4h后，吸弃孔内上清液。每孔加150μldmso(购自美国sigma公司)，振荡10min，酶标仪(购自塞默飞世尔公司)测570nmod值，计算细胞抑制率。

实验结果：

1)mtt检测

偶联组细胞吸光度明显低于对照组。与卡巴他塞组比较，偶联细胞od值明显低于卡巴他塞组，说明偶联组细胞生长收到抑制。

2)流式检测

偶联组细胞凋亡峰明显升高；偶联组细胞凋亡率明显高于对照组。与卡巴他塞组相比，偶联组细胞s期所占的比例明显降低，而其他各组的变化不明显。说明偶联组生物素抑制细胞生长，并可能发生凋亡。

实施例3：卡巴他塞及卡巴他塞-生物素偶联复合物的裸鼠体内抑制肿瘤实验

卡巴他塞是一种较强的抗微管抑制剂，卡巴他塞链接上生物素后，抗肿瘤效果得到提高。本实验通过动物模型来研究卡巴他塞-生物素偶联复合物对前列腺癌的抑制效果。

实验分组和实验方案：

人前列腺癌pc-3细胞株使用含10％胎牛血清的1640培养基，在5％co2、37℃培养箱中培养至对数生长期后，在无菌操作台上吸去培养基，pbs(购自hyclone，ge)清洗培养瓶两次，加入0.25％胰蛋白酶1ml，消化2-3min后，用完全培养基(含10％胎牛血清)1ml终止消化2min，用10mlpbs吹打贴壁细胞，充分重悬细胞并收集于15ml离心管中(1500rpm，离心5min)，加入pbs再重悬细胞沉淀，于倒置显微镜下计数，并观察细胞活力大于95％。用pbs调整细胞浓度为1×10⁷个/ml，置于离心管内，送至spf级超净室内。用75％酒精擦拭裸鼠右前肢腋窝消毒，用1ml注射器于裸鼠右侧腋窝皮下接种0.2ml/只(约2×10⁷个细胞)。接种后每天观察肿瘤生长状况及裸鼠一般活动状况及营养状态。

实验裸鼠(购于广东省动物实验中心)在spf级超净室内适应环境3天后，皮下移植接种pc-3细胞，待移植瘤大小约3mm³时将裸鼠随机分成3组(每组6只)，即模型组，卡巴他塞组，偶联组。

模型组：灭菌生理盐水0.2ml/次，隔日腹腔注射一次，共15次

卡巴他塞组：卡巴他塞注射液溶剂腹腔注射5、10、20mg/kg，0.2ml/次，3d注射一次，共10次

偶联组：卡巴他塞-生物素注射液溶剂腹腔注射5、10、20mg/kg，0.2ml/次，3d注射一次，共10次

用药期间每周测量裸鼠的体重及肿瘤体积大小并记录。经卡巴他塞处理30d后，处死裸鼠，完整摘除肿瘤组织，用电子天枰称取瘤重，计算各组的肿瘤生长抑制率。

实验结果：

裸鼠接种前列腺癌pc-3细胞约8天后，均在皮下接种位置出现呈圆形或椭圆形的小包块，直径约为0.15-0.25cm，18只裸鼠均成瘤，成瘤率100％。随机分组后，卡巴他塞组和偶联组给药4周后，裸鼠均无死亡情况。比较两组裸鼠情况，卡巴他塞组裸鼠略显消瘦，活动状况较差。而偶联组裸鼠肿瘤体积及肿瘤重量均较卡巴他塞组明显下降。